【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及花瓣中含至少1種以上的類胡蘿卜素色素的新飄香藤(mandevilla)屬植物、以及，能與有白色～粉色～紅色的花瓣的飄香藤屬植物雜交的、花瓣中含類胡蘿卜素色素的親本飄香藤屬植物的選定方法、及使用該親本飄香藤屬植物的選定方法的飄香藤屬雜交植物的產(chǎn)生方法。

背景技術(shù)：

飄香藤屬(genusmandevilla)植物(也被稱為飄香藤(dipladenia))是屬于夾竹桃科(familyapocynaceae)的蔓性的木本或直立的草本，在熱帶美洲、例如，從墨西哥至阿根廷原生約130種。

在園藝上，在1868年左右，由英國以美麗飄香藤(mandevillasplendens)作為一方親本(另一方親本不明)制出粉紅飄香藤(mandevillaxamabilis(syns.m.amonea))。在1960年，在美國，從被標(biāo)記為m.amonea的株得到的實(shí)生株開花，這成為即使在現(xiàn)在也廣泛流通的“alicedupont“(日本名“rosegiant”)(參照以下，非專利文獻(xiàn)1、2)。

至2000年左右，園藝上流通的品種無非存在，主要從此“alicedupont”及其自然突變的枝代替品種或放任受粉而得的實(shí)生株挑選的品種、或者仍來歷不明的紅花飄香藤(mandevillasanderi)及其枝代替或由放任受粉的實(shí)生株挑選品種、或者以野生種原樣的白花飄香藤(mandevillalaxa)(chileanjasmine)或玻利維亞飄香藤(mandevillaboliviensis)(參照以下專利文獻(xiàn)1)。

三得利花(株)于1998年銷售了大輪開類型“白色”(mandevillaamabilisxboliviensis'sunmandeho'、品種注冊申請第8721號)(參照以下專利文獻(xiàn)2)。

另外，三得利花(株)于2003年銷售了相同大輪開類型“粉色”(mandevillahybrida'sunmandecos'、品種注冊申請第14756號)(參照以下專利文獻(xiàn)4)。

三得利花(株)于2005年銷售了蔓開類型“紅色”(madevillahybrida'sunmanderemi')(參照以下專利文獻(xiàn)5、品種注冊申請第15862號)、“熱帶桃紅色”(mandevillahybrida'sunmandetomi')(參照以下專利文獻(xiàn)6、品種注冊申請第15863號)，銷售了蔓開類型“粉紅色”(sunparagropi)(品種注冊申請第24471號)、蔓開類型“紅天鵝絨”(mandevillahybrida‘sunpararenga’)(參照以下專利文獻(xiàn)14、品種注冊申請第23333號)、及蔓開類型(在海外稱為pretty類型)“sundavilleprettyrose”(mandevillahybrida'sunparaprero')(參照以下專利文獻(xiàn)15)。

三得利花(株)于2007年銷售了大輪開“深紅王”(mandevillahybrida'sunmandecrikin')(參照以下專利文獻(xiàn)7、品種注冊申請第17409號)。

三得利花(株)在同年銷售了早開類型“深紅”(mandevillahybrida'sunmandecrim')(參照以下專利文獻(xiàn)3、品種注冊申請第14755號)。

三得利花(株)也銷售了早開類型“胭脂紅”(mandevillahybrida'sunmandecripi')(參照以下專利文獻(xiàn)8、品種注冊申請第23604號)、“乳粉色”(mandevillahybrida'sunparapibra')(參照以下專利文獻(xiàn)9、品種注冊申請第24470號))。

上述大輪開“深紅王”和早開類型“深紅”是從前沒有的真紅的飄香藤，隨著這些新品種的登場，市場開始擴(kuò)大，三得利花(株)的各競爭公司也開始育種飄香藤。

在以下的專利文獻(xiàn)10(受讓人、syngentaparticipationsag)中記載了使與專利文獻(xiàn)3中記載的早開類型“深紅”相同的在法國作為'sundaville'(注冊商標(biāo))red,'moulinrouge'提供的品種作為母體、使專利文獻(xiàn)1中記載的作為'helle'記載的作為'myfairlady'tm提供的品種作為父體交配而得的被稱為mandevillasanderi(hemsl.)woodson'fisrixpinka'的新品種。

在專利文獻(xiàn)11～13(受讓人、floraquestpty.ltd.、及protectedplantpromotionsaustraliapty.ltd.)中記載了使以編號x02.5識別的mandevillahybrida作為母體、專利文獻(xiàn)3中記載的早開類型“深紅”(mandevillahybrida'sunmandecrim')作為父體交配而得的被稱為mandevillahybrida'ginger'的新品種。

【現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)】

【專利文獻(xiàn)】

【專利文獻(xiàn)1】美國植物專利第9117號公報

【專利文獻(xiàn)2】美國植物專利第11556號公報

【專利文獻(xiàn)3】美國植物專利第15539號公報

【專利文獻(xiàn)4】美國植物專利第15202號公報

【專利文獻(xiàn)5】美國植物專利第16449號公報

【專利文獻(xiàn)6】美國植物專利第16363號公報

【專利文獻(xiàn)7】美國植物專利第17736號公報

【專利文獻(xiàn)8】美國植物專利第18578號公報

【專利文獻(xiàn)9】美國植物專利第19649號公報

【專利文獻(xiàn)10】美國植物專利第20644號公報

【專利文獻(xiàn)11】美國植物專利第20776號公報

【專利文獻(xiàn)12】美國植物專利第20777號公報

【專利文獻(xiàn)13】美國植物專利第20919號公報

【專利文獻(xiàn)14】美國植物專利第20542號公報

【專利文獻(xiàn)15】美國植物專利第19399號公報

【非專利文獻(xiàn)】

【非專利文獻(xiàn)1】thenewyorkbotanicalgardenillustratedencyclopediaofhorticulture,vol.6,p.2129-2130,garlandpublishing,inc.(1981)

