本發(fā)明涉及煙草遺傳性與品種選育領(lǐng)域，特別是涉及煙草富鉀篩選和鑒定方法。

背景技術(shù)：

鉀是煙草最重要的品質(zhì)元素之一，其與煙葉成熟度、燃燒性、香吃味和卷煙制品安全性密切相關(guān)。與國(guó)外煙葉鉀含量(＞3％)相比，中國(guó)大部分地區(qū)尤其是北方地區(qū)，煙葉平均鉀含量很少超過(guò)1.5％，煙葉鉀含量偏低是制約中國(guó)煙葉質(zhì)量提升的關(guān)鍵指標(biāo)之一。生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)煙葉必須施用形成最適產(chǎn)量需鉀量的2～3倍的鉀肥，才能明顯提高煙葉鉀含量，但我國(guó)鉀肥資源匱乏，通過(guò)改善農(nóng)藝操作來(lái)提高鉀含量又有一定的限度，因此篩選或選育烤煙鉀高效基因型品種，充分利用土壤以及施用的鉀素，對(duì)提高煙葉鉀含量、降低生產(chǎn)成本、節(jié)約資源有重要意義。

目前，國(guó)際煙草育種領(lǐng)域內(nèi)無(wú)培育富鉀煙草品種的方法，也沒(méi)有選育出富鉀煙草品種。為了提高煙葉鉀含量一般采用以下兩種方法：

1、常規(guī)雜交篩選法：首先對(duì)雜交所用親本進(jìn)行雜交組合的雜種優(yōu)勢(shì)、配合力和遺傳力分析，然后選用具有不同鉀吸收效率的煙草親本進(jìn)行雜交，一株一株的測(cè)定雜交后代的煙葉鉀含量，從中篩選出煙葉鉀含量較高的變異植株。但是常規(guī)雜交篩選法必須在煙葉收獲后進(jìn)行大量檢測(cè)才知結(jié)果，因此，盲目性大，工作量大。

2、轉(zhuǎn)基因法：利用基因工程技術(shù)把一些鉀高效基因轉(zhuǎn)入到其他植株內(nèi)并誘導(dǎo)其表達(dá)，可以快速并高效的獲得鉀高效植物，但現(xiàn)在國(guó)際上限制煙草轉(zhuǎn)基因用于生產(chǎn)，故該技術(shù)不能利用。并且，在轉(zhuǎn)基因法中，鉀積累的遺傳特性受多基因控制，具有數(shù)量遺傳特征，且受環(huán)境條件影響較大。如果單純地測(cè)定與鉀吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因，可能得不到富鉀煙草變異類型，即一些測(cè)試結(jié)果與大田試驗(yàn)結(jié)果并不一致，這就是目前富鉀煙草培育不出來(lái)的主要原因。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種煙草富鉀篩選和鑒定方法，該方法省時(shí)省力、操作性強(qiáng)，大大提高富鉀煙草品種的篩選效率。

為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種煙草富鉀篩選和鑒定方法，包括以下步驟：1)將煙草種子播種至低鉀培養(yǎng)基上進(jìn)行育苗，依據(jù)煙苗對(duì)低鉀反應(yīng)的程度，將煙苗劃分等級(jí)，篩選出變黃程度高且有活性的植株移植至完全營(yíng)養(yǎng)液上生長(zhǎng)；2)將所選植株移栽至大田，追施鉀肥，于成熟期對(duì)所選植株上相同葉位的煙葉殺青、烘干、磨碎、過(guò)篩，測(cè)定鉀含量，標(biāo)記鉀含量高的所述植株；3)收獲鉀含量高的所述植株的種子，通過(guò)重復(fù)所述步驟1)、所述步驟2)種植篩選，直至基因型純合，選育出富鉀煙草品種。

優(yōu)選地，所述煙草富鉀篩選和鑒定方法還包括對(duì)所述煙草種子的選取及消毒的步驟，具體過(guò)程為：選取飽滿一致的煙草種子；將所述煙草種子置于45-55℃溫水浸泡2-3h；然后采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70-80％的CH₃CH₂OH水溶液處理30-40s，再采用無(wú)菌水沖洗4-7次，然后使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9-11％次氯酸水溶液處理25-35min，再采用無(wú)菌水沖洗4-7次。

