本發(fā)明涉及藥材的繁殖技術(shù)，具體地說是一種利用胚軸和胚根直接分化不定芽的白術(shù)再生體系。

背景技術(shù)：

白術(shù)( Atractylodes macrocephala Koidz. )屬菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物，干燥根莖，氣清香，味甘苦，性溫，主要產(chǎn)于我國的浙江、湖南、湖北和安徽等地（中國藥典2010），于潛所產(chǎn)品質(zhì)最佳，特稱“于術(shù)”。《神農(nóng)本草經(jīng)》中第一次載有白術(shù)的藥用價值，被列為上品。白術(shù)是我國傳統(tǒng)的中藥之一，其有效化學(xué)成分包括揮發(fā)油和多糖等。揮發(fā)油中主要含有蒼術(shù)醇、蒼術(shù)酮、倍半萜類化合物等。揮發(fā)油、內(nèi)酯等化合物具有較強的生物活性。白術(shù)具有抗腫瘤，促進胃腸運動，調(diào)節(jié)胃腸功能紊亂的作用（陳曉萍等,2011年），具有健脾益氣，抗老年癡呆抗衰老抗氧化，提高免疫力，消炎利尿抗凝血的功效（伍樂芹等,2011年），是“健脾丸”、“參苓白術(shù)散”、“香砂養(yǎng)胃丸”等中成藥品的主要成分。此外，白術(shù)尚含有許多種其他有藥理學(xué)活性的化合物（龍全江等,2004年;陳冰冰,2012年）。同時白術(shù)是良好的補氣藥（楊娥等，2012年）。

目前，野生白術(shù)資源瀕臨滅絕，市場上所用的生藥材大部分來自人工種植的白術(shù)，而人工栽培白術(shù)需經(jīng)過繁瑣的、長時間的育苗過程（王留柱,2009年）。近年來，人們開始使用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，這可在較短時間內(nèi)得到大量白術(shù)試管苗來滿足白術(shù)的標準化生產(chǎn)種植。國內(nèi)關(guān)于白術(shù)離體植株再生的報道較少，主要是利用白術(shù)側(cè)芽（沈銀柱等,1988年;彭菲等,2001年）、葉片（陳娟等,2006年）、莖尖或根狀莖（梁小敏等,2009年）萌發(fā)幼芽，幼芽作為外植體進行其離體繁殖。該技術(shù)與傳統(tǒng)的育苗技術(shù)相比，大大加快了白術(shù)的人工繁殖速度，但其增殖頻率較低，而且經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生使其易產(chǎn)生體細胞遺傳變異，從而影響再生植株的品質(zhì)穩(wěn)定。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用胚軸和胚根直接分化不定芽的白術(shù)再生體系，以解決現(xiàn)有白術(shù)人工繁殖時間長，頻率低，再生植株的品質(zhì)穩(wěn)定性較差的問題。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種利用胚軸和胚根直接分化不定芽的白術(shù)再生體系，包括以下步驟：

（a）將白術(shù)種子洗凈、消毒，將消毒后的白術(shù)種子接種于MS培養(yǎng)基中，于25±2℃黑暗處培養(yǎng)至種子萌發(fā)，轉(zhuǎn)移至光下繼續(xù)培養(yǎng)；

（b）培養(yǎng)至株高2-3cm時取出，切取胚根和胚軸，切成長度為0.3-0.5 cm的小塊，作為外植體，接種至芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在溫度為25±2℃、光照時間為14h/d、光照強度為3000-4000 lx誘導(dǎo)培養(yǎng)，使其分化至外植體上生長出2-3cm長的綠芽；所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指在1L的MS培養(yǎng)基中添加了0.5-1.5 mg的TDZ、0-0.5mgNAA、30g的蔗糖和8g的瓊脂得到的培養(yǎng)基，所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為5.8-6.2；

