本發(fā)明屬于果樹栽培領(lǐng)域，具體涉及一種緩解獼猴桃高溫脅迫的方法。

背景技術(shù)：

溫度是植物自然地理分布的主要限制因素，也是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必需條件之一，還是植物的生育動(dòng)力的數(shù)量因子，因?yàn)橹参镆獙?shí)現(xiàn)一定的生長(zhǎng)量或完成某一生育時(shí)期必須要有一定量的活動(dòng)積溫。但是，隨著全球氣候環(huán)境的日益惡化，溫室效應(yīng)的加劇，溫度也成為了影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的一大脅迫因子。大量的研究發(fā)現(xiàn)，無論是園藝植物還是大田植物在高溫脅迫下其正常的生長(zhǎng)發(fā)育均會(huì)受到影響，最終導(dǎo)致作物生產(chǎn)量和產(chǎn)量的下降。

獼猴桃(Actinidia)屬獼猴桃科、獼猴桃屬多年生藤本植物，雌雄異株。獼猴桃果實(shí)為典型的漿果，主要是以含維生素高，適口和特異的風(fēng)味見著，該產(chǎn)業(yè)在全球都具有極好的經(jīng)濟(jì)發(fā)展前景，是一種重要的果樹資源。然而，溫度是限制獼猴桃分布和生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素，獼猴桃大多數(shù)種要求溫暖濕潤(rùn)的氣候，即亞熱帶或溫帶濕潤(rùn)半濕潤(rùn)氣候，主要分布在北緯18～34度的廣大地區(qū)，超過這個(gè)范圍則生長(zhǎng)不良或不能生存。因此，提高獼猴桃的耐熱性，保證獼猴桃在高溫脅迫下能夠維持正常的生理水平，對(duì)取得較理想的產(chǎn)量和品質(zhì)有重要意義。

目前，對(duì)于緩解獼猴桃高溫脅迫的方法較少，主要集中在使用茉莉酸甲酯、油菜素內(nèi)酯和抗壞血酸，如《油菜素內(nèi)酯對(duì)高溫脅迫下獼猴桃苗耐熱性相關(guān)生理指標(biāo)的影響》、《抗壞血酸對(duì)高溫脅迫下獼猴桃苗抗熱性相關(guān)生理指標(biāo)的影響》和《茉莉酸甲酯對(duì)高溫脅迫下獼猴桃苗膜脂過氧化及相關(guān)抗氧化酶的影響》。研究更多的處理方法，對(duì)于獼猴桃產(chǎn)業(yè)而言，具有重大的產(chǎn)業(yè)實(shí)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種緩解獼猴桃果樹高溫脅迫的方法，該方法包括如下步驟：

當(dāng)獼猴桃幼苗長(zhǎng)至五葉一心時(shí)，澆灌濃度為50-200μmol/L的褪黑素，澆灌量為200ml，每隔2天澆灌一次，共5次。

所述獼猴桃幼苗的獲得方法為：將種子在800mg/L的赤霉素溶液中浸泡1天，4℃層積2個(gè)月，然后在培養(yǎng)箱中25℃、8h/4℃、16h變溫處理2周，之后25℃恒溫培養(yǎng)至種子萌芽；將發(fā)芽的種子播種到育苗盤中，上面覆蓋2mm的營(yíng)養(yǎng)土，于人工氣候室中培養(yǎng)，光暗周期為12h/12h，晝夜溫度為25℃/20℃；當(dāng)幼苗長(zhǎng)到2—3片真葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移到裝有珍珠巖的花盆中，每盆3株；移苗后注意保濕遮陰，澆營(yíng)養(yǎng)液。

所述獼猴桃為野生中華獼猴桃。

優(yōu)選的，褪黑素的濃度為100μmol/L。

所述高溫為45℃。

褪黑素(melatonin,MT),又稱松果素,1958年被美國(guó)科學(xué)家Lerner從牛松果體中首次提取出來,其化學(xué)成分為N-乙酰基-5-甲氧基色胺。它具有助眠,抗氧化衰老,提高免疫等方面的功效,已在臨床醫(yī)療方面得以應(yīng)用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)植物中也存在有微量的褪黑素,最主要的生物學(xué)功能是作為抗氧化物質(zhì)保護(hù)細(xì)胞，減輕自由基的傷害作為抗氧化物質(zhì)保護(hù)細(xì)胞。近年對(duì)外源褪黑素研究發(fā)現(xiàn)，在植物脅迫逆境中起到緩解的作用，如提高黃瓜高溫下的抵抗程度，提高黃瓜的耐鹽性。