【非專利文獻(xiàn)2】mbberley'splant-book,thirdedition,p.520,cambridgeuniversitypress(2008)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

【發(fā)明要解決的技術(shù)課題】

飄香藤屬植物的銷售品種以往僅是有白色、粉色、紅色的花色的品種。存在有黃色的花色的野生種，近年雖也有黃色的花色的品種(opalecitrine)在賣，但由于這些無法與有白色、粉色、紅色系的花色的品種雜交，以有黃色的花色的品種作為交配親本的雜交植物至今尚未制出。因此，還未能實(shí)現(xiàn)有黃色的花色的品種與以往的有白色～粉色～紅色系的花色(在ciel*a*b*表色系中，0～60的a*值、及0～40的b*值的花色)的品種雜交產(chǎn)生的新的色表現(xiàn)。本發(fā)明要解決的課題在于提供以往未能制出的有新的色調(diào)的花色的新飄香藤屬植物。

【解決課題的技術(shù)方案】

本發(fā)明人，此番，在將紅色品種與白色品種交配的實(shí)生株之中取得具有特別的色調(diào)的系統(tǒng)09m111-1，在進(jìn)行花瓣的色素分析時，發(fā)現(xiàn)雖然微量但有特有的類胡蘿卜素色素。令人驚訝地，當(dāng)使該有特有的類胡蘿卜素色素的飄香藤屬植物與有白色、粉色、紅色系的花色的飄香藤屬植物的品種交配時，得到雜交種子，由此成功制出以往未能制出的有新的色調(diào)的花色的雜交植物。

具體而言，本發(fā)明如下。

[1]花瓣中含至少1種以上的類胡蘿卜素色素的飄香藤屬植物，其特征在于，上述類胡蘿卜素色素是新葉黃素或其衍生物。

[2][1]所述的飄香藤屬植物，其特征在于，上述類胡蘿卜素色素是二肉豆蔻酸新葉黃素、3-o-肉豆蔻酸-3’-o-棕櫚酸新葉黃素、3-o-棕櫚酸-3’-o-肉豆蔻酸新葉黃素、二棕櫚酸新葉黃素或這些的組合。

[3]花瓣中含至少1種以上的類胡蘿卜素色素的飄香藤屬植物，其特征在于，上述類胡蘿卜素色素是相當(dāng)于圖1、2及5所示的層析譜中的峰a、峰c或峰d的化合物。

[4]飄香藤屬植物，其中花瓣中含新葉黃素合酶。

[5][1]～[4]之任一項(xiàng)所述的飄香藤屬植物，其特征在于，在ciel*a*b*表色系中，有-10～70的a*值、及0～80的b*值的花色。

[6][5]所述的飄香藤屬植物，其中在ciel*a*b*表色系中，有0～30的a*值、及0～5的b*值的花色以外的花色。

[7][1]～[4]之任一項(xiàng)所述的飄香藤屬植物，其中在ciel*a*b*表色系中，有-5～20的a*值、及3～70的b*值的花色、或者50～70的a*值、及5～70的b*值的花色。

[8][1]～[7]之任一項(xiàng)所述的飄香藤屬植物，其中每1g新鮮花瓣含0.02mg以上的花青苷色素。

[9][8]所述的飄香藤屬植物，其中上述花青苷色素是花青素。

[10]飄香藤屬植物，其為09m111-1(保藏號：fermbp-22298)。

[11][1]～[10]之任一項(xiàng)所述的飄香藤屬植物的后代。

[12][1]～[10]之任一項(xiàng)所述的飄香藤屬植物或其后代的營養(yǎng)繁殖體、植物體的一部分、組織、或者細(xì)胞。

[13][1]～[10]之任一項(xiàng)所述的飄香藤屬植物或其后代的切花、或者由該切花制成的加工品。

[14]能與有白色～粉色～紅色(在ciel*a*b*表色系中，0～60的a*值、及0～40的b*值的花色)的花瓣的飄香藤屬植物雜交的、花瓣中含類胡蘿卜素色素的親本飄香藤屬植物的選定方法，其特征在于，

在候選飄香藤屬植物的花瓣中，作為類胡蘿卜素色素存在新葉黃素或其衍生物時，選定為親本飄香藤屬植物。

[15][14]所述的方法，其特征在于，上述類胡蘿卜素色素是二肉豆蔻酸新葉黃素、3-o-肉豆蔻酸-3’-o-棕櫚酸新葉黃素、3-o-棕櫚酸-3’-o-肉豆蔻酸新葉黃素、二棕櫚酸新葉黃素或這些的組合。

[16]能與有白色～粉色～紅色(在ciel*a*b*表色系中，0～60的a*值、及0～40的b*值的花色)的花瓣的飄香藤屬植物雜交的、花瓣中含類胡蘿卜素色素的親本飄香藤屬植物的選定方法，其特征在于，

在候選飄香藤屬植物的花瓣中，作為類胡蘿卜素色素存在相當(dāng)于圖1、2及5所示的層析譜中的峰a、峰c或峰d的化合物時，選定為親本飄香藤屬植物。

[17]能與有白色～粉色～紅色(在ciel*a*b*表色系中，0～60的a*值、及0～40的b*值的花色)的花瓣的飄香藤屬植物雜交的親本飄香藤屬植物的選定方法，其特征在于，

在候選飄香藤屬植物的花瓣中存在新葉黃素合酶時，選定為親本飄香藤屬植物。

[18][14]～[17]之任一項(xiàng)所述的方法，其中在ciel*a*b*表色系中，測定候選飄香藤屬植物的花瓣的色調(diào)，在a*值是-10～70，并且b*值是0～80時，選定為親本飄香藤屬植物。

