本發(fā)明涉及食品安全領(lǐng)域，具體涉及一種通過(guò)紅茶菌消減枸杞中有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱殘留的方法。
背景技術(shù)：
：枸杞是我國(guó)西北地區(qū)的主要栽培經(jīng)濟(jì)植物，是適合于經(jīng)濟(jì)林、水土保持林、生態(tài)林等的多用途樹種。西北地區(qū)因其獨(dú)特的高海拔、強(qiáng)光照的地理特點(diǎn)及土壤和氣候條件，特別適合枸杞生長(zhǎng)，出產(chǎn)的枸杞鮮果玲瓏剔透，紅艷欲滴，狀似紅寶石，色紅粒大，籽少、肉厚、糖分高，大小均勻，品質(zhì)優(yōu)良，頗受市場(chǎng)歡迎。枸杞作為西北地區(qū)特色產(chǎn)業(yè)，發(fā)展日趨壯大。由于西北地區(qū)生態(tài)多樣性較低，病蟲害天敵未能形成強(qiáng)大種群，故隨著種植規(guī)模不斷擴(kuò)大，病蟲害日益增多，農(nóng)藥施用必不可少。農(nóng)藥的實(shí)際利用率往往很低，因?yàn)槟軌蛘嬲糜跉⑾x、殺菌的農(nóng)藥只占所用農(nóng)藥量的10％～20％，而大量過(guò)剩農(nóng)藥則直接落于土壤中，或以微粒形式融于空氣中。因此，枸杞產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留成為食品安全隱患，并直接降低枸杞產(chǎn)品品質(zhì)和枸杞產(chǎn)業(yè)效益。有機(jī)磷農(nóng)藥有品種多、藥效高、應(yīng)用范圍廣、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)是用量最多、范圍最廣的農(nóng)藥，使用量占農(nóng)藥總量的80％～90％。毒死蜱(Chlorpyrifos)是一種高效、廣譜、中等毒性的有機(jī)磷類殺蟲劑，具有良好的觸殺、胃毒和熏蒸作用，廣泛用于防治多種作物上的螟蟲、粘蟲、介殼蟲、蚜蟲、棉鈴蟲、薊馬、葉蟬和螨類等害蟲。隨著高效高毒農(nóng)藥(如甲胺磷、水胺硫磷等)的禁用，毒死蜱逐漸代替高效高毒農(nóng)藥，使用范圍越來(lái)越廣，用量越來(lái)越大，并已成為防治枸杞病蟲害的重要農(nóng)藥。因此，消減毒死蜱在枸杞產(chǎn)品中的殘留對(duì)于提升枸杞品質(zhì)和保障食品安全具有重要意義。微生物降解法以其作用溫和、降解產(chǎn)物對(duì)環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)成為消減農(nóng)藥殘留的有效策略。酯酶由于其底物適應(yīng)的廣泛性，對(duì)有機(jī)磷、有機(jī)氯、菊酯、氨基甲酸酯等類農(nóng)藥均有降解作用。許多微生物均能產(chǎn)生酯酶，將具有產(chǎn)酯酶活性的酵母、醋酸菌和乳酸菌共生培養(yǎng)成微生態(tài)穩(wěn)定的紅茶菌，可望開拓出食品級(jí)安全、降解效率高且能夠持久起作用的農(nóng)藥殘留消減策略。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種通過(guò)紅茶菌消減枸杞中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法，將紅茶菌發(fā)酵液噴施到結(jié)果期的枸杞植株上以及土壤中，發(fā)揮紅茶菌所產(chǎn)酯酶降解有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱殘留的效力。一種通過(guò)紅茶菌消減枸杞中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法，包括以下步驟：1)將SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165分別制成菌懸液；2)將SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌懸液、AcetobacterspCICC20441菌懸液和LactobacillusplantarumCICC23165菌懸液混合加入含蔗糖的茶汁中，靜置培養(yǎng)，形成菌膜后即為紅茶菌發(fā)酵成熟，得到紅茶菌發(fā)酵液；3)有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱施藥后，將紅茶菌發(fā)酵液噴灑到結(jié)果期的枸杞植株上以及土壤中，從而消減枸杞中有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱殘留。本發(fā)明中，SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165三者共生而長(zhǎng)成紅茶菌過(guò)程中，所產(chǎn)酯酶活力持續(xù)增長(zhǎng)，形成菌膜后，紅茶菌發(fā)酵成熟，酯酶持久維持高活力。本發(fā)明中，紅茶菌產(chǎn)生對(duì)人體無(wú)害而對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱具有降解作用的酯酶，能夠消減毒死蜱殘留。