本發(fā)明屬于遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一種非定向交尾凡納濱對蝦全同胞家系批量制備方法。

背景技術(shù)：

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei,又稱南美白對蝦)是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)，在中國漁業(yè)經(jīng)濟中占有較大的比重。然而，我國凡納濱對蝦優(yōu)質(zhì)親蝦長期依賴進口，嚴重制約了我國對蝦產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定、快速發(fā)展。因此，加強凡納濱對蝦遺傳育種研究將有助于我國對蝦產(chǎn)業(yè)快速健康發(fā)展，意義重大。

全同胞家系的制備是遺傳育種研究領(lǐng)域中最重要的一個環(huán)節(jié)。全同胞家系子代個體全部來自于同一個父母本，具有遺傳背景干凈的優(yōu)勢，有利于不同性狀分子標(biāo)記的篩選，在良種選育、分子標(biāo)記輔助育種、分子標(biāo)記開發(fā)的工作中必不可少。

然而，現(xiàn)有的凡納濱對蝦全同胞家系制備方法仍存在一定的技術(shù)缺陷?，F(xiàn)有的非定向交配方法：一般都采用標(biāo)記物對親蝦進行標(biāo)記，如在親蝦某個部位套上可識別的標(biāo)識物，親蝦交配時便記下標(biāo)識物，以便確定親本，但這一方法有時無法確定父本，母蝦會跟多條公蝦進行交尾，不能確定哪條公蝦的精莢成功打入了母蝦的納精囊中?，F(xiàn)有的定向交配的方法：一般是在同一水體中放入1條或多條公蝦與1條母蝦配比，由于不能保證特定的組合是否成功交配，這一方法通常需要準(zhǔn)備較多的組合才能得到較少的全同胞家系個數(shù)，再加上水體的追逐空間有限，經(jīng)常會出現(xiàn)精莢打歪或精莢脫落等不利因素。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠批量制備全同胞家系的方法，即非定向交尾凡納濱對蝦全同胞家系批量制備方法。

本發(fā)明的非定向交尾凡納濱對蝦全同胞家系批量制備方法，包括以下步驟：

a、親本選擇：選擇雄蝦20g以上，雌蝦30g以上的健康個體作為親本；

b、親本處理：去除雌蝦一側(cè)眼柄，雄蝦不去除眼柄，將所有雌蝦與雄蝦個體的一側(cè)胡須靠近根部剪下，剪下的胡須分別單獨保存；

c、親蝦飼養(yǎng)：將步驟b的雌蝦和雄蝦分別在雌蝦池和雄蝦池中飼養(yǎng)；

d、親蝦交配：在上午(7-11時)，將步驟c中的性腺飽滿的雌蝦放入雄蝦池，使之自由追逐、交配；

e、雌蝦挑選：當(dāng)晚18時至21時，全部撈出雄蝦池中的雌蝦進行逐個檢查，將雌蝦納精囊中具有飽滿精莢的雌蝦放在單獨的水體中產(chǎn)卵，微充氣；將納精囊中沒有精莢或精莢位置偏離納精囊的雌蝦全部放回雌蝦池中(經(jīng)過交尾但納精囊中無精莢的雌蝦仍會產(chǎn)出未受精卵，按照步驟c中的方法飼養(yǎng)一周以上后，性腺重新發(fā)育飽滿)；

f、產(chǎn)卵處理：發(fā)現(xiàn)雌蝦產(chǎn)卵后立即撈出，將產(chǎn)卵后的雌蝦另一側(cè)胡須剪下分別單獨保存，將產(chǎn)卵后雌蝦納精囊中剩余的精莢液氮保存，處理完后將雌蝦放回雌蝦池中(按照步驟(3)飼養(yǎng)一周以上后，性腺會重新發(fā)育飽滿)；

g、親本追溯：提取所有親本胡須的DNA，提取產(chǎn)卵雌蝦胡須DNA作為母本DNA；提取產(chǎn)卵后雌蝦納精囊中的剩余精莢DNA作為父本DNA；利用多態(tài)性豐富、擴增產(chǎn)物穩(wěn)定的微衛(wèi)星引物進行親權(quán)鑒定，確定父母本，具體可參照中國授權(quán)發(fā)明專利“進行凡納濱對蝦家系鑒定的多重微衛(wèi)星鑒定體系及應(yīng)用ZL201310340730.1”中所述的方法進行；