[19][18]所述的方法，其中上述a*值是0～30，并且b*值是0～5時，從親本飄香藤屬植物的選定除外。

[20][14]～[17]之任一項(xiàng)所述的方法，其中在ciel*a*b*表色系中，測定候選飄香藤屬植物的花瓣的色調(diào)，在a*值是-5～20，并且b*值是3～70時，或者a*值是50～70，并且b*值是5～70時，選定為親本飄香藤屬植物。

[21][14]～[20]之任一項(xiàng)所述的方法，其中測定候選飄香藤屬植物的花瓣中的花青苷色素的量，在每1g新鮮花瓣含0.02mg以上的花青苷色素時，選定為親本飄香藤屬植物。

[22][21]所述的方法，其中上述花青苷色素是花青素。

[23][14]～[22]之任一項(xiàng)所述的方法，其中作為親本飄香藤屬植物選定09m111-1(保藏號：fermbp-22298)。

[24]產(chǎn)生在ciel*a*b*表色系中有-10～70的a*值、及0～80的b*值的花色(例如，黃色～杏黃色～橙色、特別，象牙色、淺黃色、黃色、杏黃色、橙粉色、橙紅色、橙色)的花瓣的飄香藤屬植物的方法，其包括：

由[14]～[23]之任一項(xiàng)所述的方法選定第1飄香藤屬親本植物的工序、及

使選定的第1飄香藤屬親本植物和第2飄香藤屬親本植物雜交的工序。

[25][24]所述的方法，其中上述第2飄香藤屬親本植物有白色～粉色～紅色(在ciel*a*b*表色系中，0～60的a*值、及0～40的b*值的花色)的花瓣。

【發(fā)明效果】

由本發(fā)明使得通過至今未能雜交的有白色～粉色～紅色系的花色的飄香藤屬植物的品種與具有黃色色素的品種的雜交，制作有以往不存在的新的色調(diào)的花瓣的新的飄香藤屬植物變得可能。

【附圖說明】

【圖1】是本發(fā)明的飄香藤屬植物(4990)花瓣的丙酮提取物的hplc-pda(450nm)的層析譜。

【圖2】是本發(fā)明的飄香藤屬植物(09m111-1)花瓣的丙酮提取物的hplc-pda(450nm)的層析譜。

【圖3】是以往的飄香藤屬植物(opalecitrine)花瓣的丙酮提取物的hplc-pda(450nm)的層析譜。

【圖4】是本發(fā)明的飄香藤屬植物品種與既有的飄香藤屬植物品種的花色的分光測色計(jì)數(shù)據(jù)。

【圖5】是本發(fā)明的飄香藤屬植物(09m111-1)及既有的飄香藤屬植物(opalecitrine)的hplc-pda(450nm)的層析譜。

【圖6】是在本發(fā)明的飄香藤屬植物(09m111-1)的hplc-pda(450nm)層析譜中觀察到的峰的表觀吸收光譜。

【圖7】是本發(fā)明的飄香藤屬植物(09m111-1)的¹h-nmr光譜(5.3-6.9ppm)。

【圖8】是既有的飄香藤屬植物(opalecitrine)的¹h-nmr光譜(5.3-6.9ppm)。

【圖9】是本發(fā)明的飄香藤屬植物(09m111-1)的高分解能質(zhì)量提取離子層析譜((a)m/z1021.81-1021.83；(b)m/z1049.84-1049.86；(c)m/z1077.87-1077.89)。

【圖10】是既有的飄香藤屬植物(opalecitrine)的高分解能質(zhì)量提取離子層析譜((a)m/z1021.81-1021.83；(b)m/z1049.84-1049.86；(c)m/z1077.87-1077.89)。

【圖11】是既有的飄香藤屬植物(opalecitrine)的高分解能質(zhì)量提取離子層析譜((a)m/z1005.82-1005.83；(b)m/z1033.85-1033.87；(c)m/z1061.88-1061.90)。

【實(shí)施方式】

在本發(fā)明的第1實(shí)施方式中，提供花瓣中含至少1種以上的類胡蘿卜素色素的飄香藤屬植物，其特征在于，上述類胡蘿卜素色素是相當(dāng)于圖1、2及5所示的層析譜中的峰a、峰c或峰d的化合物。

類胡蘿卜素色素是顯示黃色、橙色、紅色等的天然色素的一組，至今從動植物單離－鑒定出極多種類的類胡蘿卜素。類胡蘿卜素作為有一般8個異戊二烯單位鍵合而構(gòu)成的化學(xué)式c40h56的基本骨架的萜類的一種被知，被分類為四萜。類胡蘿卜素由其分子結(jié)構(gòu)中的共價雙鍵，在400～500nm之間顯示具有極大的不同的吸收光譜，由此，呈現(xiàn)黃色～橙色～紅色的色。

本發(fā)明人經(jīng)進(jìn)一步銳意探討的結(jié)果，成功鑒定出相當(dāng)于這些的峰的化合物，得到相當(dāng)于這些峰的化合物有新葉黃素的基本骨架的驚人的見解。

從而，在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，提供花瓣中含至少1種以上的類胡蘿卜素色素的飄香藤屬植物，其特征在于，上述類胡蘿卜素色素是新葉黃素或其衍生物。

新葉黃素是植物激素脫落酸的生物合成中的中間體，從堇黃素由新葉黃素合酶合成，有以下的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

【化1】

新葉黃素及堇黃素均是類胡蘿卜素來源的黃色的色素的葉黃素的一種，但如下述的實(shí)施例所示，堇黃素衍生物在既有的飄香藤屬植物(opalecitrine)中也存在，與此相比，新葉黃素衍生物僅在本發(fā)明的飄香藤屬植物(09m111-1)中存在，這是極其意外的。