優(yōu)選地，在所述步驟1)中，所述低鉀培養(yǎng)基的鉀濃度為0.10-0.17mmoL/L。一般來(lái)講，煙草種子育苗選用的培養(yǎng)基的完全營(yíng)養(yǎng)液的鉀濃度為5.5-6.5mmoL/L，而本發(fā)明中采用低鉀培養(yǎng)基選用的低鉀營(yíng)養(yǎng)液的鉀濃度控制在0.10-0.17mmoL/L，大大低于完全營(yíng)養(yǎng)液的鉀濃度。

優(yōu)選地，在所述步驟1)中，所述完全營(yíng)養(yǎng)液的鉀濃度為5.5-6.5mmoL/L。

優(yōu)選地，在所述步驟1)中，在所述步驟1)中，依據(jù)煙苗對(duì)低鉀反應(yīng)的程度，將煙苗劃分以下四個(gè)等級(jí)：

一級(jí)：煙葉嚴(yán)重變黃，變黃率可達(dá)到80-100％，植株極度矮化，發(fā)育嚴(yán)重受阻；

二級(jí)：煙葉中度變黃，變黃率可達(dá)到60-80％，植株中度矮化，發(fā)育嚴(yán)重延遲；

三級(jí)：煙葉輕度變黃，變黃率可達(dá)到40-60％，植株稍微矮縮，發(fā)育延遲；

四級(jí)：煙葉略帶黃色，變黃率可達(dá)到10-40％，生長(zhǎng)率仍較正常；

其中，所述植株的煙葉的鉀含量為：一級(jí)＞二級(jí)＞三級(jí)＞四級(jí)。

優(yōu)選地，在所述步驟1)中，需將所述低鉀培養(yǎng)基放入人工氣候室中進(jìn)行育苗，人工氣候室的條件設(shè)置為：白天光照為260-350μmol photons·m^-2·s^-1，夜間光照為0μmol photons·m^-2·s^-1，光暗周期為(14-16)/(10-8)h，晝夜溫度為(27-29)/(24-26)℃，空氣相對(duì)濕度為60％～70％。

在所述步驟2)中，所述追施鉀肥的具體過(guò)程為：在所述步驟2)中，所述追施鉀肥的具體過(guò)程為：于植株移栽至大田后25-55d內(nèi)間隔追施鉀肥三次，每次每株植株各追施的鉀肥以鉀元素重量計(jì)為1.0-1.2g。

優(yōu)選地，所述追施鉀肥的方式為：將所述鉀肥配置成溶液，將溶液穴施于距離所述植株的主莖19-21cm處。

優(yōu)選地，在所述步驟2)中，所述選取各個(gè)植株上相同葉位的煙葉具體過(guò)程為：于植株移栽至大田后80d選取植株的第12葉位的煙葉。

優(yōu)選地，在所述步驟2)中，所述選取各個(gè)植株上相同葉位的煙葉具體過(guò)程為：于植株移栽至大田后110d選取植株的第18葉位的煙葉。

優(yōu)選地，在所述步驟2)中，采用鹽酸浸提-火焰光度法測(cè)定鉀含量。

本發(fā)明還公開(kāi)另一種煙草富鉀篩選和鑒定方法，包括以下步驟：使用低鉀培養(yǎng)基培養(yǎng)煙苗，挑選變黃且有活性的幼苗植株，根據(jù)植株的煙葉變黃程度和植株大小判斷煙草的富鉀基因，其中，煙葉變黃程度最嚴(yán)重和植株大小最矮小的植株為富鉀煙草品種。