然而，褪黑素并非一定可以提高植物的抗逆性。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用褪黑素?zé)o法緩解高鹽脅迫和重金屬脅迫。另外，褪黑素對(duì)于蔬菜的高溫脅迫也沒有效果。

通過對(duì)不同植物進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在眾多脅迫中，褪黑素對(duì)于獼猴桃的高溫脅迫有著較好的緩解作用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明可以保護(hù)高溫脅迫下植物細(xì)胞膜的完整性，促進(jìn)植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的增加，緩解高溫脅迫下獼猴桃蛋白質(zhì)的降解，促進(jìn)植物體內(nèi)可溶性糖含量的增加，增強(qiáng)維持細(xì)胞內(nèi)滲透勢(shì)能力，可以刺激和誘導(dǎo)高溫逆境條件下植物體內(nèi)SOD、CAT、POD活性，使其在長(zhǎng)時(shí)間的高溫脅迫下維持較高的活性狀態(tài)，從而更有利于清除H₂O₂，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，提高獼猴桃的抗高溫能力。

附圖說明

圖1為外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下獼猴桃丙二醛含量的影響結(jié)果圖；其中，圖中不同的字母表示差異顯著(P<0.05)；

圖2為外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下獼猴桃相對(duì)膜透性的影響結(jié)果圖；圖中不同的字母表示差異顯著(P<0.05)；

圖3為外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下獼猴桃脯氨酸含量的影響結(jié)果圖；圖中不同的字母表示差異顯著(P<0.05)；

圖4為外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下獼猴桃可溶性蛋白含量的影響結(jié)果圖；圖中不同的字母表示差異顯著(P<0.05)；

圖5為外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下獼猴桃可溶性糖含量的影響結(jié)果圖；圖中不同的字母表示差異顯著(P<0.05)；

圖6為外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下獼猴桃SOD活性的影響結(jié)果圖；圖中不同的字母表示差異顯著(P<0.05)；

圖7為外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下獼猴桃CAT活性的影響結(jié)果圖；圖中不同的字母表示差異顯著(P<0.05)；

圖8為外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下獼猴桃POD活性的影響結(jié)果圖；圖中不同的字母表示差異顯著(P<0.05)。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只是用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容所做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例

獼猴桃(Actinidia)生長(zhǎng)需要溫暖濕潤(rùn)的氣候，高溫脅迫對(duì)于獼猴桃的正常生長(zhǎng)發(fā)育具有極大的影響。本試驗(yàn)以獼猴桃幼苗為材料，在五葉一心時(shí)進(jìn)行褪黑素灌根處理5次，24h后進(jìn)行高溫脅迫處理，測(cè)定丙二醛、過氧化氫、葉綠素、電導(dǎo)率、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量以及SOD、CAT和POD的酶活性。

植物材料為2015年9月采得的野生中華獼猴桃種子，將種子在800mg/L的赤霉素溶液中浸泡1天，4℃層積2個(gè)月，然后在培養(yǎng)箱中25℃8h/4℃16h變溫處理2周，之后25℃恒溫培養(yǎng)至種子萌芽。將發(fā)芽的種子播種到育苗盤中，上面覆蓋2mm的營(yíng)養(yǎng)土，于人工氣候室中培養(yǎng),光暗周期為12h/12h，晝夜溫度為25℃/20℃。當(dāng)幼苗長(zhǎng)到2—3片真葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移到裝有珍珠巖的花盆中，每盆3株。移苗后注意保濕遮陰，澆營(yíng)養(yǎng)液。

當(dāng)獼猴桃幼苗長(zhǎng)至5片葉時(shí)，進(jìn)行試驗(yàn)處理，選擇整齊一致的壯苗分別用0-200μmol·L^-1外源MLT(褪黑素)灌根，2d一次，五次后將所有苗移入25℃培養(yǎng)箱中適應(yīng)24h，再進(jìn)行高溫脅迫處理(表1)，并于未升溫PT(25℃未澆灌褪黑素處理組，下同)和高溫脅迫8h后進(jìn)行取樣(根基向上第3至5片真葉)，液氮保存后，置于-80℃超低溫冰箱中。

