本發(fā)明涉及一種免疫細(xì)胞凍存液及其應(yīng)用，屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域。更具體地，涉及免疫細(xì)胞凍存液、用于凍存免疫細(xì)胞的試劑盒以及凍存免疫細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞冷凍技術(shù)作為一種保存細(xì)胞的有效方法在生物學(xué)領(lǐng)域已有深入廣泛的應(yīng)用。對(duì)供體的免疫細(xì)胞深低溫保存可保持其活力和功能，無(wú)論對(duì)臨床還是基礎(chǔ)研究均具有重要意義，尤其是免疫細(xì)胞用于回顧性研究時(shí)更為重要。冷凍保存免疫細(xì)胞不僅可以解決現(xiàn)有免疫細(xì)胞誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)，需要多次誘導(dǎo)和患者多次采血的問(wèn)題，還可以把人健康狀態(tài)最好或戰(zhàn)斗力最強(qiáng)時(shí)期的免疫細(xì)胞保存下來(lái)，用于腫瘤治療以及抗衰老保健治療。
正常情況下，液體凍結(jié)時(shí)會(huì)造成細(xì)胞損傷，其中，一種情況是由于不適當(dāng)?shù)慕禍睾蛷?fù)蘇，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)形成冰晶和重結(jié)晶；另一種情況是由于冷凍使得電解質(zhì)和溶質(zhì)濃度升高所導(dǎo)致的溶質(zhì)損傷。通常，免疫細(xì)胞在-70℃～-80℃凍存，細(xì)胞活性會(huì)隨著冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)迅速下降，在-196℃時(shí)細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程幾乎停止，因此要長(zhǎng)期保存免疫細(xì)胞，液氮溫度是最佳的儲(chǔ)存溫度。
目前現(xiàn)有的細(xì)胞凍存液不能有效保存大規(guī)模培養(yǎng)的免疫細(xì)胞，凍存后的細(xì)胞復(fù)蘇后細(xì)胞數(shù)量以及細(xì)胞活力都無(wú)法滿足臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致免疫細(xì)胞體外大規(guī)模培養(yǎng)后，必須短時(shí)間內(nèi)盡快應(yīng)用，否則就只能廢棄。
由此，適用于大量的免疫細(xì)胞的體外凍存液有待改進(jìn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種用于免疫細(xì)胞長(zhǎng)期保存，并能夠在復(fù)蘇后保持其細(xì)胞特性的凍存液。
需要說(shuō)明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
DMSO是常用的細(xì)胞冷凍保存劑，單獨(dú)使用保存免疫細(xì)胞存活率低。因而，發(fā)明人致力于尋找能夠促進(jìn)冷凍保存下免疫細(xì)胞存活率的成分，以便與DMSO聯(lián)用，以便通過(guò)其與DMSO協(xié)同作用，達(dá)到能夠長(zhǎng)期保存免疫細(xì)胞的效果。例如，發(fā)明人利用DMSO(二甲基亞砜，Dimethyl sulfoxide)協(xié)同海藻糖對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率明顯下降，冷凍保存作用并不理想。然而，人血清白蛋白在冷凍復(fù)蘇過(guò)程中能夠調(diào)節(jié)滲透壓，而血漿中又含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，因而，發(fā)明人嘗試將血漿和HSA(人血清白蛋白，Human Serum Albumin)與DMSO結(jié)合，制備免疫細(xì)胞的凍存液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種凍存液對(duì)凍存細(xì)胞有較好的保護(hù)作用，凍存細(xì)胞復(fù)蘇后依然保持良好的細(xì)胞活力，細(xì)胞回收率高。
白酒草系菊科白酒草屬植物Conyza japonica(Thunb.)Less的全草，顏世倫等曾經(jīng)報(bào)道從白酒草中分離得到化合物白酒草皂苷R，結(jié)構(gòu)鑒定為3-O-β-D-glucopyranosyl medicagenic acid 28-O-β-D-apiofuranosyl-(1→3)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-[β-D-apiofuranosyl-(1→3)]-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl ester，其結(jié)構(gòu)式為：
本發(fā)明人還驚訝地發(fā)現(xiàn)，微量白酒草皂苷R，血漿和HSA(人血清白蛋白，Human Serum Albumin)與DMSO結(jié)合制備免疫細(xì)胞的凍存液，可以降低DMSO的使用量，這種凍存液對(duì)凍存細(xì)胞有較好的保護(hù)作用，凍存細(xì)胞復(fù)蘇后依然保持良好的細(xì)胞活力，細(xì)胞回收率高。
因而，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種免疫細(xì)胞凍存液。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該凍存液包含2-10體積％的DMSO；2-15體積％的HSA；20-88體積％的血漿；以及余量培養(yǎng)基。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該凍存液能夠有效用于凍存免疫細(xì)胞，細(xì)胞復(fù)蘇后依然保持良好的細(xì)胞活力，并且細(xì)胞回收率高。