優(yōu)選地，根據(jù)植株的煙葉變黃程度和植株大小將植株劃分以下四個(gè)等級(jí)：

一級(jí)：煙葉嚴(yán)重變黃，變黃率可達(dá)到80-100％，植株極度矮化，發(fā)育嚴(yán)重受阻；

二級(jí)：煙葉中度變黃，變黃率可達(dá)到60-80％，植株中度矮化，發(fā)育嚴(yán)重延遲；

三級(jí)：煙葉中度變黃，變黃率可達(dá)到40-60％，植株稍微矮縮，發(fā)育延遲；

四級(jí)：煙葉略帶黃色，變黃率可達(dá)到10-40％，生長(zhǎng)率仍較正常；

其中，所述植株的煙葉的鉀含量為：一級(jí)＞二級(jí)＞三級(jí)＞四級(jí)。

如上所述，本發(fā)明的煙草富鉀篩選和鑒定方法，具有以下有益效果：本發(fā)明通過(guò)溶液培養(yǎng)、盆栽及田間試驗(yàn)比較現(xiàn)有煙草種質(zhì)資源鉀素營(yíng)養(yǎng)特性差異，通過(guò)發(fā)現(xiàn)不耐低鉀煙草突變體比耐低鉀煙草突變體煙葉鉀含量顯著提高，選出鉀高效基因型，本發(fā)明鑒定與鉀吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因在煙葉中的表達(dá)情況，選育和鑒定鉀高效烤煙品種；本發(fā)明利用低鉀培養(yǎng)基篩選富鉀基因型煙草變異體材料的方法，該方法中煙苗植株的生長(zhǎng)環(huán)境一致，決定其表現(xiàn)型的主要是基因型，后期結(jié)合大田試驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確、穩(wěn)定。本發(fā)明比傳統(tǒng)方法更加省時(shí)省力、操作性強(qiáng)，大大提高富鉀煙草品種的篩選效率。

附圖說(shuō)明

圖1顯示為實(shí)施例1中煙草富鉀篩選和鑒定方法的流程示意圖。

圖2顯示為實(shí)施例1中對(duì)煙草種子的選取及消毒的流程示意圖。

圖3顯示為實(shí)施例2中轉(zhuǎn)NHX1煙草株系N7、N9、N10和K326在大田試驗(yàn)中煙葉鉀含量隨葉齡的變化。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書(shū)所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書(shū)中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

實(shí)施例1利用低鉀培養(yǎng)基篩選出的篩選出的不耐低鉀植株的不同等級(jí)及其在大田的表現(xiàn)

選擇“中煙100”的500個(gè)突變體材料為研究對(duì)象。“中煙100”是一個(gè)產(chǎn)量高、耐氮肥的基因型煙草品種，利用低鉀培養(yǎng)基篩選不耐低鉀的植株，移栽入大田試驗(yàn)后，即可得到富鉀煙草變異體，進(jìn)而培育富鉀煙草基因型品種。如圖1所示，“中煙100”煙草富鉀篩選和鑒定的方法具體包括以下步驟：

(1)對(duì)煙草種子的選取及消毒

如圖2所示，對(duì)煙草種子的選取及消毒的流程為：首先選擇飽滿一致的“中煙100”烤煙種子，然后采用50℃溫水浸泡3h；經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)75％的CH₃CH₂OH水溶液處理30s，然后無(wú)菌水反復(fù)沖洗5次；再使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％次氯酸水溶液處理30min，最后采用無(wú)菌水沖洗5次，進(jìn)行催芽露白。

其中，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75％CH₃CH₂OH水溶液處理30s的具體操作方法為：將煙草種子裝入容積為2mL的離心管中，向其中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75％的CH₃CH₂OH水溶液1mL，搖勻，浸泡30s。

再使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的次氯酸水溶液處理30min的具體操作方法為：將煙草種子裝入容積為2mL的離心管中，向離心管中加入次氯酸水溶液，搖勻，浸泡25-35min。由于浸泡時(shí)間較長(zhǎng)，因此在浸泡處理過(guò)程中需數(shù)次搖勻。

(2)低鉀培養(yǎng)基配置及播種培養(yǎng)

(2.1)低鉀培養(yǎng)基的配置所需的原料配比如表1所示。

表1低鉀培養(yǎng)基和完全Hoagland培養(yǎng)液的配置所需的原料配比

注：定容前用0.01mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)液pH為5.5～6.0。

其中，表1中EDTA-Fe溶液由以下方法配置而成：用精度為0.0001g的分析天平，分別稱取3.73g的EDTA-2Na和2.78g的FeSO4·7H2O，依次溶解；用蒸餾水定容到500mL(定容前用0.01mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH到5.5)。

表1中微量元素溶液所需的原料配比如表1.1所示。

表1.1微量元素溶液所需的原料配比

(2.2)將經(jīng)過(guò)嚴(yán)格消毒的種子播種于低鉀培養(yǎng)基上，放入人工氣候室中培養(yǎng)，白天光照為350μmol photons·m^-2·s^-1，夜間光照為0，光暗周期為14/10h，晝夜溫度為28/25℃，空氣相對(duì)濕度為60％～70％。