表1處理組對(duì)照表

3.3.1相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定

相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定參照Campos等(2003)的方法。在干凈的50ml離心管中加入30ml去離子水，用0.5cm直徑的打孔器打孔葉片，打孔盡量避開葉脈，稱取0.1g小圓片放入離心管中，蓋上離心管蓋，放在搖床上150r/min遮光搖6h，至葉片沉到離心管底部。用便攜式電導(dǎo)儀測(cè)定去離子水電導(dǎo)率S0，浸泡液電導(dǎo)率S1，再將浸泡液沸水浴30min以殺死植物組織，冷卻至室溫后測(cè)溶液電導(dǎo)率S2。相對(duì)電導(dǎo)率計(jì)算公式為：相對(duì)電導(dǎo)率(％)＝(S1-S0)×100/(S2-S0)。每個(gè)處理三次重復(fù)。

3.3.2丙二醛含量的測(cè)定

丙二醛含量測(cè)定參照Hodges等(1999)的方法。稱取0.3g葉片，加入少量石英沙和5ml 5％TCA(三氯乙酸)溶液研磨成勻漿，在10000r/min下離心10min。取上清液2ml于試管中，加2ml用10％TCA配置的0.67％TBA(硫代巴比妥酸)，混合搖勻后封口，沸水浴30min，取出試管冷卻，如果有沉淀，10000r/min離心10min。吸取上清液，分別在450nm、532nm、600nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。每個(gè)處理三次重復(fù)。MDA濃度計(jì)算公式為：C(μmol·L^-1)＝6.45×(A₄₅₀-A₆₀₀)-0.56A₄₅₀。式中A₄₅₀、A₅₃₂、A₆₀₀分別代表450nm、532nm、600nm波長(zhǎng)下的吸光值。進(jìn)一步計(jì)算出葉片中MDA含量(μmol·g^-1)＝C×V/(1000×W)，V為樣品提取液體積(ml)，W為葉片質(zhì)量(g)。

3.3.3 H₂O₂含量的測(cè)定

H₂O₂含量測(cè)定參照Lin等的方法。取0.3g葉片用預(yù)冷丙酮研磨至勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，定容至5mL，10000r/min離心10min。取1mL上清液加0.1ml 5％的硫酸鈦和0.2mL濃氨水，生成復(fù)合物后4000r/min離心10min，棄上清，用丙酮反復(fù)洗滌沉淀3到5次，直至出去植物色素，最后向沉淀中加入5mL 2M硫酸，待沉淀完全溶解后，加蒸餾水定容至10mL，于415nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。每處理三次重復(fù)。H₂O₂含量(μmol·g^-1FW)＝(C×V_t)/(W×V_s)，C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查的H2O2濃度(umol)，V_t為提取液體積(mL)，V_s為測(cè)定時(shí)取用的樣品體積(mL)，W為樣品質(zhì)量(g)。

可溶性糖含量的測(cè)定

可溶性糖含量測(cè)定參照李合生等的方法。取新鮮植物葉片，擦凈表面污物，剪碎混勻，稱取0.2g，放入刻度試管中，加入5ml蒸餾水，于沸水中提取30min，提取液過濾至10ml試管中，提取2次，反復(fù)沖洗試管及殘?jiān)?，定容?0ml。若有沉淀，靜置。吸取樣品提取液0.5mL于10mL干燥刻度試管中，加蒸餾水1.5mL，按順序向試管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯試劑，加蓋，充分搖勻，讓乙酸乙酯水解，沿各管管壁緩慢加入5mL濃硫酸，加蓋，充分振蕩(猛搖試管數(shù)次)，立即將試管放入沸水浴中，逐管準(zhǔn)確保溫1min取出后置于試管架上自然冷卻至室溫，以空白作參比(0號(hào)管)，在630nm波長(zhǎng)下測(cè)其光密度。每處理三次重復(fù)。樣品可溶性糖含量(％)＝C×V_總/(W×V_測(cè)×10⁶)×100％，C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的糖含量(μg)，V_總為提取液總體積(mL)，V_測(cè)為測(cè)定時(shí)取用體積(mL)，W為樣品鮮重(g)，10⁶為樣品重量單位由g換算成μg的倍數(shù)。