步驟1)中，SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165采用現(xiàn)有技術(shù)，來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)酒仙橋中路24號(hào)院6號(hào)樓；菌種保持編號(hào)分別為CICC33068、CICC20441和CICC23165。將SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165分別制成菌懸液，包括：出發(fā)密度均為106～107cfu/mL，接種量均為1％～5％，將SaccharomycescerevisiaeCICC33068接種至YPD液體培養(yǎng)基，將AcetobacterspCICC20441接種至AC液體培養(yǎng)基，將LactobacillusplantarumCICC23165接種至MRS液體培養(yǎng)基，均在33℃～39℃振蕩培養(yǎng)20～28h，至菌液密度為108～109cfu/mL的菌懸液。所述的接種量是指移入種子液的體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。進(jìn)一步優(yōu)選，將SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165分別制成菌懸液，包括：出發(fā)密度均為106～107cfu/mL，接種量均為2％～3％，將SaccharomycescerevisiaeCICC33068接種至YPD液體培養(yǎng)基，將AcetobacterspCICC20441接種至AC液體培養(yǎng)基，將LactobacillusplantarumCICC23165接種至MRS液體培養(yǎng)基，均在33℃～39℃振蕩培養(yǎng)20～28h，至菌液密度為108～109cfu/mL的菌懸液。所述的YPD液體培養(yǎng)基，以1L計(jì)，包括以下組分：該培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至6.5～7.5。所述的AC液體培養(yǎng)基，以1L計(jì)，包括以下組分：該培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至6.4～7.2。所述的MRS培養(yǎng)基，以1L計(jì)，包括以下組分：該培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至6.0～6.6。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的YPD液體培養(yǎng)基，以1L計(jì)，包括以下組分：該培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至6.5～7.5。所述的AC液體培養(yǎng)基，以1L計(jì)，包括以下組分：該培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至6.4～7.2。所述的MRS培養(yǎng)基，以1L計(jì)，包括以下組分：該培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至6.0～6.6。步驟2)中，所述的含蔗糖的茶汁的制備包括：將紅茶茶葉添加到沸水中，煮沸后過(guò)濾，得到茶汁，茶汁中加入蔗糖溶解，滅菌，冷卻后，得到含蔗糖的茶汁。所述的紅茶茶葉的質(zhì)量與沸水的體積之比為0.5g～2g：100mL，進(jìn)一步優(yōu)選，所述的紅茶茶葉的質(zhì)量與沸水的體積之比為1g：100mL，即將紅茶茶葉以1％的濃度添加到沸水中。所述的蔗糖的質(zhì)量與茶汁的體積為30g～80g：1L，所述的蔗糖的質(zhì)量與茶汁的體積為50g：1L，即茶汁中按50g/L的濃度加入蔗糖溶解。將SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌懸液、AcetobacterspCICC20441菌懸液和LactobacillusplantarumCICC23165菌懸液按照體積比1：1：1混合加入含蔗糖的茶汁中。所述的靜置培養(yǎng)為在20～30℃靜置培養(yǎng)10天～20天。所述的SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌懸液與含蔗糖的茶汁的體積比為1～3：100。所述的AcetobacterspCICC20441菌懸液與含蔗糖的茶汁的體積比為1～3：100。所述的LactobacillusplantarumCICC23165菌懸液與含蔗糖的茶汁的體積比為1～3：100。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌懸液與含蔗糖的茶汁的體積比為2：100。所述的AcetobacterspCICC20441菌懸液與含蔗糖的茶汁的體積比為2：100。所述的LactobacillusplantarumCICC23165菌懸液與含蔗糖的茶汁的體積比為2：100。步驟3)中，所述的紅茶菌發(fā)酵液的噴灑量與結(jié)果期的枸杞植株的數(shù)目之比4～6升：9株，所述的結(jié)果期的枸杞植株在土地上的密集程度為7～11株枸杞/16米2土地。