因而，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種免疫細(xì)胞凍存液。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該凍存液包含0.2-0.8體積％的DMSO；2-15體積％的HSA；0.001g/ml的白酒草皂苷R，20-88體積％的血漿；以及余量培養(yǎng)基。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該凍存液能夠有效用于凍存免疫細(xì)胞，細(xì)胞復(fù)蘇后依然保持良好的細(xì)胞活力，并且細(xì)胞回收率高。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述DMSO的濃度為10體積％。由此，對(duì)免疫細(xì)胞的凍存效果好。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述HSA的濃度為5體積％。由此，冷凍復(fù)蘇過(guò)程中滲透壓調(diào)節(jié)效果好，從而能夠有效保護(hù)細(xì)胞，提高細(xì)胞存活率，并且保證凍存液成本。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例所述血漿的濃度為40體積％。由此，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用突出，細(xì)胞復(fù)蘇后依然保持良好的細(xì)胞活力。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述血漿為自體血漿。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)基或Stemspan培養(yǎng)基。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述免疫細(xì)胞為自然殺傷細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。由此，凍存效果好。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于凍存免疫細(xì)胞的試劑盒，其包含前面所述的免疫細(xì)胞凍存液。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該試劑盒能夠有效用于凍存免疫細(xì)胞，且細(xì)胞有效保存時(shí)間長(zhǎng)，復(fù)蘇后細(xì)胞依然保持良好的細(xì)胞活力，細(xì)胞回收率高。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種凍存免疫細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法利用前面所述的免疫細(xì)胞凍存液或者試劑盒，凍存所述免疫細(xì)胞。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，采用該方法凍存免疫細(xì)胞，細(xì)胞有效保存時(shí)間長(zhǎng)，復(fù)蘇后細(xì)胞依然保持良好的細(xì)胞活力，細(xì)胞回收率高。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，每106-109個(gè)免疫細(xì)胞采用1ml所述免疫細(xì)胞凍存液。由此，能夠有效實(shí)現(xiàn)免疫細(xì)胞的凍存，并且單位體積的凍存液保存的細(xì)胞量大，適宜大規(guī)模免疫細(xì)胞的凍存。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，每107-108個(gè)免疫細(xì)胞采用1ml所述免疫細(xì)胞凍存液。由此，細(xì)胞凍存效果好。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括：將含有所述免疫細(xì)胞的所述免疫細(xì)胞凍存液或者所述的試劑盒進(jìn)行程序降溫處理，所述程序降溫處理的條件為：0-2分鐘，所述免疫細(xì)胞的溫度從4攝氏度下降到-1攝氏度；2-3分鐘，所述免疫細(xì)胞的溫度從-1攝氏度上升到0攝氏度；3-6分鐘，所述免疫細(xì)胞的溫度保持0攝氏度；6-11分鐘，所述免疫細(xì)胞的溫度從0攝氏度下降到-10攝氏度；11-16分鐘，所述免疫細(xì)胞的溫度保持-10攝氏度；16-50分鐘，所述免疫細(xì)胞的溫度從-10攝氏度下降到-45攝氏度；50-85分鐘，所述免疫細(xì)胞的溫度保持-45攝氏度；85-95分鐘，所述免疫細(xì)胞的溫度從-45攝氏度下降到-90攝氏度；95-100分鐘，所述免疫細(xì)胞的溫度保持-90攝氏度。由此，通過(guò)程序降溫避免冷凍時(shí)細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，保護(hù)細(xì)胞膜和細(xì)胞器免受損傷有利于細(xì)胞長(zhǎng)期保持，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用好。
本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
本發(fā)明的有益之處在于：
本發(fā)明提出一種用于免疫細(xì)胞長(zhǎng)期保存，并能夠在復(fù)蘇后保持其細(xì)胞特性的凍存液。
具體實(shí)施方式