可溶性蛋白含量的測(cè)定

可溶性蛋白含量測(cè)定參考李合生等的方法。取待測(cè)植物葉片(去主葉脈)0.3g于預(yù)冷的研缽中，加適量石英砂，使用0.05mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)研磨至勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中，定容至5ml。于4℃下10000r/min離心10min，取上清液于4℃下保存。吸取上清液1ml，加5ml考馬斯亮藍(lán)G—250，蓋塞，反轉(zhuǎn)混合數(shù)次(搖勻)，放置2min后在595nm下比色，測(cè)定其吸光度，比色應(yīng)在1h內(nèi)完成。樣品中蛋白質(zhì)的含量(mg·g^-1)＝C×V₁/(M×1000)，C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線值(μg/ml)，V₁為提取液總體積(ml)，M為樣品鮮重(g)。

游離脯氨酸含量的測(cè)定

游離脯氨酸含量測(cè)定參考李合生等的方法。取葉片0.3g，加入5ml3％磺基水楊酸，加蓋，在沸水浴中提取10min，提取過程中要經(jīng)常搖動(dòng)，冷卻后，以10000r/min離心10min。取2mL上清液于干燥的帶塞刻度試管中，依次加入2mL冰醋酸；3mL茚三酮試劑，并混勻后在沸水浴中加熱30min，溶液呈紅色。冷卻后向各試管準(zhǔn)確加入4ml甲苯，振蕩30s，靜置片刻，取上層液至離心管中3000r/min下離心5min。用吸管或移液槍吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色皿中，以0濃度為對(duì)照較零，于520nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。樣品中脯氨酸含量(μg·g^-1)＝m×V/(W×V₁)，m為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的脯氨酸的質(zhì)量(μg)，V為提取液總體積(mL)，V₁為測(cè)定時(shí)提取液體積(ml)，W 為樣品質(zhì)量(g)。

葉綠素含量的測(cè)定

葉綠素含量的測(cè)定參考Arnon等的方法。用0.5cm直徑的打孔器打孔葉片，稱取0.05g小圓片放入帶塞試管中，加入8ml 80％丙酮黑暗中浸提24h，期間晃動(dòng)離心管，直至葉片變白。以80％丙酮為空白對(duì)照，在470nm、646nm、663nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每個(gè)處理三次重復(fù)。計(jì)算公式為：C_a＝(12.21A_663-2.81A₆₄₆)×V/(1000×W)；C_b＝(20.13A₆₄₆-5.03A₆₆₃)×V/(1000×W)；C_T＝C_a+C_b＝(17.32A₆₄₆+7.18A₆₆₃)×V/(1000×W)；C_x·c＝(1000A₄₇₀-3.72C_a-104C_b)×V/(229×1000×W)，C_a、C_b分別為葉綠素a、葉綠素b的濃度(mg/L)；A₄₇₀、A₆₄₆、A₆₆₃分別為470nm、646nm、663nm波長(zhǎng)處吸光值；V為葉綠素提取液總體積(mL)；W為葉片重量(g)，C_x·c為類胡蘿卜素的總濃度(mg/L)。

SOD、CAT、POD酶液提取及活性測(cè)定

酶液提?。喝?.5g葉片，加入預(yù)冷的0.05mol/L的磷酸緩沖液(pH7.8，含有1％PVP，2mmol/L DTT，0.1mmol/L EDTA)冰上研磨，定容至8mL。10000r/min低溫離心10min，取上清液進(jìn)行后續(xù)酶活性測(cè)定。