作為新葉黃素衍生物，例如，可舉出新葉黃素的脂肪酸酯。作為形成脂肪酸酯的脂肪酸，例如，可舉出酪酸、纈草酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、珠光脂酸、硬脂酸、油酸、異油酸、亞油酸、亞麻酸、桐酸、花生酸、米德酸、花生四烯酸、山崳酸、木蠟酸、神經(jīng)酸、蠟酸、褐煤酸、蜜蠟酸等，但不限于這些。新葉黃素衍生物優(yōu)選為新葉黃素的3位及3’位的羥基上各自結(jié)合脂肪酸的新葉黃素二酯，特別優(yōu)選為，二肉豆蔻酸新葉黃素、3-o-肉豆蔻酸-3’-o-棕櫚酸新葉黃素、3-o-棕櫚酸-3’-o-肉豆蔻酸新葉黃素、二棕櫚酸新葉黃素。

另外，本發(fā)明的飄香藤屬植物因?yàn)樵诨ò曛泻氯~黃素或其衍生物作為類胡蘿卜素色素，考慮含作為與其生物合成相關(guān)的酶，新葉黃素合酶。新葉黃素合酶是向堇黃素導(dǎo)入丙二烯基而將其轉(zhuǎn)變?yōu)樾氯~黃素的酶，以堇黃素作為底物而生成新葉黃素。從而，在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，提供花瓣中含新葉黃素合酶的飄香藤屬植物。

本發(fā)明的飄香藤屬植物也可在ciel*a*b*表色系中有-10～70的a*值、及0～80的b*值的花色。此時，適宜地，有0～30的a*值、及0～5的b*值的花色以外的花色。最適地，有-5～20的a*值、及3～70的b*值的花色、或者50～70的a*值、及5～70的b*值的花色。

ciel*a*b*表色系是在國際照明委員會(cie)標(biāo)準(zhǔn)化的表色系，作為表示色調(diào)的表示法廣泛被知，也被稱為cie1976(l*a*b*)表色系。在l*a*b*表色系中，亮度用l*表示，進(jìn)而顯示色相和彩度的色度用a*和b*表示。a*和b*各自表示色的方向，a*表示紅色方向、-a*表示綠色方向、b*表示黃色方向、進(jìn)而-b*表示藍(lán)色方向。l*、a*及b*的各值可由三刺激值x、y、z根據(jù)以下的等式得出。

l*＝116(y/y0)^1/3-16；

a*＝500[(x/x0)^1/3-(y/y0)^1/3]；及

b*＝200[(y/y0)^1/3-(z/z0)^1/3]

但是，x/x0、y/y0及z/z0是>0.008856，式中，x0、y0及z0表示標(biāo)準(zhǔn)光源的三刺激值。

再者2個不同的色、l*1、a*1及b*1和l*2、a*2及b*2的色差δe可由以下式求出。

δe＝√(l*2-l*1)²+(a*2-a*1)²+(b*2-b*1)²

利用ciel*a*b*表色系的色的解析可由積分球型的分光測色計(jì)簡便地進(jìn)行，例如可使用市售的分光光度計(jì)(cm-2022,柯尼卡美能達(dá))。

另外，本發(fā)明的飄香藤屬植物每1g新鮮花瓣可含0.02mg以上的花青苷色素，適宜地含0.05mg以上、最適0.07mg以上的花青苷色素。

花青苷色素已知在植物中含有，呈紅色、藍(lán)色、紫色的花色。根據(jù)作為苷元的花青素部位的b環(huán)的羥基的數(shù)，被分類為天竺葵色素、花青素及飛燕草素的3系。已知顯色團(tuán)在苷元部分，天竺葵色素呈鮮紅色、花青素呈紅紫色、飛燕草素呈紫紅色。本發(fā)明的飄香藤屬植物中所含的主要的花青苷色素是花青素。

本發(fā)明的飄香藤屬植物只要滿足上述要件，就不特別限定，但適宜地可舉出以09m111-1、及09m111-1作為親本植物的雜交植物。09m111-1的培養(yǎng)苗于2015年10月9日基于布達(dá)佩斯條約保藏在獨(dú)立行政法人制品評價技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)(nite)專利生物保藏中心(nite-ipod)(千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8120號室)(保藏號：fermbp-22298)。

本發(fā)明包含上述飄香藤屬植物的后代。這樣的后代優(yōu)選有與上述飄香藤屬植物相同的期望的表征。本發(fā)明也包含上述飄香藤屬植物或其后代的營養(yǎng)繁殖體(插枝、種子等)、植物體的一部分(花、莖、枝、葉、根等)、組織、或者細(xì)胞。再者，本發(fā)明也包含上述飄香藤屬植物或其后代的切花、或者由該切花制成的加工品。

在本發(fā)明的第2實(shí)施方式中，提供能與有白色～粉色～紅色的花瓣的飄香藤屬植物雜交的、花瓣中含類胡蘿卜素色素的親本飄香藤屬植物的選定方法，其特征在于，從候選飄香藤屬植物的花瓣提取類胡蘿卜素色素，在該類胡蘿卜素色素提取液中，作為類胡蘿卜素色素存在相當(dāng)于圖1、2及5所示的層析譜中的峰a、峰c或峰d的化合物(具體而言，上述新葉黃素或其衍生物)、或者新葉黃素合酶時，選定為親本飄香藤屬植物。新葉黃素合酶的確認(rèn)可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的方法、例如，由pcr法的新葉黃素合酶基因的鑒定或由質(zhì)譜分析的新葉黃素合酶的直接的鑒定實(shí)施。

飄香藤屬植物花的結(jié)構(gòu)特殊，通過人為的受粉的人工交配在技術(shù)上難。盡管存在約130種以上的原種，但園藝上利用的不過10數(shù)種。因此，盡管存在有黃色的花色的野生種，但以有黃色的花色的以往的品種作為交配親本的雜交飄香藤屬植物以往未能制出，未能實(shí)現(xiàn)有黃色的花色的飄香藤品種與以往的有白色～粉色～紅色系的花色的飄香藤品種的雜交產(chǎn)生的新的色表現(xiàn)。但是，通過本發(fā)明的方法變得作為親本植物容易地選定能與有白色～粉色～紅色的花瓣的飄香藤屬植物雜交的，有類胡蘿卜素系的花色的飄香藤屬植物。