下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種免疫細(xì)胞凍存液。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，該細(xì)胞凍存液凍存的細(xì)胞種類不受特別的限制，只要凍存液能用于長(zhǎng)期保存細(xì)胞即可。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該凍存液包含2-10體積％的DMSO；2-15體積％的HSA；20-88體積％的血漿；以及余量培養(yǎng)基。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該凍存液能夠有效用于保存免疫細(xì)胞，并且凍存時(shí)間長(zhǎng)(凍存時(shí)間可達(dá)幾年甚至更長(zhǎng))，細(xì)胞復(fù)蘇后依然保持良好的細(xì)胞活力，活性好，細(xì)胞回收率高，尤其適用于大規(guī)模免疫細(xì)胞的冷凍保存。
其中，需要說(shuō)明的是，當(dāng)所述DMSO、HSA和血漿的體積百分?jǐn)?shù)之和小于1時(shí)，免疫細(xì)胞凍存液進(jìn)一步包含剩余體積的培養(yǎng)基。例如，在免疫細(xì)胞凍存液中，當(dāng)DMSO的濃度為10體積％、HSA的濃度為2％體積，血漿的濃度為88％體積時(shí)，該免疫細(xì)胞凍存液不包含培養(yǎng)基；當(dāng)DMSO的濃度為5體積％、HSA的濃度為2％體積，血漿的濃度為88％體積時(shí)，該免疫細(xì)胞凍存液包含5％體積的培養(yǎng)基；當(dāng)DMSO的濃度為10體積％、HSA的濃度為5％體積，血漿的濃度為40％體積時(shí)，該免疫細(xì)胞凍存液包含45％體積的培養(yǎng)基。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，DMSO的濃度為10體積％。由此，對(duì)細(xì)胞凍存效果突出。
根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，HSA的濃度為5體積％。由此，冷凍復(fù)蘇過(guò)程中滲透壓調(diào)節(jié)效果好，從而能夠有效保護(hù)細(xì)胞，提高細(xì)胞存活率，并且合理控制凍存液的成本。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，血漿的濃度為40體積％。由此，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用突出，細(xì)胞復(fù)蘇后依然保持良好的細(xì)胞活力。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述血漿為自體血漿。
其中，需要說(shuō)明的是，在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“自體血漿”是指與待凍存的免疫細(xì)胞具有同一來(lái)源的血漿。換言之，即該血漿與要利用凍存液凍存的免疫細(xì)胞取自同一個(gè)體。由此，對(duì)自體的免疫細(xì)胞排異作用小，有利于凍存細(xì)胞的保護(hù)。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)基或Stemspan培養(yǎng)基。由此，細(xì)胞的凍存效果好。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于凍存免疫細(xì)胞的試劑盒，其包含前面所述的免疫細(xì)胞凍存液。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該試劑盒能夠有效用于凍存免疫細(xì)胞，且細(xì)胞有效保存時(shí)間長(zhǎng)，復(fù)蘇后細(xì)胞依然保持良好的細(xì)胞活力，活性好，細(xì)胞回收率高，尤其適用于大規(guī)模免疫細(xì)胞的冷凍保存。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種凍存免疫細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法利用前面所述的免疫細(xì)胞凍存液或者試劑盒，凍存所述免疫細(xì)胞。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，采用該方法凍存免疫細(xì)胞，細(xì)胞有效保存時(shí)間長(zhǎng)，復(fù)蘇后細(xì)胞依然保持良好的細(xì)胞活力，細(xì)胞回收率高。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，每106-109個(gè)免疫細(xì)胞采用1ml所述免疫細(xì)胞凍存液。由此，能夠有效實(shí)現(xiàn)免疫細(xì)胞的凍存，并且凍存的細(xì)胞濃度高，適于大規(guī)模免疫細(xì)胞的凍存，凍存成本低，效果好。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，每107-108個(gè)免疫細(xì)胞采用1ml所述免疫細(xì)胞凍存液。由此，凍存的細(xì)胞濃度高，適于大規(guī)模免疫細(xì)胞的凍存，凍存成本低，并且細(xì)胞凍存效果好。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，該方法進(jìn)一步包括：將含有免疫細(xì)胞的免疫細(xì)胞凍存液或者試劑盒進(jìn)行程序降溫處理，該程序降溫處理的條件為：0-2分鐘，免疫細(xì)胞的溫度從4攝氏度下降到-1攝氏度；2-3分鐘，免疫細(xì)胞的溫度從-1攝氏度上升到0攝氏度；3-6分鐘，免疫細(xì)胞的溫度保持0攝氏度；6-11分鐘，免疫細(xì)胞的溫度從0攝氏度下降到-10攝氏度；11-16分鐘，免疫細(xì)胞的溫度保持-10攝氏度；16-50分鐘，免疫細(xì)胞的溫度從-10攝氏度下降到-45攝氏度；50-85分鐘，免疫細(xì)胞的溫度保持-45攝氏度；85-95分鐘，免疫細(xì)胞的溫度從-45攝氏度下降到-90攝氏度；95-100分鐘，免疫細(xì)胞的溫度保持-90攝氏度。