超氧化物歧化酶(SOD)的活性測(cè)定采用Giannopolittis和Ries的方法。在試管中分別依次加入1.5ml 0.05mol/L(pH7.8)磷酸緩沖液，0.3ml 130mmol/L甲硫氨酸溶液，0.3ml 750umol/L氮藍(lán)四唑溶液，0.3ml 100umol/L EDTA-Na2溶液，0.3ml 20umol/L核黃素，0.05ml樣品提取液、0.25ml蒸餾水充分混勻。以緩沖液代替樣品提取液分別做兩支對(duì)照，一支對(duì)照管置于黑暗條件下，另一支對(duì)照管與樣品反應(yīng)管同時(shí)置于4000lx光照下，反應(yīng)20min。反應(yīng)反應(yīng)結(jié)束后，以黑暗條件下的對(duì)照管作為空白對(duì)照，在560nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值。每處理三次重復(fù)。SOD總活性(U·g^-1)＝2(A_CK-A_E)×V_t/(A_CK×W×Vs)，A_CK為對(duì)照吸光值，A_E為各樣品管吸光值，V_t為提取液體積(mL)，Vs為測(cè)定時(shí)取用的樣品體積(mL)，W為樣品質(zhì)量(g)。

過氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定采用改良后的Kato和Shimizu的方法。在試管中分別加入1.5ml 0.2mol/L的磷酸緩沖液(pH7.8)，1ml蒸餾水，0.2ml提取液，加入0.3ml 0.1mol/L的過氧化氫激活反應(yīng)，以時(shí)間掃描方式，測(cè)定3min內(nèi)反應(yīng)液在240nm下的吸光值變化，每個(gè)處理三次重復(fù)。以每分鐘A₂₄₀變化0.1為1個(gè)過氧化氫酶活性單位(U)，過氧化氫酶活性(U·g^-1·min^-1)＝△A₂₄₀×Vt/(2×W×Vs×0.1×t)，△A₂₄₀為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)A₂₄₀的變化，Vt為提取液體積(mL)，Vs為測(cè)定時(shí)取用的樣品體積(mL)，W為樣品質(zhì)量(g)，t為反應(yīng)時(shí)間(min)。

過氧化物酶(POD)活性測(cè)定采用Scebba等的方法。首先配置反應(yīng)液：在試管中加入50ml 50mmol/L的磷酸緩沖液(pH＝5.5)，加入28ul愈創(chuàng)木酚和19ul 30％的過氧化氫，充分混勻，即為反應(yīng)液。吸取3ml反應(yīng)液于比色皿中，加1ml酶提取液，以未加酶液的反應(yīng)液為空白對(duì)照，迅速混勻后，在470nm波長(zhǎng)處，以時(shí)間掃描方式，測(cè)定3min內(nèi)反應(yīng)液在470nm下的吸光值變化，計(jì)算每分鐘吸光度變化值。以每分鐘A₄₇₀變化0.01為1個(gè)過氧化物酶活性單位(U)，過氧化物酶活性(U·g^-1·min^-1)＝△A₄₇₀×Vt/(W×Vs×0.01×t)，△A470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)A₄₇₀的變化；Vt為提取液總體積(mL)；V_s為測(cè)定時(shí)取用的樣品體積(mL)；W為樣品質(zhì)量(g)；t為反應(yīng)時(shí)間(min)。結(jié)果分析

(1)外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下獼猴桃丙二醛含量和相對(duì)膜透性的影響

逆境條件下，植物體內(nèi)邊兒去氨含量的高低能夠反映出細(xì)胞膜的損傷程度，是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物。由圖1可以看出，經(jīng)過8h高溫脅迫后，未施加褪黑素處理和不同濃度外源褪黑素處理的獼猴桃葉片的丙二醛含量都有明顯上升。高溫脅迫8h后，HT的丙二醛含量由PT的7.91nmol·g^-1增加到10.53nmol·g^-1，增加幅度達(dá)到32.49％，而HT+MLT1、HT+MLT2、HT+MLT3的增加幅度均低于HT的增加幅度，分別為4.06％、8.88％、17.40％。由此可以推測(cè)，外源褪黑素處理可以顯著降低高溫逆境條件下丙二醛含量的增加幅度，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，降低膜脂過氧化程度，從而提高獼猴桃的耐熱性，減輕高溫對(duì)植物的傷害程度，其中50μmol·L^-1濃度的褪黑素處理效果最好。