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的紅茶菌發(fā)酵液的噴灑量與結(jié)果期的枸杞植株的數(shù)目之比5升：9株，所述的結(jié)果期的枸杞植株在土地上的密集程度為9株枸杞/16米2土地。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明通過(guò)混合培養(yǎng)，使SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165三者共生而長(zhǎng)成微生態(tài)穩(wěn)定的紅茶菌，有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱施藥后，將紅茶菌發(fā)酵液噴灑到結(jié)果期的枸杞植株上以及土壤中，發(fā)酵液中的酯酶發(fā)揮對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱殘留的降解作用，發(fā)酵液中的紅茶菌在枸杞植株和土壤中定殖并繼續(xù)自然發(fā)酵，持久產(chǎn)生酯酶。紅茶菌產(chǎn)生對(duì)人體無(wú)害而對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱具有降解作用的酯酶，能夠消減毒死蜱殘留。具體實(shí)施方式實(shí)施例11)SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165的出發(fā)密度為106～107cfu/mL，分別接種至液體培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖20.0g，水定容至1000mL；該培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至6.5。AC培養(yǎng)基：酵母膏10.0g，葡萄糖10.0g，碳酸鈣20.0g，水定容至1000mL；該培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至6.4。MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，葡萄糖20.0g，乙酸鈉5.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸鎂0.5g，硫酸錳0.2g，吐溫801.0mL，水定容至1000mL；該培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至6.0。)中，接種量為1％，37℃振蕩培養(yǎng)24h，得到菌懸液，菌液密度分別為108～109cfu/mL。SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165采用現(xiàn)有技術(shù)，來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)酒仙橋中路24號(hào)院6號(hào)樓；菌種保持編號(hào)分別為CICC33068、CICC20441和CICC23165。2)將紅茶茶葉以1％的濃度(w/v，即茶葉的質(zhì)量與沸水的體積之比為1g；100mL)添加到沸水中，煮沸5min后八層紗布過(guò)濾，得到茶汁，茶汁中按50g/L的濃度加入蔗糖溶解，121℃滅菌20min，冷卻至室溫25℃后，得到含蔗糖的茶汁，分別按照占茶汁1％(v/v)的比例，同時(shí)接入108～109cfu/mL的SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌懸液、AcetobacterspCICC20441菌懸液和LactobacillusplantarumCICC23165菌懸液，室溫25℃靜置培養(yǎng)10d，三者共生而長(zhǎng)成紅茶菌過(guò)程中，所產(chǎn)酯酶活力持續(xù)增長(zhǎng)，形成菌膜后，紅茶菌發(fā)酵成熟，酯酶持久維持高活力。在枸杞結(jié)果期，有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱施藥后，按照4升/9株枸杞16米2土地的用量噴灑紅茶菌發(fā)酵液，紅茶菌通過(guò)其磷酸酯酶活力降解毒死蜱。紅茶菌在發(fā)酵過(guò)程中，隨著其酯酶活力增長(zhǎng)，降解毒死蜱的效力越大。酯酶活力在土壤中持久留存，意味著紅茶菌在土壤中定殖。3)經(jīng)過(guò)步驟1)和步驟2)的處理后(1d之后)，枸杞和土壤中毒死蜱開始被降解(見表1)。毒死蜱測(cè)定：按照GB/T23200-2008，采用氣相色譜-質(zhì)譜法。酯酶活力測(cè)定：以p-硝基苯月桂酸鹽(p-nitrophenyllaurate，p-NPL)為底物，測(cè)定p-NPL的水解度，以每分鐘水解1μmolp-NPL為1個(gè)酯酶活力單位，具體技術(shù)細(xì)節(jié)參照“Fucinosetal.JBiotechnol,2005,117,233-241.”。