(3)不耐低鉀煙苗的篩選

培養(yǎng)30天后，挑選變黃且具有活性的幼苗植株，并根據(jù)煙葉變黃程度和植株大小分為以下四個(gè)等級(jí)：

一級(jí)：煙葉嚴(yán)重變黃，變黃率可達(dá)到80-100％，植株極度矮化，發(fā)育嚴(yán)重受阻；

二級(jí)：煙葉中度變黃，變黃率可達(dá)到60-80％，植株中度矮化，發(fā)育嚴(yán)重延遲

三級(jí)：煙葉中度變黃，變黃率可達(dá)到40-60％，植株稍微矮縮，發(fā)育延遲；

四級(jí)：煙葉略帶黃色，變黃率可達(dá)到10-40％，生長(zhǎng)率仍較正常。

測(cè)定這四個(gè)等級(jí)的色素含量結(jié)果見(jiàn)表2，從表2可以看出，四個(gè)等級(jí)的植株的葉綠素a和葉綠素b含量表現(xiàn)一致，均為四級(jí)＞三級(jí)＞二級(jí)＞一級(jí)，差異達(dá)到顯著水平；四個(gè)等級(jí)的植株的類胡蘿卜素含量表現(xiàn)為三級(jí)＞四級(jí)＞一級(jí)＞二級(jí)，差異顯著。

表2不同等級(jí)煙草突變體色素含量

將四個(gè)等級(jí)的植株移栽完全Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行生長(zhǎng)；其中，完全Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的配置所需的原料的配比請(qǐng)參閱表1。

待所選植株有6～8片真葉時(shí)將植株移栽入大田。

(4)大田試驗(yàn)

大田常規(guī)管理，于植株移栽至大田30d、40d和50d后分別追施硫酸鉀肥，每株5g(為常規(guī)施鉀量的2倍)，將硫酸鉀肥配置成溶液穴施于距離主莖20cm處，在植株的圓頂期測(cè)定農(nóng)藝性狀，不同等級(jí)煙草植株的農(nóng)藝性狀如表3所示；在植株的旺長(zhǎng)期測(cè)定根系生理特性，不同等級(jí)煙草植株的根系特性如表4所示；于植株移栽至大田80天后取第12葉位煙葉110℃殺青，80℃烘干，稱重磨碎過(guò)60目篩，采用鹽酸浸提-火焰光度法測(cè)定鉀含量，不同等級(jí)煙草植株的煙葉鉀含量測(cè)試結(jié)果如表5所示，同時(shí)標(biāo)記每個(gè)等級(jí)中鉀含量高的植株。

表3不同等級(jí)煙草植株的農(nóng)藝性狀

表4不同等級(jí)煙草植株的根系特性

表5不同等級(jí)煙草植株的煙葉鉀含量

從表3、表4、表5的結(jié)果可看出，煙草煙葉的鉀含量為：一級(jí)＞二級(jí)＞三級(jí)＞四級(jí)＞中煙100，差異達(dá)到顯著水平。與對(duì)照“中煙100”相比，鉀含量較高的煙草植株在根體積、根干重、根系活力和陽(yáng)離子交換量等根系生理特性上具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但是鉀含量較高的煙草植株呈現(xiàn)更明顯的不耐鉀表征。而不同等級(jí)的煙草植株之間農(nóng)藝性狀有顯著差異，但沒(méi)有統(tǒng)一的趨勢(shì)。

(5)基因純化

按照上述方法所獲得的植株即為富鉀煙草變異體材料，收獲種子后翌年通過(guò)相同的方法種植再選，直至基因型純合，可選育富鉀煙草基因型品種。

實(shí)施例2轉(zhuǎn)NHX1煙草的鉀吸收動(dòng)力學(xué)特性及對(duì)低鉀的響應(yīng)

黑龍江省煙草科學(xué)研究所郭兆奎將酵母NHX1基因轉(zhuǎn)化煙草，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)NHX1煙草與未轉(zhuǎn)化材料煙葉相比，轉(zhuǎn)NHX1煙草的煙葉鉀含量平均增加27.4％，鉀含量最高材料比對(duì)照煙草的鉀含量增加42.3％。