逆境條件下，脅迫因子超過一定的時(shí)間或強(qiáng)度，植物就會(huì)受到傷害，生物膜是逆境傷害的最直接受害者。生物膜受到損傷后，膜的選擇透過性喪失，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)大量擴(kuò)散出細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞相對(duì)膜透性的變化，能夠反映出逆境脅迫對(duì)細(xì)胞膜造成的傷害程度。從圖2可以看出，高溫對(duì)照處理和外源褪黑素處理的獼猴桃葉片的相對(duì)膜透性均呈增加狀態(tài)，但褪黑素處理組的相對(duì)膜透性上升幅度較對(duì)照組較小。高溫脅迫8h后，HT處理組的相對(duì)膜透性增幅為247.35％，HT+MLT1、HT+MLT2、HT+MLT3處理組的相對(duì)膜透性增幅分別為182.74％、127.28％、149.69％，其中HT+MLT2處理組的增幅最小，這表明外源褪黑素濃度為100μmol·L^-1對(duì)獼猴桃的保護(hù)性較強(qiáng)。由此可以看出，外源褪黑素能夠保護(hù)高溫脅迫下植物細(xì)胞膜的完整性，降低質(zhì)膜的透性，提高植株的耐高溫能力。

(2)外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下獼猴桃游離脯氨酸含量和可溶性蛋白含量的影響

游離脯氨酸及可溶性蛋白能夠增加植物細(xì)胞在高溫等逆境條件下的功能蛋白數(shù)量及滲透勢(shì)，是植物提高抗逆能力的兩個(gè)重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)植物細(xì)胞在逆境條件下仍然維持正常的代謝功能，提高植物抵抗逆境的能力。同時(shí)，脯氨酸在穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、降低細(xì)胞酸性、解除氨毒以及作為能量庫(kù)調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原勢(shì)等方面起重要作用。由圖3可知，8h高溫脅迫后，獼猴桃幼苗葉片內(nèi)游離脯氨酸含量顯著高于PT時(shí)的含量，對(duì)照組的游離脯氨酸含量無明顯變化。HT處理組的游離脯氨酸的含量較PT時(shí)的脯氨酸含量增加481.27％，而HT+MLT1、HT+MLT2、HT+MLT3處理組的脯氨酸含量顯著高于HT處理組，相較其的增幅分別為141.82％、188.69％和136.60％，其中HT+MLT2處理組的脯氨酸含量最高。由此可以推測(cè)，外源褪黑素的施加有利于促進(jìn)植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的增加，以來達(dá)到提高植物抵抗逆境的能力，其中100μmol·L^-1濃度的褪黑素處理效果最好。

植物在遭受高溫脅迫時(shí)，葉片可溶性蛋白合成速率會(huì)發(fā)生變化，而可溶性蛋白含量變化可以反映蛋白質(zhì)合成、變性和降解多方面信息。從圖4可以看出，高溫脅迫8h后，正常生長(zhǎng)組的可溶性蛋白含量幾乎沒有變化，但其他處理組的含量均有下降。HT和HT+MLT3處理組的降低量最大，從PT的4.82mg·g^-1分別降至4.35mg·g^-1和4.36mg·g^-1，降幅為10.84％和10.56％。HT+MLT2、HT+MLT3處理組的降低幅度較大，分別為3.99％和1.34％。由此可以表明，外源褪黑素處理可以緩解高溫脅迫下獼猴桃蛋白質(zhì)的降解，其中100μmol·L^-1濃度的褪黑素處理效果最好。

(3)外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下獼猴桃可溶性糖含量的影響

可溶性糖也是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物遭受逆境時(shí)大量合成，維持細(xì)胞內(nèi)滲透勢(shì)，保護(hù)膜系統(tǒng)穩(wěn)定性，因此在抵抗逆境中起重要作用。從圖5可以看出，與PT時(shí)的可溶性糖含量相比，對(duì)照組的可溶性糖含量在高溫脅迫后變化不大，但其他幾個(gè)處理組的可溶性糖含量均增大，其中以HT+MLT2處理組的可溶性糖含量最高，顯著高于其他處理組，為2.39％，與PT時(shí)對(duì)比增幅為127.08％。由此可以說明，施加外源褪黑素有利于促進(jìn)植物體內(nèi)可溶性糖含量的增加，增強(qiáng)維持細(xì)胞內(nèi)滲透勢(shì)能力，從而達(dá)到提高植物抵抗逆境的能力，其中100μmol·L^-1濃度的褪黑素處理效果最好。

