本發(fā)明屬于植物繁殖領(lǐng)域，具體涉及一種梅葉冬青組織培養(yǎng)快速繁殖方法。

背景技術(shù)：
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梅葉冬青(Ilex asprella Champ.ex Benth)屬于冬青科冬青屬，落葉灌木，株高可達3米。主要分布于我國浙江、江西、福建、臺灣、湖南、廣東、廣西、香港等地；在菲律賓群島也有分布。多生于海拔400-1000米的山地疏林中或路旁灌叢中。其根、莖、葉均可入藥，味苦、甘、性涼，清熱解毒、生津止渴。為廣東、廣西等嶺南地區(qū)常用中藥，用于感冒、高熱煩渴、扁桃體炎、咽喉炎、氣管炎、百日咳等。梅葉冬青根為王老吉涼茶、沙溪涼茶等的主要原料，嶺南民間也廣泛用梅葉冬青自制涼茶。根據(jù)研究梅葉冬青的葉片含有熊果酸，具有鎮(zhèn)靜、消炎，抗糖尿病、冠心病及心絞痛等效應(yīng)。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對梅葉冬青活性成分和藥理成分的研究深入，其臨床應(yīng)用逐年擴大，梅葉冬青具有廣闊的市場前景和經(jīng)濟效益。

目前，梅葉冬青原料主要來源于野生資源，隨著市場的需求擴大，梅葉冬青自然資源日益枯竭，無法滿足當(dāng)前的市場需求。人工栽培是以后的重要發(fā)展方向。常見的梅葉冬青繁殖技術(shù)主要為種子有性繁殖和枝條扦插繁殖。梅葉冬青種子具有深度休眠、隔年發(fā)芽的特性，其種子發(fā)芽繁殖受到季節(jié)明顯影響。另外，梅葉冬青種子小，其采集費時耗力，且不易儲存。梅葉冬青扦插繁殖，需采集大量當(dāng)年生木質(zhì)化枝條，對梅葉冬青生長存在較大破壞，且在大規(guī)模種植時，易受到材料量的限制。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種育苗繁殖不受時間和原材料數(shù)量的影響，繁殖系數(shù)高，培育時間短，為大規(guī)模的培育梅葉冬青種苗提供技術(shù)保障的梅葉冬青組織培養(yǎng)快速繁殖方法。

本發(fā)明的梅葉冬青組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、選取健康無病蟲害8-12cm的梅葉冬青當(dāng)年新抽帶芽枝條，去除枝條的葉，用酒精棉拭去枝條表面的灰塵并剪成3-5段，每段帶有1-2個休眠芽點的枝段作為外植體；

b、將外植體滅菌，然后將滅菌后的外植體插入初代誘芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)誘導(dǎo)出腋芽或頂芽，培養(yǎng)條件為：1500-2000Lx，24℃-28℃，光照時間12h-14h，黑暗時間12h-10h，培養(yǎng)20-30天，外植體的休眠芽生發(fā)成腋芽或頂芽，萌發(fā)率可達到80％以上，所述的初代誘芽培養(yǎng)基每升含有：1mg ZT(玉米素)、0.05mg NAA(萘乙酸)、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、30g蔗糖，余量為MS培養(yǎng)基，pH 5.8-6.0；

c、將腋芽或頂芽切下，接入不定芽增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)獲得不定芽，培養(yǎng)條件為：1500-2000Lx，24℃-28℃，光照時間12h-14h，黑暗時間12h-10h，所述的不定芽增殖培養(yǎng)基每升含有：1mg 6-BA(6-芐氨基基嘌呤)、0.05mgNAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖，余量為MS培養(yǎng)基，pH 5.8-6.0；增殖培養(yǎng)周期為35-45天，增殖系數(shù)可達到5；

d、將不定芽接入壯苗培養(yǎng)基進行壯苗培養(yǎng)得到無根壯苗，培養(yǎng)條件為：1500-2000Lx，24℃-28℃，光照時間12h-14h，黑暗時間12h-10h，所述的壯苗培養(yǎng)基每升含有：0.1mg 6-BA、0.1mg NAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖，余量為MS培養(yǎng)基，pH 5.8-6.0；