（c）切下所述綠芽轉(zhuǎn)接至盛有生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在溫度為25±2℃、光照14 h/d、光照強度3000-4000 lx繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)生根，得到再生植株；所述生根培養(yǎng)基是指在1/2MS培養(yǎng)基中添加了0.5mg的NAA或IBA、30g的蔗糖和8g的瓊脂得到的培養(yǎng)基，所述生根培養(yǎng)基的pH值為5.8-6.2；

（d）將已經(jīng)生根且生長狀態(tài)良好的再生植株取出，移栽至由蛭石∶砂∶營養(yǎng)土的質(zhì)量比為1∶1∶1組成的滅菌基質(zhì)中繼續(xù)栽培，即得白術(shù)植株。

步驟（a）所述的光下繼續(xù)培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為25±2℃、光照時間為14h/d、光照強度為3000-4000lx。

步驟（a）所述的消毒是指將洗凈后的白術(shù)種子在去除種皮前用質(zhì)量比濃度為0.1%的升汞浸泡種子10 min，無菌水沖洗3-5次，在無菌水中浸泡6 h后，剝?nèi)シN皮；再用質(zhì)量比濃度為1.5%的NaClO消毒10 min，無菌水沖洗3-5遍。

優(yōu)選地，步驟（b）中所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指在1L的MS培養(yǎng)基中添加了1.5 mg的TDZ、0.2mgNAA、30g的蔗糖和8g的瓊脂得到的培養(yǎng)基。

步驟（a）和步驟（b）所述的MS培養(yǎng)基是通過以下方法制備而成：將 MS大量元素、MS微量元素、MS有機物、30g蔗糖、8g瓊脂溶于1L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為5.8-6.2，121℃滅菌15-20min即得。

步驟（c）所述的1/2MS培養(yǎng)基是通過以下方法制備而成：將1/2MS大量元素、MS微量元素、MS有機物、30g蔗糖、8g瓊脂溶于1L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為5.8-6.2，121℃滅菌15-20min即得。

本發(fā)明利用白術(shù)的不同外植體進行不定芽的誘導(dǎo)分化試驗，建立了白術(shù)的高效離體快速繁殖方法，采用消毒方法獲得無菌苗，選取胚軸和胚根這兩種特定的外植體，通過特定的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基進行直接誘導(dǎo)分化，建立了白術(shù)高效快速再生繁殖體系。本發(fā)明提供的再生體系可用于白術(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化和快速離體繁殖，大大提高了白術(shù)的增殖頻率，縮短了繁殖時間，節(jié)約了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率，為藥用白術(shù)的大規(guī)模生產(chǎn)和品質(zhì)改良提供了技術(shù)支持；而且由于未經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生，其植株的遺傳穩(wěn)定性更高，這為利用植物基因工程技術(shù)改良白術(shù)品質(zhì)、利用離體快速繁殖技術(shù)工廠化育苗及脫病毒提供了品質(zhì)保障。

附圖說明

圖1為實施例1的步驟（2）中胚根的生長狀態(tài)圖。

圖2為實施例1的步驟（2）中胚軸的生長狀態(tài)圖。

圖3為實施例1的步驟（3）再生植株的生長狀態(tài)圖。

圖4為實施例1的步驟（4）將再生植株移栽至營養(yǎng)土基質(zhì)后的生長狀態(tài)圖。

具體實施方式

下面實施例用于進一步詳細說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。但不以任何形式限制本發(fā)明。

MS培養(yǎng)基的配制：將 MS大量元素、MS微量元素、MS有機物、30g蔗糖、8g瓊脂溶于1L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為5.8-6.2，121℃滅菌15-20min即得。

1/2 MS培養(yǎng)基的配制：將1/2MS大量元素、MS微量元素、MS有機物、30g蔗糖、8g瓊脂溶于1L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為5.8-6.2，121℃滅菌15-20min即得。