(4)外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下獼猴桃保護(hù)酶活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性的大小代表了清除細(xì)胞內(nèi)活性氧能力的高低，是植物逆境條件下保護(hù)細(xì)胞的重要酶類。SOD是生物體內(nèi)普遍存在的參與氧化代謝的一種含金屬酶。其能夠催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，生成O₂和H₂O₂，與植物的衰老和抗逆性密切相關(guān)，對(duì)保護(hù)細(xì)胞免遭氧化傷害起著重要的作用。如圖6所示，經(jīng)過8h的高溫脅迫后，CK處理組與PT時(shí)的SOD活性無明顯差異，而HT、HT+MLT1、HT+MLT2、HT+MLT3處理組的SOD活性與PT時(shí)相比均下降。并且，經(jīng)過褪黑素處理的處理組獼猴桃葉片的SOD活性均高于HT處理組的SOD活性，HT處理組的SOD活性與PT相比降低26.96％，HT+MLT1處理組活性降低18.60％，HT+MLT2處理組活性降低15.34％，HT+MLT3處理組活性降低22.44％。由此可以表明，外源褪黑素激活了高溫脅迫下獼猴桃體內(nèi)的SOD活性，SOD是植物體內(nèi)重要的清除活性氧的酶類，因此SOD活性的升高增強(qiáng)了植物體內(nèi)活性氧的清除能力，有效穩(wěn)定了膜質(zhì)透性，增強(qiáng)了獼猴的抗熱性，其中50μmol·L^-1和100μmol·L^-1濃度的褪黑素處理效果最好。

CAT具有清除植物體內(nèi)H₂O₂的作用，也是植物酶促防御系統(tǒng)的重要組分。圖7表明，HT處理組的CAT活性從PT時(shí)的26.64U·g^-1·min^-1降低至17.8U·g^-1·min^-1，降幅為49.67％；HT+MLT1處理組的CAT活性降低至20.73U·g^-1·min^-1，降幅為28.52％；HT+MLT2處理組的CAT活性降低至22.13U·g^-1·min^-1，降幅為20.41％；、HT+MLT3處理組的CAT活性降低至23.24U·g^-1·min^-1，降幅為14.63％。所有褪黑素處理組的CAT活性均高于HT處理組活性，由此可以推測(cè)，外源褪黑素激活了獼猴桃體內(nèi)CAT活性，CAT活性的增加提高了獼猴桃清除H₂O₂的能力，有效緩解了高溫脅迫誘導(dǎo)的膜脂過氧化，提高了獼猴桃的耐熱性，其中200μmol·L^-1濃度的褪黑素處理效果最好。

POD也是清除H₂O₂的重要物質(zhì)。如圖8所示，8h高溫脅迫后，與PT時(shí)的POD活性相比，CK處理組活性幾乎不變，而HT、HT+MLT1、HT+MLT2、HT+MLT3處理組的POD活性則均升高。高溫8h后，HT、HT+MLT1、HT+MLT2、HT+MLT3的POD活性較PT分別升高12.22％、55.23％、32.16％、47.00％，其中HT+MLT1升高最多，酶活性也顯著高于其他處理，HT+MLT3次之。由此可以表明，褪黑素激活了植物體內(nèi)的POD活性，提高了獼猴桃清除H₂O₂的能力，有效穩(wěn)定了膜質(zhì)透性，從而提高獼猴桃的抗熱性，其中50μmol·L^-1和200μmol·L^-1濃度的褪黑素處理效果最好。

因此，外源褪黑素可以刺激和誘導(dǎo)高溫逆境條件下植物體內(nèi)SOD、CAT、POD活性，使其在長(zhǎng)時(shí)間的高溫脅迫下維持較高的活性狀態(tài)，從而更有利于清除H₂O₂，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，提高獼猴桃的抗高溫能力。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)例1