e、將2-3cm高帶有3-5個葉片的無根壯苗接入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到組培苗，培養(yǎng)條件為：1500-2000Lx，24℃-28℃，光照時間12h-14h，黑暗時間12h-10h，所述的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基每升含有：1mg IBA(吲哚乙酸)、0.02g AC(活性炭)、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖，余量為1/2MS培養(yǎng)基，pH 5.8-6.0；培養(yǎng)30-45天，生根率可達到85％以上；

f、將組培苗進行移栽培養(yǎng)；

所述的步驟b的將外植體滅菌優(yōu)選是在無菌操作臺上，將外植體置于體積分數(shù)75％酒精溶液中浸泡30s；移到無菌工作臺上，將酒精消毒的外植體放入錐形瓶中，加入質(zhì)量分數(shù)0.1％的升汞水溶液，滴加1滴吐溫，浸泡10-15min，中間晃動數(shù)次，最后用無菌水沖洗3次，得到滅菌處理的外植體。

所述的移栽培養(yǎng)是待組培苗生根5-10條，根長1-2cm時，將組培苗移到溫度濕度與外界相一致的培養(yǎng)室中，4天后打開瓶蓋，使生出根的組培苗與外界保持較高的接觸，7天后加水取出生根苗，洗凈培養(yǎng)基，用質(zhì)量分數(shù)0.1％高錳酸鉀水溶液浸泡1-3min，移入珍珠巖：蛭石體積比＝3:2的基質(zhì)中。移栽成活率可達到95％以上。

本發(fā)明中的MS培養(yǎng)基是指沒有加瓊脂的液體培養(yǎng)基，其配方屬于本領(lǐng)域的公知常識，所述的1/2MS培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基中大量元素減半，而其他不變的培養(yǎng)基。

與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明實現(xiàn)了野生梅葉冬青組織培養(yǎng)快速繁殖，為野生梅葉冬青組織培養(yǎng)技術(shù)開辟新道路。本發(fā)明的方法操作簡單，易于實施，可一次性培育出大量的梅葉冬青生長幼苗。本發(fā)明能夠有效的縮短育苗時間，且本發(fā)明所用的培養(yǎng)基和試劑易配置，成本低，易大范圍推廣。

具體實施方式：

以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

實施例1：

a、選取健康無病蟲害8－12cm左右的野生梅葉冬青新抽帶芽枝條；去除枝條的雜葉，使用體積分數(shù)75％的酒精棉拭去枝條表面的灰塵并剪成3－5段，每段3cm左右，帶有1-2個休眠芽點，以此枝莖段作為外植體；

b、外植體滅菌：在無菌操作臺上，將上述初步消毒得到的莖段(外植體)置于體積分數(shù)75％酒精溶液中浸泡30s；移到無菌工作臺上，將酒精消毒的莖段放入錐形瓶中，加入質(zhì)量分數(shù)0.1％的升汞水溶液，滴加1滴吐溫，浸泡10-15min，中間晃動數(shù)次，最后用無菌水沖洗3次，得到滅菌處理的外植體；

c、外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)：將經(jīng)滅菌處理的外植體插入初代誘芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：1500Lx，24℃-28℃，光照時間14h，黑暗時間10h，培養(yǎng)20-30天，外植體的休眠芽生發(fā)成腋芽或頂芽，萌發(fā)率可達到80％以上。所述的初代不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+1mg/L ZT+0.05mg/L NAA+6.2g/L瓊脂粉+0.1g/L肌醇+3％蔗糖，pH 5.8-6.0，即所述的初代誘芽培養(yǎng)基每升含有：1mg ZT、0.05mg NAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、30g蔗糖，余量為MS培養(yǎng)基，pH 5.8-6.0，其每升配制方法是將1mg ZT、0.05mg NAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、30g蔗糖加入到少量液體MS培養(yǎng)基中，然后再用液體MS培養(yǎng)基定容到1L，調(diào)pH值至5.8-6.0，滅菌備用。