在上述本發(fā)明的親本飄香藤屬植物的選定方法中，在ciel*a*b*表色系中，測定候選飄香藤屬植物的花瓣的色調(diào)，在a*值是-10～70，并且b*值是0～80時，也可選定為親本飄香藤屬植物。此時，適宜地，a*值是0～30，并且b*值是0～5時，從親本飄香藤屬植物的選定除外。最適地，在ciel*a*b*表色系中，測定候選飄香藤屬植物的花瓣的色調(diào)，在a*值是-5～20，并且b*值是3～70時，或者a*值是50～70，并且b*值是5～70時，選定為親本飄香藤屬植物。

另外，在上述本發(fā)明的親本飄香藤屬植物的選定方法中，測定候選飄香藤屬植物的花瓣中的花青苷色素的量，每1g新鮮花瓣含0.02mg以上、適宜地0.05mg以上、最適地0.07mg以上的花青苷色素時，也可選定為親本飄香藤屬植物。花青苷色素適宜地是花青素。

親本飄香藤屬植物只要是在上述本發(fā)明的選定方法中得到的，就不特別限定，但適宜地可舉出，以09m111-1、及09m111-1作為親本植物的雜交植物。

再者，本發(fā)明也包括用于產(chǎn)生花瓣中含類胡蘿卜素色素的飄香藤屬植物的方法，其包括：通過上述本發(fā)明的親本飄香藤屬植物的選定方法，選定第1飄香藤屬親本植物的工序、及使上述第1飄香藤屬親本植物和第2飄香藤屬親本植物雜交的工序。

第2飄香藤屬親本植物只要能與第1飄香藤屬親本植物雜交，就不特別限制，但優(yōu)選為有白色～粉色～紅色的花瓣的飄香藤屬植物。例如，可舉出大輪開“深紅王”(mandevillahybrida'sunmandecrikin')、大輪開類型“白色”(mandevillaamabilisxboliviensis'sunmandeho')及蔓開類型“熱帶桃紅色”(mandevillahybrida'sunmandetomi')。

雜交通過自然交配或人工交配進(jìn)行。在飄香藤屬植物中，種子的成熟期間是6個月左右，這相比通常的植物非常地長，所以，交配后，在種子成熟至某種程度的期間、不切斷該花柱而維持變得重要。

由本發(fā)明能制出有以往未能制出的新的色調(diào)、特別是黃色～杏黃色～橙色(例如，象牙色、淺黃、黃、杏黃色、橙粉色、橙紅、橙)的花色的新飄香藤屬植物。

【實(shí)施例】

【例1.飄香藤屬植物的制出】

于2009年5月在三得利花(株)全球繁殖&資源中心(東近江市)溫室內(nèi)實(shí)施作為交配用原料而以三得利花(株)保有的花色紅色的品種mr-7(其后枯死)作為母本、以花色白色的sunparasol純白(注冊品種名：sunparacoho)作為父本的交配。于2009年11月收獲交配種子。于2009年11月在溫室內(nèi)播種。自發(fā)芽的實(shí)生株挑選生長良好的100株，移植到9cm罐，在夜最低16℃管理的溫室內(nèi)育苗之后，于2010年5月移植到18cm罐，在三得利花(株)全球繁殖&資源中心內(nèi)的室外田地進(jìn)行栽培試驗(yàn)。于2010年9月以花色的新穎性、生長力、耐暑性作為指標(biāo)挑選開花株，挑選具有杏黃色的花色(l*＝81.8、a*＝11.7、b*＝28.3)的09m111-1。

于2010年10月在三得利花(株)全球繁殖&資源中心溫室內(nèi)實(shí)施09m111-1的自交交配。于2011年5月收獲自交種子。于2011年11月在溫室內(nèi)播種。從發(fā)芽的實(shí)生株挑選生長良好的100株，移植到9cm罐，在夜最低16度管理的溫室內(nèi)育苗之后，于2012年5月移植到18cm罐，在三得利花(株)室外田地進(jìn)行栽培試驗(yàn)。于2012年9月從開花株挑選以花色作為指標(biāo)而強(qiáng)列示黃色味的個體09m111-1self-1。其后，于2013年5月在三得利花(株)全球繁殖&資源中心溫室內(nèi)實(shí)施以09m111-1作為母本、以09m111-1self-1作為父本的交配。于2013年11月收獲交配種子。于2013年11月在溫室內(nèi)播種。從發(fā)芽的實(shí)生株挑選生長良好的100株、移植到9cm罐，在夜最低16度管理的溫室內(nèi)育苗之后，于2014年5月移植到18cm罐，在三得利花(株)全球繁殖&資源中心內(nèi)的室外田地進(jìn)行栽培試驗(yàn)。于2014年9月從開花株以花色的新穎性、生長力、耐暑性作為指標(biāo)挑選，挑選具有黃色的花色(l*＝82.4、a*＝8.6、b*＝48.0)的#4990。

于2013年5月，在三得利花(株)全球繁殖&資源中心內(nèi)的室外田地，使09m111-1self-1和花瓣花青素含量高的多個紅色系接近配置，實(shí)施放任授粉。于2013年11月收獲以09m111-1self-1作為母本的結(jié)實(shí)種子。于2013年11月在溫室內(nèi)播種。從發(fā)芽的實(shí)生株挑選生長良好的100株，移植到9cm罐，在夜最低16度管理的溫室內(nèi)育苗之后，于2014年5月移植到18cm罐，在三得利花(株)室外田地管理。于2014年9月從開花株以花色的新穎性、生長力、耐暑性作為指標(biāo)挑選，挑選具有橙紅的花色(l*＝36.2、a*＝54.0、b*＝41.4)的#4891。