由此，通過(guò)程序降溫避免冷凍時(shí)細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，保護(hù)細(xì)胞膜和細(xì)胞器免受損傷有利于細(xì)胞長(zhǎng)期保持，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用好。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，免疫細(xì)胞凍存于液氮中。由此，有利于細(xì)胞長(zhǎng)期保持，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用好。
根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，可以按照以下步驟凍存免疫細(xì)胞：將本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液與待凍存的免疫細(xì)胞混勻后，速移入凍存管，并放入凍存盒中，進(jìn)行程序降溫，-70℃過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)入液氮內(nèi)保存。
下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實(shí)施例1：
本實(shí)施例中，分別采用不含血漿的6種凍存液和含有血漿的6種凍存液，對(duì)體外誘導(dǎo)擴(kuò)增的免疫細(xì)胞進(jìn)行凍存，比較凍存效果，以便觀察血漿對(duì)免疫細(xì)胞凍存保存的影響，以及降低DMSO濃度以減少細(xì)胞毒性的可能性。具體如下：
1、采用不含血漿的凍存液凍存免疫細(xì)胞
1.1、分離獲得臍帶血單個(gè)核細(xì)胞，將單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞接種到加有20ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基配比為：18ml OpTmizerTMCTSTMT-cell expansion SFM培養(yǎng)基+2ml自體血漿(Autologous plasma)+終濃度1000IU/ml Pepro Tech IL-2+終濃度0.01KE/ml沙培林(OK432)，37℃，5％CO2無(wú)菌培養(yǎng)，記為第0天。每日觀察細(xì)胞，并進(jìn)行適當(dāng)傳代擴(kuò)增，培養(yǎng)基配比為培養(yǎng)基配比為：OpTmizerTMCTSTMT-cell expansion SFM培養(yǎng)基+10％自體血漿(Autologous plasma)+終濃度1000IU/ml Pepro Tech IL-2，誘導(dǎo)擴(kuò)增得到免疫細(xì)胞。
1.2、免疫細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇方法：
將上述體外誘導(dǎo)擴(kuò)增第10天獲得的免疫細(xì)胞分別采用含HSA的六種凍存液進(jìn)行凍存，其中四種凍存液的成份如下：
凍存液1：5體積％DMSO+10體積％HSA；
凍存液2：5體積％DMSO+15體積％HSA；
凍存液3：10體積％DMSO+10％體積HSA；
凍存液4：10體積％DMSO+15體積％HSA，
凍存液5：0.2體積％的DMSO+15體積％的HSA，配制完成后加入白酒草皂苷R至其終濃度為0.001g/ml；
凍存液6：0.4體積％的DMSO+10體積％的HSA，配制完成后加入白酒草皂苷R至其終濃度為0.001g/ml；
其中，凍存液1-6中剩余體積的均為1640或Stemspan培養(yǎng)基。
按照以下步驟凍存免疫細(xì)胞：將冷凍保存液與細(xì)胞混勻后，速移入凍存管，并放入凍存盒中，-70℃程序降溫過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)入液氮內(nèi)。其中，每107個(gè)免疫細(xì)胞采用1ml凍存液。
冷凍保存免疫細(xì)胞30d，然后進(jìn)行復(fù)蘇。
檢測(cè)凍存前后細(xì)胞的存活率，以及復(fù)蘇后細(xì)胞回收率。具體地，凍存前以及凍存并復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率計(jì)算方法為：【活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))】×100％。復(fù)蘇后細(xì)胞回收率的計(jì)算方法為：(復(fù)蘇后活細(xì)胞數(shù)/凍存時(shí)活細(xì)胞數(shù))×100％。
1.3、復(fù)蘇免疫細(xì)胞檢查結(jié)果：
結(jié)果表明，復(fù)蘇后細(xì)胞存活率均低于凍存前。具體地，凍存液3和4保存的細(xì)胞存活率明顯優(yōu)于凍存液1和2，且凍存液3和4之間未見(jiàn)差別，表明10體積％的DMSO對(duì)免疫細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用，且不同濃度的HSA對(duì)于免疫細(xì)胞的保護(hù)作用無(wú)顯著差別；凍存液3和4的細(xì)胞回收率也優(yōu)于凍存液1和2。凍存液5和6的細(xì)胞回收率也優(yōu)于凍存液1和2，尤其是凍存液5，細(xì)胞回收率高達(dá)99.6％。