d、不定芽增殖培養(yǎng)：將上述所得到的長為1cm左右的腋芽或頂芽切下，接入不定芽增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得不定芽，培養(yǎng)條件為：1500Lx，24℃-28℃，光照時間14h，黑暗時間10h，培養(yǎng)35-45天為一個周期，增殖系數(shù)可達到5。所述的不定芽增殖培養(yǎng)基成份為：MS+1mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+6.2g/L瓊脂粉+0.1g/L肌醇+2％蔗糖，pH 5.8-6.0，即所述的不定芽增殖培養(yǎng)基每升含有：1mg 6-BA、0.05mgNAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖，余量為MS培養(yǎng)基，pH 5.8-6.0，其每升配制方法是將1mg 6-BA、0.05mgNAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖加入到少量液體MS培養(yǎng)基中，然后用液體MS培養(yǎng)基定容到1L，調(diào)pH值至5.8-6.0，滅菌備用。

e、壯苗培養(yǎng)：將增殖獲得的不定芽放入壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)30-45天得到無根壯苗，培養(yǎng)條件為：1500Lx，24℃-28℃，光照時間14h，黑暗時間10h。所述的壯苗培養(yǎng)基成份為：MS+0.1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+6.2g/L瓊脂粉+0.1g/L肌醇+2％蔗糖，pH 5.8-6.0，即所述的壯苗培養(yǎng)基每升含有：0.1mg 6-BA、0.1mg NAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖，余量為MS培養(yǎng)基，pH 5.8-6.0，其每升配制方法是將0.1mg 6-BA、0.1mg NAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖加入到少量液體MS培養(yǎng)基中，然后用液體MS培養(yǎng)基定容到1L，調(diào)pH值至5.8-6.0，滅菌備用。

f、分化生根培養(yǎng)：將上述所得到2-3cm高帶有3-5個葉片的無根壯苗接入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)30-45天得到組培苗，生根率可達到85％以上。培養(yǎng)條件為：1500Lx，24℃-28℃，光照時間14h，黑暗時間10h。所述的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基成份為：1/2MS+1mg/L IBA+0.02g/L AC+6.2g/L瓊脂粉+0.1g/L肌醇+2％蔗糖，pH 5.8-6.0，即所述的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基每升含有：1mg IBA、0.02gAC、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖，余量為1/2MS培養(yǎng)基，pH 5.8-6.0，其每升配制方法是將1mg IBA、0.02gAC、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖加入到液體1/2MS培養(yǎng)基中，然后用液體MS培養(yǎng)基定容到1L，調(diào)pH值至5.8-6.0，滅菌備用。

g、移栽培養(yǎng)：待組培苗生根5-10條，根長1-2cm時，將組培苗移到溫度濕度與外界相一致的培養(yǎng)室中，4天后打開瓶蓋，使生根組培苗與外界保持較高的接觸，7天后加水取出生根苗，洗凈培養(yǎng)基；用質(zhì)量分數(shù)0.1％高錳酸鉀水溶液浸泡1-3min，移入珍珠巖：蛭石體積比為3:2的基質(zhì)中培養(yǎng)，由此獲得梅葉冬青小苗。

實施例2：

a、選取健康無病蟲害8－12cm左右的野生梅葉冬青新抽帶芽枝條；去除枝條的雜葉，使用體積分數(shù)75％的酒精棉拭去枝條表面的灰塵并剪成3－5段，每段3cm左右，帶有1-2個休眠芽點，以此處理的枝條作為外植體；

b、外植體滅菌：在無菌操作臺上，將上述初步消毒得到的莖段(外植體)置于體積分數(shù)75％酒精溶液中浸泡30s；移到無菌工作臺上，將酒精消毒的莖段放入錐形瓶中，加入質(zhì)量分數(shù)0.1％的升汞水溶液，滴加1滴吐溫，浸泡10-15min，中間晃動數(shù)次，最后用無菌水沖洗3次，得到滅菌處理的外植體；