【例2.類胡蘿卜素色素的分析】

作為飄香藤屬植物品種，對于4990、09m111-1及opalecitrine的花瓣中的類胡蘿卜素色素，如以下一樣進(jìn)行而作為含有成分的定量。

通過能利用可良好地分析黃色色素的光電二極管陣列檢測器(pda)的檢測的高效液相層析分離-pda系統(tǒng)(hplc-pda)進(jìn)行定量分析。

檢液的調(diào)制方法是，在玻璃瓶中秤量進(jìn)行冷凍干燥處理的干燥花瓣5mg，添加丙酮0.5ml，于25℃用超聲波清洗器(asone,as52gtu)進(jìn)行20分鐘超聲波照射而進(jìn)行黃色色素成分的提取操作。通過將提取黃色色素成分的上清0.3ml用細(xì)孔尺寸0.45μm的濾器(nacalaitesque、cosmonice濾器s(溶劑系統(tǒng)))過濾而進(jìn)行hplc-pda的檢液。

高效液相層析分離-光電二極管陣列檢測器(hplc-pda)的機(jī)器構(gòu)成是，送液單位lc泵使用nexeralc-30ad(島津制作所)、pda檢測器使用prominencespd-m20a(島津制作所)，分離柱使用develosilc30-ug-32.0×100mm(野村化學(xué))。lc移動相的送液是，移動相a使用甲醇/水(80/20,vol/vol)、移動相b使用t-丁基甲基醚/甲醇/水(78/20/2,vol/vol/vol)，使二元梯度經(jīng)15分鐘將移動相b濃度從0％變化為100％，以0.4ml/分的流速而進(jìn)行。注入10μl從花瓣提取的檢液。

pda檢測器的吸光度測定在200-800nm的范圍內(nèi)進(jìn)行，特別關(guān)注了作為黃色系的補(bǔ)色的藍(lán)色系的吸收帶440-490nm。定量值使用從450nm的lc-pda得到的各峰的吸光度。

結(jié)果示于圖1～圖3。

【例3.類黃酮的分析】

采集飄香藤的花瓣后，冷凍干燥，用含有0.1％三氟醋酸(tfa)的50％乙腈(v/v)從花瓣提取類黃酮。其中分取0.2ml而使其干燥之后，溶解于6nhcl0.2ml，通過于100℃處理20分鐘而得到花青素。將其用0.2ml的1-戊醇提取，供試于hplc分析。使用ods-a312柱(15cm_6mm；ymc)，用等度溶劑(acoh：meoh：h2o,15：20：65,v/v/v)，以1ml/1分鐘流速進(jìn)行分析。

接下來，如上述調(diào)整的花瓣提取液之中，分取200μl而干燥后，溶解于含6單位的β-葡萄糖苷酶(sigma,st.louis,mo,usa)及1單位的柚皮苷酶(sigma)的0.1m磷酸鉀緩沖液0.2ml而于30℃處理16小時，由酶解得到黃酮醇。向其中加含有0.1％tfa的90％(v/v)乙腈200μl，停止反應(yīng)后，供試于hplc分析。用shim-packfc-ods柱(15cm_4.6mm；島津制作所)，以0.6ml/分流速，使用溶劑a(h2o：tfa,99.9：0.1,v/v)及溶劑b(h2o：乙腈：tfa,9.9：90：0.1,v/v)進(jìn)行分析。梯度分析的條件如下。

0分：溶劑b20％

0-10分鐘：溶劑b70％

10-16分鐘：溶劑b70％

16-17分鐘：溶劑b20％

17-28分鐘：溶劑b20％

使用光電二極管陣列檢測器(spd-m20a,島津制作所)，以250-400nm的吸光度檢測花青素及黃酮醇。

結(jié)果示于以下的表。

【表1】

【例4.色彩測定】

利用分光光度計(jì)(cm2022、美能達(dá))，使用d65照明測定本發(fā)明中制出的品種及既有的品種的花冠平開部的色彩值。測定值根據(jù)ciel*a*b*表色系(c.i.e.，1986；gonnet·hieu,1992；mclaren,1976)數(shù)值化。對于各品種測定3個個別的花，將其平均值作為代表值。用以色度a*、b*作為坐標(biāo)軸的分布圖2維地顯示花色的分布，確認(rèn)每色組的分布。

結(jié)果示于圖4。

【例5.黃色色素的分析】

通過09m111-1與opalecitrine的比較實(shí)施特征性的黃色色素成分的解析。

賦于本發(fā)明中的花瓣特征的黃色色素成分的結(jié)構(gòu)解析如下所述，基于(i)利用高效液相層析(hplc)-光電二極管陣列檢測器(pda)的吸收光譜、(ii)質(zhì)子核磁共振光譜(¹h-nmr)及(iii)高分解能質(zhì)譜分析光譜(hrms)進(jìn)行。

(i)利用高效液相層析(hplc)-光電二極管陣列檢測器(pda)的黃色色素成分的檢測

利用聯(lián)機(jī)分離和可取得紫外可見光光度數(shù)據(jù)的高效液相層析-光電二極管陣列檢測器(hplc-pda)，取得含有數(shù)種的黃色色素成分的吸收光譜。pda有必要得到呈現(xiàn)黃色系的400～500nm的范圍的吸收光譜。實(shí)際的pda數(shù)據(jù)的取得在200～800nm的范圍進(jìn)行。