以巨峰葡萄扦插盆栽苗為試驗(yàn)材料。選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的盆栽苗，平均分成5組，對(duì)照組(CK)和處理組(H1，H2，H3，H4)，進(jìn)行褪黑素澆灌處理和高溫脅迫處理(表2)。褪黑素澆灌處理在傍晚19：00進(jìn)行，對(duì)照組(CK)澆灌300ml清水，處理組(H1，H2，H3，H4)分別澆灌300ml濃度為0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L的褪黑素溶液，每3天澆灌一次，共5次。褪黑素最后一次澆灌結(jié)束后的第2天，擦凈盆栽苗葉片上的污漬，分別將對(duì)照組和處理組放入25±1℃培養(yǎng)箱中適應(yīng)24h，光暗(8:00—20:00)/(20:00—8:00)，濕度為70％，光照為3000lx。適應(yīng)后將處理組轉(zhuǎn)移到45±1℃培養(yǎng)箱，濕度為70％，光照為3000lx，當(dāng)溫度剛升到45℃時(shí)記為高溫脅迫0h，此時(shí)采取對(duì)照組的3～9葉位的葉片，再分別在高溫脅迫4h和8h采取各組植株3～9葉位的葉片，測(cè)定MDA含量，過氧化氫含量和相對(duì)膜透性，每處理6株，設(shè)3次重復(fù)。

表2褪黑素溶液濃度和高溫脅迫處理

試驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)處理方法同上

結(jié)果分析：

(1)外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下巨峰葡萄葉片MDA含量、H₂O₂含量和相對(duì)膜透性的影響

MDA含量、H₂O₂含量和相對(duì)膜透性是反應(yīng)植物受脅迫程度的3個(gè)重要生理指標(biāo)。由表3可以看出，對(duì)巨峰葡萄根灌不同濃度褪黑素溶液后進(jìn)行高溫脅迫處理，隨高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，MDA含量、H₂O₂含量和相對(duì)膜透性均呈升高趨勢(shì)。高溫脅迫后，各處理組MDA含量相比于對(duì)照顯著升高，且8h的MDA含量顯著高于4h的MDA含量，而在各處理組之間的MDA含量差異不顯著。H₂O₂含量和相對(duì)膜透性的變化與MDA含量變化一致。說明根灌50-200μmol/L褪黑素溶液對(duì)巨峰葡萄高溫脅迫沒有緩解作用。

表3

注：不同的字母表示差異顯著(P<0.05)

對(duì)比實(shí)驗(yàn)例2

以夏黑葡萄扦插盆栽苗為試驗(yàn)材料。選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的盆栽苗，平均分成5組，對(duì)照組(CK)和處理組(C1，C2，C3，C4)，進(jìn)行褪黑素澆灌處理之后再干旱脅迫處理(表4)。褪黑素澆灌處理在傍晚19：00進(jìn)行，對(duì)照組(CK)澆灌300ml清水，處理組(T1，T2，T3，T4)分別澆灌300ml濃度為0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L的褪黑素溶液，每3天澆灌一次，共5次。干旱脅迫期間對(duì)照組(CK)正常澆水，處理組(C1，C2，C3，C4)不澆水，采用自然干旱的方式進(jìn)行干旱脅迫，在干旱脅迫處理的第0天(以最后一次澆灌褪黑素溶液的第二天作為干旱脅迫第0天)采取對(duì)照組(CK)和第9天分別采取各組植株3～9葉位的葉片，用于測(cè)定MDA含量，過氧化氫含量和相對(duì)膜透性，每處理6株，設(shè)3次重復(fù)。

結(jié)果與分析：

(1)外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下夏黑葡萄葉片MDA含量、H₂O₂含量和相對(duì)膜透性的影響

表4褪黑素溶液濃度和干旱脅迫處理

(2)試驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)處理方法同上

MDA含量、H₂O₂含量和相對(duì)膜透性是反應(yīng)植物受脅迫程度的3個(gè)重要生理指標(biāo)。對(duì)夏黑葡萄根灌不同濃度褪黑素溶液后進(jìn)行干旱脅迫處理，表5結(jié)果顯示，干旱脅迫后，各處理組的MDA含量、H₂O₂含量和相對(duì)膜透性相對(duì)于對(duì)照組均顯著升高。干旱第0天和第9天，對(duì)照組的MDA含量差異不顯著；在干旱第9天，各處理組的MDA含量差異不顯著。同樣，過氧化氫含量和相對(duì)膜透性的變化趨勢(shì)和MDA相近：干旱脅迫第9天，各處理組過氧化氫含量和相對(duì)膜透性均顯著高于對(duì)照組，但各處理組之間差異不顯著。說明，根灌50-200μmol/L褪黑素溶液不能緩解干旱脅迫對(duì)夏黑葡萄的傷害。

表5

注：不同的字母表示差異顯著(P<0.05)。