c、外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)：將經(jīng)滅菌處理的外植體插入初代誘芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：2000Lx，24℃-28℃，光照時間12hh，黑暗時間12h，培養(yǎng)20-30天，外植體的休眠芽生發(fā)成腋芽或頂芽，萌發(fā)率可達到80％以上。所述的初代不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+1mg/L ZT+0.05mg/L NAA+6.2g/L瓊脂粉+0.1g/L肌醇+3％蔗糖，pH 5.8-6.0，即所述的初代誘芽培養(yǎng)基每升含有：1mg ZT、0.05mg NAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、30g蔗糖，余量為MS培養(yǎng)基，pH 5.8-6.0，其每升配制方法是將1mg ZT、0.05mg NAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、30g蔗糖加入到少量液體MS培養(yǎng)基中，然后再用液體MS培養(yǎng)基定容到1L，調(diào)pH值至5.8-6.0，滅菌備用。

d、不定芽增殖培養(yǎng)：將上述所得到的長為1cm左右的腋芽或頂芽切下，接入不定芽增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得不定芽，培養(yǎng)條件為：2000Lx，24℃-28℃，光照時間12hh，黑暗時間12h，培養(yǎng)35-45天為一個周期，增殖系數(shù)可達到5。所述的不定芽增殖培養(yǎng)基成份為：MS+1mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+6.2g/L瓊脂粉+0.1g/L肌醇+2％蔗糖，pH 5.8-6.0，即所述的不定芽增殖培養(yǎng)基每升含有：1mg 6-BA、0.05mgNAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖，余量為MS培養(yǎng)基，pH 5.8-6.0，其每升配制方法是將1mg 6-BA、0.05mgNAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖加入到少量液體MS培養(yǎng)基中，然后用液體MS培養(yǎng)基定容到1L，調(diào)pH值至5.8-6.0，滅菌備用。

e、壯苗培養(yǎng)：將增殖獲得的不定芽放入壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)30-45天得到無根壯苗，培養(yǎng)條件為：2000Lx，24℃-28℃，光照時間12hh，黑暗時間12h。所述的壯苗培養(yǎng)基成份為：MS+0.1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+6.2g/L瓊脂粉+0.1g/L肌醇+2％蔗糖，pH 5.8-6.0，即所述的壯苗培養(yǎng)基每升含有：0.1mg 6-BA、0.1mg NAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖，余量為MS培養(yǎng)基，pH 5.8-6.0，其每升配制方法是將0.1mg 6-BA、0.1mg NAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖加入到少量液體MS培養(yǎng)基中，然后用液體MS培養(yǎng)基定容到1L，調(diào)pH值至5.8-6.0，滅菌備用。

f、分化生根培養(yǎng)：將上述所得到2-3cm高帶有3-5個葉片的無根壯苗接入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)30-45天得到組培苗，生根率可達到85％以上。培養(yǎng)條件為：2000Lx，24℃-28℃，光照時間12hh，黑暗時間12h。所述的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基成份為：1/2MS+1mg/L IBA+0.02g/L AC+6.2g/L瓊脂粉+0.1g/L肌醇+2％蔗糖，pH 5.8-6.0，即所述的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基每升含有：1mg IBA、0.02gAC、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖，余量為1/2MS培養(yǎng)基，pH 5.8-6.0，其每升配制方法是將1mg IBA、0.02gAC、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖加入到液體1/2MS培養(yǎng)基中，然后用液體MS培養(yǎng)基定容到1L，調(diào)pH值至5.8-6.0，滅菌備用。

g、移栽培養(yǎng)：待組培苗生根5-10條，根長1-2cm時，將組培苗移到溫度濕度與外界相一致的培養(yǎng)室中，4天后打開瓶蓋，使生根組培苗與外界保持較高的接觸，7天后加水取出生根苗，洗凈培養(yǎng)基；用質(zhì)量分數(shù)0.1％高錳酸鉀水溶液浸泡1-3min，移入珍珠巖：蛭石為3:2的基質(zhì)中，由此獲得梅葉冬青小苗。