檢液的調(diào)制方法是在玻璃瓶中秤量進(jìn)行冷凍干燥處理的干燥花瓣各自5.0mg，作為提取溶劑添加丙酮0.5ml、其后用超聲波清洗器(asone,as52gtu)于25℃的設(shè)定溫度照射超聲波20分鐘而進(jìn)行黃色色素成分的提取。檢液是將提取黃色色素成分的上清液0.3ml用細(xì)孔尺寸0.45μm的濾器(nacalaitesque、cosmonice濾器s(溶劑系統(tǒng)))進(jìn)行過濾。

作為hplc的條件，分離柱優(yōu)選使用將十八烷基(c18)及三十基(c30)化學(xué)修飾的逆相系統(tǒng)柱、移動相優(yōu)選使用在300nm～600nm的范圍不成為吸收光譜的妨礙的叔-丁基甲基醚/甲醇/水系的混合溶液。

hplc-pda的機(jī)器構(gòu)成是，送液單位lc泵使用nexeralc-30ad(島津制作所)、pda檢測器使用prominencespd-m20a(島津制作所)，分離柱使用develosilc30-ug-3(2.0×100mm)(野村化學(xué))。lc移動相的送液是，移動相a使用甲醇/水(80/20vol/vol)、移動相b使用叔-丁基甲基醚/甲醇/水(78/20/2vol/vol/vol)，使二元梯度經(jīng)15分鐘將移動相b濃度從0％變化為100％，以0.4ml/分流速進(jìn)行。分析中注入10μl花瓣提取液。

圖5顯示09m111-1及opalecitrine的pda450nm的層析譜。

比較光譜，得知圖中的峰a(保持時間12.0分鐘)、峰c(保持時間12.2分鐘)、峰d(保持時間12.4分鐘)的峰含在09m111-1中，但未含在opalecitrine中。將對應(yīng)于峰的用pda檢測器取得的吸收光譜示于圖6。在全部的峰的表觀吸收光譜中，在類胡蘿卜素化合物中觀測到特征性的3條的峰(419,443,470nm)。由3條的吸收極大波長，這些被推定為在骨架上具有α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素、堇黃素、新葉黃素等的類胡蘿卜素及它們的酯體。

(ii)黃色色素的¹h-nmr分析

為了進(jìn)行圖5中在09m111-1中特征性地見到的峰a、c、d的類胡蘿卜素骨架的化學(xué)結(jié)構(gòu)確定，進(jìn)行給出多種化學(xué)結(jié)構(gòu)信息的¹h-nmr測定。

為了得到對于¹h-nmr測定必要的樣品量1mg左右，需要干燥花瓣3g左右，需要濃縮操作等。類胡蘿卜素由于容易發(fā)生異構(gòu)化或氧附加等的反應(yīng)，在二丁基羥基甲苯(bht)等的氧附加防止劑的存在下、樣品保存優(yōu)選在氮封入遮光條件下進(jìn)行。另外，一般而言，類胡蘿卜素的¹h-nmr測定多在重氯仿中進(jìn)行，但重氯仿分解會生成鹽酸，從而有時酸不穩(wěn)定的c-5,6環(huán)氧類胡蘿卜素被酸變化為c-5,8環(huán)氧基。由于09m111-1及opalecitrine均在重氯仿中變色，得知含有環(huán)氧化葉黃素或堇黃素、新葉黃素等的c-5,6環(huán)氧類胡蘿卜素。

樣品調(diào)制的詳細(xì)內(nèi)容記載于下述(1)黃色色素成分的提取、(2)利用中壓液相層析的黃色色素級分的分取、(3)由皂化的酯鍵脂肪鏈和三?；视偷某?、(4)溶解于重苯的樣品的分析。

(1)黃色色素成分的提取

將進(jìn)行冷凍干燥處理的干燥花瓣各自2.97g浸漬于含1％二丁基羥基甲苯(bht)的丙酮100ml中，于室溫?cái)嚢?小時而進(jìn)行黃色色素成分的提取。其后，在減壓下進(jìn)行20至ml程度濃縮。

(2)利用中壓液相層析的黃色色素級分的分取

為了從濃縮的待測樣品濃縮黃色色素成分，用中壓液相層析(mplc)進(jìn)行純化。mplc的機(jī)器構(gòu)成是，裝置本體使用smartflashepclcai-580s(山善)、分離柱使用hi-flashods-sm(50μmsizel26×100mm35g)(山善)。lc移動相的送液是，移動相a使用甲醇、移動相b使用丙酮，二元梯度0～3分鐘是，移動相b是40％、其后經(jīng)24分鐘將移動相b濃度設(shè)為100％，以20ml/分流速進(jìn)行?；厥沼^測到450nm的吸收波長的溶出級分18～23分鐘的溶出液、其后干燥。

(3)由皂化的酯鍵脂肪鏈和三?；视偷某?/p>

在上述(1)及(2)的操作中，花瓣中所含有的三?；视突蝾惡}卜素酯的脂肪鏈給由nmr的類胡蘿卜素骨架的解析造成妨礙的信號。由皂化進(jìn)行酯的水解。

皂化是，向在(2)中干燥的樣品加5％koh甲醇10ml，于室溫進(jìn)行反應(yīng)20分鐘。各加10ml水和二氯甲烷，將二氯甲烷層用水及飽和生理鹽水清洗后，于30℃、在減壓下餾去溶劑。進(jìn)而，為了得到高純度的¹h-nmr用樣品而用hplc進(jìn)行純化。hplc純化的條件是，送液單位lc泵使用lc-10a(島津制作所)、uv-vis檢測器使用spd-10a(島津制作所)，分離柱使用capcellpakc18ug120(20×250mm)(資生堂)。lc移動相的送液是將90％乙腈水溶液以10ml/分流速進(jìn)行。一邊觀測uv-vis檢測器、450nm，一邊分級分離可確認(rèn)吸收的范圍的溶出液、進(jìn)行干燥固化而作為¹h-nmr用樣品。