h、家系培育：對確定父本和母本來源的卵進行培育，得到全同胞家系。

優(yōu)選，所述的親蝦飼養(yǎng)是選取活體新鮮餌料，每隔6-8小時投喂1次，投喂量以每次投喂兩小時后池底仍有少量剩余為宜；

優(yōu)選，所述的家系培育是對確定父本和母本來源的卵，自母蝦產(chǎn)卵后，水體中均勻布置氣室進行微充氣，產(chǎn)卵后第三天開始加入角毛藻液，保持水體藻類密度在4.5萬個/ml以上，每天加入1-3ppm的酵母粉，虹吸法排水；待發(fā)育到仔蝦后，投喂蝦片和配合飼料，即得到全同胞家系。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明針對現(xiàn)有的凡納濱對蝦家系制備技術(shù)的缺陷，設(shè)計通過非定向交尾、剪取對蝦胡須組織提取DNA、取產(chǎn)卵后雌蝦納精囊中的剩余精莢作為父本來源的依據(jù)等方法，利用目前較為成熟的微衛(wèi)星親子鑒定技術(shù)確定父母本個體，制備出全同胞家系。本發(fā)明的方法采用非定向隨機交配效率高與微衛(wèi)星親子鑒定準(zhǔn)確率高相結(jié)合的方法，彌補了現(xiàn)有凡納濱對蝦家系制備技術(shù)的不足，將有利于凡納濱對蝦遺傳育種工作的進行。

附圖說明：

圖1是產(chǎn)卵后精莢的圖。

具體實施方式：

以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

實施例1：

1、親本選擇：一般選取體重20g以上(雄蝦20g以上，雌蝦30g以上)的健康個體作為后備親本，親本逐個識別，第一對游泳足具有開叉結(jié)構(gòu)或具有精莢的個體為雄蝦，無分叉結(jié)構(gòu)、無精莢或有明顯卵巢的個體為雌蝦，雌雄分開飼養(yǎng)。

2、親本處理：用燒紅的鑷子或剪刀將雌蝦一側(cè)眼柄絞掉或剪掉，雄蝦不剪眼柄；將所有雌蝦與雄蝦個體的一側(cè)胡須靠近根部剪下，每個個體的胡須在95％酒精-20℃中單獨保存，試管編號管理，雌蝦在雌蝦池中飼養(yǎng)，雄蝦在雄蝦池中飼養(yǎng)。

3、親蝦飼養(yǎng)：選取活體新鮮餌料，每隔6-8小時投喂1次，投喂量以每次投喂兩小時后池底仍有少量剩余為宜；雌蝦按照投喂3次青蟲后投喂1次紅蟲的方法進行投喂，雄蝦按照投喂2次青蟲、1次生蠔肉、1次魷魚、1次紅蟲的次數(shù)比例進行投喂。

4、親蝦交配：在上午(7-11時)將性腺飽滿的雌蝦小心放入雄蝦池中，使之自由追逐、交配。

5、雌蝦挑選：當(dāng)晚18時至21時，全部撈出雄蝦池中的雌蝦進行逐個檢查；將雌蝦納精囊中具有飽滿精莢的雌蝦放在單獨的水體中產(chǎn)卵，微充氣；將納精囊中沒有精莢或精莢位置偏離納精囊的雌蝦全部放回雌蝦池中(經(jīng)過交尾但納精囊中無精莢的雌蝦仍會產(chǎn)出未受精卵，按照步驟3中的方法飼養(yǎng)一周以上后，性腺重新發(fā)育飽滿)。

6、產(chǎn)卵處理：每隔半小時檢查雌蝦是否產(chǎn)卵；發(fā)現(xiàn)雌蝦產(chǎn)卵后立即撈出(產(chǎn)卵后精莢會自動脫落，防止雌蝦將殘余精莢攝食干凈)，將產(chǎn)卵后的雌蝦另一側(cè)胡須剪下95％酒精-20℃中保存，將產(chǎn)卵后雌蝦納精囊中剩余的精莢液氮保存，試管編號管理，處理完后將雌蝦放回雌蝦池中(按照步驟3飼養(yǎng)一周以上后，性腺會重新發(fā)育飽滿)。產(chǎn)卵后精莢如圖1所示。

7、親本追溯：提取所有親本胡須的DNA，-80℃保存；提取產(chǎn)卵雌蝦胡須DNA作為母本DNA；提取產(chǎn)卵后雌蝦納精囊中的剩余精莢DNA作為父本DNA；利用多態(tài)性豐富、擴增產(chǎn)物穩(wěn)定的微衛(wèi)星引物進行親權(quán)鑒定，確定父母本，具體可參照中國授權(quán)發(fā)明專利“進行凡納濱對蝦家系鑒定的多重微衛(wèi)星鑒定體系及應(yīng)用ZL201310340730.1”中所述的方法進行。

8、家系培育：對確定父本和母本來源的卵，自母蝦產(chǎn)卵后，水體中均勻布置氣室進行微充氣；產(chǎn)卵后第三天開始加入角毛藻液，保持水體藻類密度在4.5萬個/ml以上，每天加入1-3ppm的酵母粉，虹吸法排水；待發(fā)育到仔蝦后，投喂蝦片和配合飼料，即得到全同胞家系。具體培育方法可參照中國發(fā)明專利“一種凡納濱對蝦小水體育苗方法ZL201410076358.2”中所述的方法進行。