表1(試驗(yàn)：紅茶菌噴施；對(duì)照：等量茶汁噴施)毒死蜱濃度(mg/kg)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(試驗(yàn))0.1450.1120.0960.0770.0450.0290.023根周土壤(試驗(yàn))0.2650.2130.1860.1440.0870.0490.028枸杞(對(duì)照)0.1390.1240.1030.0970.0860.0680.055根周土壤(對(duì)照)0.2780.2550.2180.1850.1650.1560.137磷酸酯酶活力(U/g)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(試驗(yàn))36.535.733.837.032.229.831.5根周土壤(試驗(yàn))39.944.346.544.640.939.542.7枸杞(對(duì)照)2.22.52.32.92.72.62.8根周土壤(對(duì)照)6.07.37.07.48.47.87.7試驗(yàn)中，通過(guò)紅茶菌噴施，6天后，枸杞上毒死蜱降解率達(dá)到84.1％，土壤中毒死蜱降解率達(dá)到89.4％，分別比對(duì)照高23.7和38.7個(gè)百分點(diǎn)，說(shuō)明紅茶菌對(duì)毒死蜱降解有明顯促進(jìn)作用。表1還顯示，紅茶菌噴施后，枸杞上和土壤中酯酶活力極顯著地高于對(duì)照且保持穩(wěn)定，說(shuō)明紅茶菌通過(guò)產(chǎn)生酯酶而發(fā)揮對(duì)毒死蜱降解有明顯促進(jìn)作用。實(shí)施例21)SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165的出發(fā)密度為106～107cfu/mL，分別接種至液體培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖20.0g，水定容至1000mL；該培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至7.5。AC培養(yǎng)基：酵母膏10.0g，葡萄糖10.0g，碳酸鈣20.0g，水定容至1000mL；該培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至7.2。MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，葡萄糖20.0g，乙酸鈉5.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸鎂0.5g，硫酸錳0.2g，吐溫801.0mL，水定容至1000mL；該培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至6.6)中，接種量為5％，37℃振蕩培養(yǎng)24h，得到菌懸液，菌液密度分別為108～109cfu/mL。SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165采用現(xiàn)有技術(shù)，來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)酒仙橋中路24號(hào)院6號(hào)樓；菌種保持編號(hào)分別為CICC33068、CICC20441和CICC23165。2)將茶葉以1％的濃度(w/v，即茶葉的質(zhì)量與沸水的體積之比為1g；100mL)添加到沸水中，煮沸5min后八層紗布過(guò)濾，茶汁中按50g/L的濃度加入蔗糖溶解，121℃滅菌20min，冷卻至室溫25℃后，分別按照占茶汁3％(v/v)的比例，同時(shí)接入108～109cfu/mL的SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌懸液、AcetobacterspCICC20441菌懸液和LactobacillusplantarumCICC23165菌懸液，室溫25℃靜置培養(yǎng)10d以上，三者共生而長(zhǎng)成紅茶菌過(guò)程中，所產(chǎn)酯酶活力持續(xù)增長(zhǎng)，形成菌膜后，紅茶菌發(fā)酵成熟，酯酶持久維持高活力。在枸杞結(jié)果期，有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱施藥后，按照6升/9株枸杞16米2土地的用量噴灑紅茶菌發(fā)酵液，紅茶菌通過(guò)其酯酶活力降解毒死蜱。紅茶菌在發(fā)酵過(guò)程中，隨著其酯酶活力增長(zhǎng)，降解毒死蜱的效力越大。酯酶活力在土壤中持久留存，意味著紅茶菌在土壤中定殖。3)經(jīng)過(guò)步驟1)和步驟2)的處理后(1d之后)，枸杞和土壤中毒死蜱開始被降解(見表2)。毒死蜱測(cè)定與酯酶活力測(cè)定同實(shí)施例1。表2(試驗(yàn)：紅茶菌噴施；對(duì)照：等量茶汁噴施)毒死蜱濃度(mg/kg)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(試驗(yàn))0.1560.1210.0950.0820.0560.0300.021根周土壤(試驗(yàn))0.2250.1730.1440.1200.0830.0450.025枸杞(對(duì)照)0.1400.1250.1060.0900.0780.0650.053根周土壤(對(duì)照)0.2680.2400.2060.1760.1590.1450.133磷酸酯酶活力(U/g)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(試驗(yàn))44.545.643.038.333.533.832.5根周土壤(試驗(yàn))42.040.547.739.643.639.342.5枸杞(對(duì)照)3.23.43.94.32.92.92.6根周土壤(對(duì)照)7.57.86.66.46.46.56.8試驗(yàn)中，通過(guò)紅茶菌噴施，6天后，枸杞上毒死蜱降解率達(dá)到86.5％，土壤中毒死蜱降解率達(dá)到88.9％，分別比對(duì)照降低24.4和38.5個(gè)百分點(diǎn)，說(shuō)明紅茶菌對(duì)毒死蜱降解有明顯促進(jìn)作用。