(4)溶解于重苯的樣品的¹h-nmr分析

將皂化處理后的黃色色素成分溶解于重苯而進(jìn)行nmr測定。¹h-nmr數(shù)據(jù)取得用avanceiiihd400(bruker)進(jìn)行。圖7顯示09m111-1的400mhz¹h-nmr光譜的5.3～6.9ppm的范圍的擴(kuò)大圖。呈現(xiàn)了類胡蘿卜素的共價雙鍵的次甲基(＝ch-)的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息。在6.06ppm觀測到特征性的信號。此信號顯示新葉黃素結(jié)構(gòu)圖中的8丙二烯結(jié)構(gòu)(c＝c＝c)的部分結(jié)構(gòu)。一方面，從opalecitrine的nmr光譜(圖8)在6.0～6.1ppm的范圍觀測不到信號，觀測到相當(dāng)于圖8中的7(5.91ppm)、4’(5.53ppm)、7’(5.45ppm)的信號。由此信號推定含有環(huán)氧化葉黃素的可能性。

(iii)由lc-apci-hrms的，酯鏈長的鑒定

為了鑒定相當(dāng)于各自的峰的類胡蘿卜素酯，由精密質(zhì)譜分析測定確定求出的化學(xué)組成。來自花瓣的提取物中由于含有三酰基甘油等的黃色色素以外的化合物、再者數(shù)種的類胡蘿卜素酯，在質(zhì)譜分析上聯(lián)機(jī)結(jié)合液相層析分離忒成為有效的方法。質(zhì)譜分析的離子化法用有類胡蘿卜素的質(zhì)譜分析的報告的大氣壓化學(xué)離子化法(apci)進(jìn)行。質(zhì)量分離部為了與三酰基甘油的質(zhì)量分離或高精度確定化學(xué)組成，用作為得到在分解能60,000以上的質(zhì)量光譜的電場型傅里葉變換型的質(zhì)譜分析計(jì)的orbitrapms進(jìn)行。

精密質(zhì)量的測定中使用的檢液的調(diào)制方法是，在玻璃瓶中秤量進(jìn)行冷凍干燥處理的干燥花瓣各自50.0mg，作為提取溶劑添加丙酮1.0ml、其后，用超聲波清洗器(asone,as52gtu)于25℃的設(shè)定溫度照射超聲波30分鐘，進(jìn)行黃色色素成分的提取操作。檢液是將提取到黃色色素成分的上清液0.3ml用細(xì)孔尺寸0.45μm的濾器(nacalaitesque、cosmonice濾器s(溶劑系統(tǒng)))進(jìn)行過濾。

高效液相層析-大氣壓化學(xué)離子化精密質(zhì)譜分析(hplc-apci-hrms)的機(jī)器構(gòu)成是，送液單位lc泵使用nexeralc-30ad(島津制作所)、分離柱使用develosilc30-ug-3(2.0×100mm)(野村化學(xué))。lc移動相的送液是，移動相a使用甲醇/水(80/20vol/vol)、移動相b使用叔-丁基甲基醚/甲醇/水(78/20/2vol/vol/vol)，使二元梯度經(jīng)15分鐘將移動相b濃度從0％變化為100％，以0.4ml/分流速進(jìn)行。分析中注入10μl花瓣提取液。質(zhì)譜分析部使用設(shè)置apci離子源的orbitrapelitems(thermofisherscientific)。質(zhì)譜分析測定是以正離子測定模式、設(shè)定分解能60,000、在m/z150～2000的范圍進(jìn)行測定。

來自質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)的類胡蘿卜素化合物的鑒定由相當(dāng)于質(zhì)子附加離子的精密質(zhì)量的理論值的離子的質(zhì)量提取離子層析譜進(jìn)行，所述質(zhì)子附加離子的精密質(zhì)量的理論值由在從(i)由hplc-pda的吸收光譜及(ii)用¹h-nmr的解析推測的類胡蘿卜素骨架上修飾月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸等的脂肪酸之時的化學(xué)組成求出。圖9顯示09m111-1、圖10顯示opalecitrine的新葉黃素二酯及同質(zhì)量的堇黃素二酯的脂肪酸相當(dāng)于肉豆蔻酸、棕櫚酸的高分解能質(zhì)量提取離子層析譜(a)m/z1021.81～1021.83(b)m/z1049.84～1049.86(c)m/z1077.87～1077.89。在圖9的09m111-1的層析譜中檢測到二肉豆蔻酸新葉黃素、肉豆蔻酸棕櫚酸新葉黃素、二棕櫚酸新葉黃素、二肉豆蔻酸堇黃素、肉豆蔻酸棕櫚酸堇黃素、二棕櫚酸堇黃素。一方面，在圖10的opalecitrine的高分解能質(zhì)量提取離子層析譜中僅檢測到二肉豆蔻酸堇黃素、肉豆蔻酸棕櫚酸堇黃素、二棕櫚酸堇黃素。

圖11(參考數(shù)據(jù))：opalecitrine的高分解能質(zhì)量提取離子層析譜層析譜、(a)m/z1005.82～1005.83(b)m/z1033.85～1033.87(c)m/z1061.88～1061.90。檢測到的峰相當(dāng)于環(huán)氧化葉黃素二酯。

結(jié)果：通過(i)利用高效液相層析(hplc)-光電二極管陣列檢測器(pda)的吸收光譜、(ii)質(zhì)子核磁共振光譜(¹h-nmr)、(iii)高分解能質(zhì)譜分析光譜(hrms)的結(jié)構(gòu)解析鑒定出，峰a是有組成式c68h108o6的二肉豆蔻酸新葉黃素，峰c是有組成式c70h112o6的3-o-肉豆蔻酸-3’-o-棕櫚酸新葉黃素或3-o-棕櫚酸-3’-o-肉豆蔻酸新葉黃素，進(jìn)而，峰d是有組成式c72h116o6的二棕櫚酸新葉黃素。