各組凍存液的細(xì)胞回收率為：
凍存液1：63.1％；
凍存液2：62.8％；
凍存液3：76.9％；
凍存液4：76.3％，
凍存液5：99.6％；
凍存液6：78.2％；
2、采用含血漿的凍存液凍存免疫細(xì)胞
2.1、分離獲得臍帶血單個(gè)核細(xì)胞，將單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞接種到加有20ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基配比為：18ml OpTmizerTMCTSTMT-cell expansion SFM培養(yǎng)基+2ml自體血漿(Autologous plasma)+終濃度1000IU/ml Pepro Tech IL-2+終濃度0.01KE/ml沙培林(OK432)，37℃，5％CO2無(wú)菌培養(yǎng)，記為第0天。每日觀察細(xì)胞，并進(jìn)行適當(dāng)傳代擴(kuò)增，培養(yǎng)基配比為培養(yǎng)基配比為：OpTmizerTMCTSTMT-cell expansion SFM培養(yǎng)基+10％自體血漿(Autologous plasma)+終濃度1000IU/ml Pepro Tech IL-2，誘導(dǎo)擴(kuò)增得到免疫細(xì)胞。
2.2、免疫細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇方法：
分別采用含血漿的六種冷凍保存液，將上述體外誘導(dǎo)擴(kuò)增10天獲得的免疫細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，其中含血漿的六種凍存液的成份如下：
凍存液9：5體積％DMSO+40體積％血漿；
凍存液10：10體積％DMSO+40體積％血漿；
凍存液11：5體積％DMSO+5體積％HSA+40體積％血漿；
凍存液12：10體積％DMSO+5體積％HSA+40體積％血漿，
凍存液13：0.2體積％的DMSO+15體積％的HSA+40體積％血漿，配制完成后加入白酒草皂苷R至其終濃度為0.001g/ml；
凍存液14：0.4體積％的DMSO+10體積％的HSA+40體積％血漿，配制完成后加入白酒草皂苷R至其終濃度為0.001g/ml；
其中，在凍存液9-14中，血漿為自體血漿，剩余體積的均為1640或Stemspan培養(yǎng)基。
其中，按照以下步驟凍存免疫細(xì)胞：將冷凍保存液與細(xì)胞混勻后，速移入凍存管，并放入凍存盒中，-70℃程序降溫過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)入液氮內(nèi)。其中，每107個(gè)免疫細(xì)胞采用1ml凍存液。
冷凍保存免疫細(xì)胞30d，然后進(jìn)行復(fù)蘇。
檢測(cè)凍存前后細(xì)胞的存活率、細(xì)胞活性、細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)情況，以及復(fù)蘇后細(xì)胞回收率。具體地，凍存前以及凍存并復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率計(jì)算方法為：【活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))】×100％。復(fù)蘇后細(xì)胞回收率的計(jì)算方法為：(復(fù)蘇后活細(xì)胞數(shù)/凍存時(shí)活細(xì)胞數(shù))×100％。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志CD3-CD56+和CD3+CD4+的表達(dá)情況。
2.3、復(fù)蘇免疫細(xì)胞檢查結(jié)果：
結(jié)果表明，六種保存液保存的免疫細(xì)胞存活率和細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)情況與凍存前相比無(wú)顯著差別，細(xì)胞回收率高于“步驟1”中不含血漿的凍存液。并且，冷凍保存液5和6，9和10凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后均具有一定的增殖能力，13和14凍存液凍存的細(xì)胞具有旺盛的繁殖能力。由此，表明血漿以及白酒草皂苷R對(duì)細(xì)胞有很好的保護(hù)作用。
各組凍存液的細(xì)胞回收率為：
凍存液7：69.1％；
凍存液8：71.8％；
凍存液9：82.6％；
凍存液10：83.9％，
凍存液11：99.8％；
凍存液12：92.3％；
綜上，發(fā)明人采用DMSO、HAS、白酒草皂苷R和血漿不同濃度配比，保存臍血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞，觀察凍存液效果，結(jié)果表明，10體積％DMSO具有較好的細(xì)胞保護(hù)作用；而不同濃度的HSA對(duì)免疫細(xì)胞的保護(hù)作用無(wú)顯著差別。而采用本發(fā)明實(shí)施例的自體血漿與HSA和DMSO聯(lián)用或者進(jìn)一步聯(lián)用白酒草皂苷R的凍存液保存體外誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞，復(fù)蘇后細(xì)胞回收率高，細(xì)胞活性好，具有一定的增殖能力，而其余各組冷凍液保存的細(xì)胞回收率偏低。
在本說(shuō)明書(shū)的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書(shū)中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。
盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。