表2還顯示，紅茶菌噴施后，枸杞上和土壤中酯酶活力極顯著地高于對(duì)照且保持穩(wěn)定，說(shuō)明紅茶菌通過(guò)產(chǎn)生酯酶而發(fā)揮對(duì)毒死蜱降解有明顯促進(jìn)作用。實(shí)施例31)SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165的出發(fā)密度為106～107cfu/mL，分別接種至液體培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖20.0g，水定容至1000mL；該培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至7.0。AC培養(yǎng)基：酵母膏10.0g，葡萄糖10.0g，碳酸鈣20.0g，水定容至1000mL；該培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至6.8。MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，葡萄糖20.0g，乙酸鈉5.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸鎂0.5g，硫酸錳0.2g，吐溫801.0mL，水定容至1000mL；該培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至6.3)中，接種量為2％，37℃振蕩培養(yǎng)24h，得到菌懸液，菌液密度分別為108～109cfu/mL。SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165采用現(xiàn)有技術(shù)，來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)酒仙橋中路24號(hào)院6號(hào)樓；菌種保持編號(hào)分別為CICC33068、CICC20441和CICC23165。2)將茶葉以1％的濃度(w/v，即茶葉的質(zhì)量與沸水的體積之比為1g；100mL)添加到沸水中，煮沸5min后八層紗布過(guò)濾，茶汁中按50g/L的濃度加入蔗糖溶解，121℃滅菌20min，冷卻至室溫25℃后，分別按照占茶汁2％(v/v)的比例，同時(shí)接入108～109cfu/mL的SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌懸液、AcetobacterspCICC20441菌懸液和LactobacillusplantarumCICC23165菌懸液，室溫25℃靜置培養(yǎng)10d以上，三者共生而長(zhǎng)成紅茶菌過(guò)程中，所產(chǎn)酯酶活力持續(xù)增長(zhǎng)，形成菌膜后，紅茶菌發(fā)酵成熟，酯酶持久維持高活力。在枸杞結(jié)果期，有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱施藥后，按照5升/9株枸杞16米2土地的用量噴灑紅茶菌發(fā)酵液，紅茶菌通過(guò)其酯酶活力降解毒死蜱。紅茶菌在發(fā)酵過(guò)程中，隨著其酯酶活力增長(zhǎng)，降解毒死蜱的效力越大。酯酶活力在土壤中持久留存，意味著紅茶菌在土壤中定殖。3)經(jīng)過(guò)步驟1)和步驟2)的處理后(1d之后)，枸杞和土壤中毒死蜱開始被降解(見表3)。毒死蜱測(cè)定與酯酶活力測(cè)定同實(shí)施例1。表3(試驗(yàn)：紅茶菌噴施；對(duì)照：等量茶汁噴施)毒死蜱濃度(mg/kg)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(試驗(yàn))0.1440.1090.1030.0850.0600.0380.010根周土壤(試驗(yàn))0.2350.1880.1550.1180.0800.0530.015枸杞(對(duì)照)0.1320.1150.0960.0820.0730.0610.059根周土壤(對(duì)照)0.2550.2330.2030.1800.1560.1420.138磷酸酯酶活力(U/g)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(試驗(yàn))34.835.533.038.735.532.537.3根周土壤(試驗(yàn))40.542.244.538.543.043.742.6枸杞(對(duì)照)4.34.04.92.73.33.03.6根周土壤(對(duì)照)6.56.76.97.47.46.57.8試驗(yàn)中，通過(guò)紅茶菌噴施，6天后，枸杞上毒死蜱降解率達(dá)到93.1％，土壤中毒死蜱降解率達(dá)到90.6％，分別比對(duì)照降低27.8和44.7個(gè)百分點(diǎn)，說(shuō)明紅茶菌對(duì)毒死蜱降解有明顯促進(jìn)作用。