將轉(zhuǎn)NHX1煙草株系N7、N9、N10和K326進(jìn)行對(duì)比測(cè)試，轉(zhuǎn)NHX1煙草株系N7、N9、N10和K326在大田試驗(yàn)中煙葉鉀含量隨葉齡的變化的表現(xiàn)如圖3所示，鉀吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表6所示；后期將轉(zhuǎn)NHX1煙草株系N7、N9、N10和K326移至低鉀的水培條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在水培條件下轉(zhuǎn)NHX1煙草對(duì)低鉀的響應(yīng)情況如表7所示。

表6轉(zhuǎn)NHX1煙草鉀吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表7水培條件下轉(zhuǎn)NHX1煙草對(duì)低鉀的響應(yīng)情況

由圖3可以看出，煙葉鉀含量：N7＞N9＞N10＞K326，并且在移栽至大田10d至50d時(shí)間段，隨著葉齡的增長(zhǎng)，每個(gè)品種煙草的煙葉的鉀含量均呈一定的下降趨勢(shì)，并在移栽至大田50d時(shí)達(dá)到最低峰，但是隨著葉齡的繼續(xù)增長(zhǎng)，每個(gè)品種的煙葉的鉀含量逐漸增加，因此在大田試驗(yàn)中，應(yīng)該選擇移栽至大田大于70d的煙葉進(jìn)行測(cè)試，這樣保證測(cè)試結(jié)果的穩(wěn)定性。

由表6可以看出，鉀吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)中最大吸收效率Vmax：N7＞N9＞N10＞K326，鉀的親和力Km：N7＜N9＜N10＜K326，鉀最低吸收濃度Cmin：N7＞N9＞N10＞K326；結(jié)果表明，煙葉的鉀含量越高，鉀吸收能力越強(qiáng)。

由表7中看出，在低鉀水培條件下煙葉變黃程度：N7＞N9＞N10＞K326，植株大?。篘7≈N9＞K326＞N10。結(jié)果表明，煙葉的鉀含量越高，能吸收鉀素的最低濃度也隨之提高，即煙葉的鉀含量越高煙草表現(xiàn)出越不耐低鉀的表征。當(dāng)鉀素供應(yīng)充足時(shí)，煙草植株大小與煙葉鉀含量沒(méi)有直接的關(guān)系，更不是成正比的關(guān)系。但缺鉀時(shí)則會(huì)顯著影響煙株生長(zhǎng)，進(jìn)而影響植株大小。

實(shí)施例3農(nóng)大202與轉(zhuǎn)NHX1煙草對(duì)低鉀的響應(yīng)

在同一大田栽培和管理?xiàng)l件下，將農(nóng)大202與轉(zhuǎn)NHX1煙草成熟期的中部煙葉進(jìn)行鉀含量比較，比較結(jié)果如表8所示；將兩個(gè)型號(hào)的煙草的種子分別在常鉀和低鉀條件進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)30d后測(cè)試兩個(gè)型號(hào)煙草對(duì)常鉀和低鉀的響應(yīng)情況，響應(yīng)結(jié)果如表9所示。

表8農(nóng)大202與轉(zhuǎn)NHX1中部煙葉的鉀含量比較結(jié)果

表9農(nóng)大202與轉(zhuǎn)NHX1煙草對(duì)常鉀和低鉀的響應(yīng)結(jié)果

從表8可看出，與農(nóng)大202相比，轉(zhuǎn)NHX1煙草的鉀含量更高。從表9可看出，與農(nóng)大202相比，轉(zhuǎn)NHX1煙草在低鉀條件下變黃率更高，植株大小呈極度矮縮，其表現(xiàn)出更不耐低鉀的表征。

綜上所述，本發(fā)明利用低鉀培養(yǎng)基篩選富鉀基因型煙草變異體材料，該篩選過(guò)程中煙草植株的生長(zhǎng)環(huán)境一致，決定其表現(xiàn)型的主要是基因型，后期結(jié)合大田試驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確、穩(wěn)定，比傳統(tǒng)方法更加省時(shí)省力、操作性強(qiáng)，同時(shí)大大提高篩選效率。所以，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點(diǎn)而具高度產(chǎn)業(yè)利用價(jià)值。

上述實(shí)施例僅例示性說(shuō)明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。