表3還顯示，紅茶菌噴施后，枸杞上和土壤中酯酶活力極顯著地高于對(duì)照且保持穩(wěn)定，說(shuō)明紅茶菌通過(guò)產(chǎn)生酯酶而發(fā)揮對(duì)毒死蜱降解有明顯促進(jìn)作用。實(shí)施例41)SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165的出發(fā)密度為106～107cfu/mL，分別接種至液體培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖20.0g，水定容至1000mL；該培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至7.0。AC培養(yǎng)基：酵母膏10.0g，葡萄糖10.0g，碳酸鈣20.0g，水定容至1000mL；該培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至6.8。MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，葡萄糖20.0g，乙酸鈉5.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸鎂0.5g，硫酸錳0.2g，吐溫801.0mL，水定容至1000mL；該培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至6.3)中，接種量為3％，37℃振蕩培養(yǎng)24h，得到菌懸液，菌液密度分別為108～109cfu/mL。SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165采用現(xiàn)有技術(shù)，來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)酒仙橋中路24號(hào)院6號(hào)樓；菌種保持編號(hào)分別為CICC33068、CICC20441和CICC23165。2)將茶葉以1％的濃度(w/v，即茶葉的質(zhì)量與沸水的體積之比為1g；100mL)添加到沸水中，煮沸5min后八層紗布過(guò)濾，茶汁中按50g/L的濃度加入蔗糖溶解，121℃滅菌20min，冷卻至室溫25℃后，分別按照占茶汁2％(v/v)的比例，同時(shí)接入108～109cfu/mL的SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌懸液、AcetobacterspCICC20441菌懸液和LactobacillusplantarumCICC23165菌懸液，室溫25℃靜置培養(yǎng)10d以上，三者共生而長(zhǎng)成紅茶菌過(guò)程中，所產(chǎn)酯酶活力持續(xù)增長(zhǎng)，形成菌膜后，紅茶菌發(fā)酵成熟，酯酶持久維持高活力。在枸杞結(jié)果期，有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱施藥后，按照5升/9株枸杞16米2土地的用量噴灑紅茶菌發(fā)酵液，紅茶菌通過(guò)其酯酶活力降解毒死蜱。紅茶菌在發(fā)酵過(guò)程中，隨著其酯酶活力增長(zhǎng)，降解毒死蜱的效力越大。酯酶活力在土壤中持久留存，意味著紅茶菌在土壤中定殖。3)經(jīng)過(guò)步驟1)和步驟2)的處理后(1d之后)，枸杞和土壤中毒死蜱開始被降解(見表4)。毒死蜱測(cè)定與酯酶活力測(cè)定同實(shí)施例1。表4(試驗(yàn)：紅茶菌噴施；對(duì)照：等量茶汁噴施)毒死蜱濃度(mg/kg)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(試驗(yàn))0.1290.0880.0720.0600.0480.0330.010根周土壤(試驗(yàn))0.2440.1950.1600.1240.0980.0630.023枸杞(對(duì)照)0.1420.1270.1180.0930.0880.0670.055根周土壤(對(duì)照)0.2590.2300.1920.1740.1590.1480.135磷酸酯酶活力(U/g)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(試驗(yàn))33.635.033.938.935.337.537.0根周土壤(試驗(yàn))43.642.944.647.938.540.541.1枸杞(對(duì)照)4.24.65.34.74.35.04.6根周土壤(對(duì)照)6.86.96.37.57.27.17.5試驗(yàn)中，通過(guò)紅茶菌噴施，6天后，枸杞上毒死蜱降解率達(dá)到92.2％，土壤中毒死蜱降解率達(dá)到90.6％，分別比對(duì)照降低30.9和42.7個(gè)百分點(diǎn)，說(shuō)明紅茶菌對(duì)毒死蜱降解有明顯促進(jìn)作用。表4還顯示，紅茶菌噴施后，枸杞上和土壤中酯酶活力極顯著地高于對(duì)照且保持穩(wěn)定，說(shuō)明紅茶菌通過(guò)產(chǎn)生酯酶而發(fā)揮對(duì)毒死蜱降解有明顯促進(jìn)作用。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3