實施例1

（1）無菌苗的獲得。選取粒大、飽滿的白術(shù)種子，用流水沖洗干凈，用質(zhì)量比濃度為75%的酒精浸泡1 min后，進行消毒。采用兩步法消毒：去除種皮前用質(zhì)量比濃度為0.1%的升汞浸泡種子10 min，無菌水沖洗3-5次，在無菌水中浸泡6 h后，剝?nèi)シN皮；再用質(zhì)量比濃度為1.5%的NaClO消毒10 min，無菌水沖洗3-5遍。消毒后的種子，接種于未添加任何生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中，于25±2℃黑暗處培養(yǎng)至種子萌發(fā)后，轉(zhuǎn)移至光下繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度：25±2℃，光照時間：14h/d，光照強度為：3500 lx。

（2）待白術(shù)種子萌發(fā)后繼續(xù)培養(yǎng)1周，待株高為2-3cm時取出，切取胚根和胚軸，作為外植體，切成0.3-0.5 cm的小塊，接種至芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽的分化，培養(yǎng)溫度：25±2℃，光照時間：14h/天，光照強度：3000-4000lx；培養(yǎng)30天，分化出了綠芽，統(tǒng)計其每個外植體分化芽個數(shù)為13.13±2.75（胚軸）和7.95±1.72（胚根），不定芽分化率分別為91.18%（胚軸）和68.30%（胚根）。其中芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在1L的MS培養(yǎng)基中添加了1.5 mg的TDZ、0.2mgNAA、30g的蔗糖和8g的瓊脂混合，調(diào)節(jié)pH值為5.8，121℃高壓滅菌15 min后的培養(yǎng)基。

（3）將外植體上生長健壯的2-3 cm長的綠芽切下，轉(zhuǎn)接至盛有生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，植物材料光照培養(yǎng)條件為25±2℃、光照14 h/d、光照強度3500 lx，誘導(dǎo)生根，得再生植株；其中生根培養(yǎng)基是指在1L的1/2MS培養(yǎng)基中添加了0.5mg的NAA、30g的蔗糖和8g的瓊脂混合，調(diào)節(jié)pH值為5.8，121℃高壓滅菌15 min后的培養(yǎng)基。

（4）將已經(jīng)生根且生長狀態(tài)良好的再生植株，打開培養(yǎng)瓶蓋，培養(yǎng)間中煉苗2-3 天后小心取出植株，洗凈培養(yǎng)基，移栽至按質(zhì)量比為1∶1∶1的蛭石、砂和營養(yǎng)土混合滅菌基質(zhì)中，栽培于小缽中，澆透水，薄膜覆蓋保濕，注意通風(fēng)和保持25℃左右的環(huán)境溫度進行繼續(xù)培育，得到白術(shù)植株。

實施例2

方法同實施例1，僅變動了步驟（2）中芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在1L的MS培養(yǎng)基中添加了1.0 mg的TDZ、30g的蔗糖和8g的瓊脂混合，調(diào)節(jié)pH值為5.8，121℃高壓滅菌15 min，制備而成的培養(yǎng)基。

實施例3

方法同實施例1，僅變動了步驟（2）中芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在1L的MS培養(yǎng)基中添加了0.5mg的TDZ、0.2mgNAA、30g的蔗糖和8g的瓊脂混合，調(diào)節(jié)pH值為5.8，121℃高壓滅菌15 min，制備而成的培養(yǎng)基。

實施例4

方法同實施例1，僅變動了步驟（2）中芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在1L的MS培養(yǎng)基中添加了1.0 mg的TDZ、0.2mgNAA、30g的蔗糖和8g的瓊脂混合，調(diào)節(jié)pH值為5.8，121℃高壓滅菌15 min，制備而成的培養(yǎng)基。

實施例5

方法同實施例1，僅變動了步驟（2）中芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在1L的MS培養(yǎng)基中添加了1.5 mg的TDZ、0.5mgNAA、30g的蔗糖和8g的瓊脂混合，調(diào)節(jié)pH值為5.8，121℃高壓滅菌15 min，制備而成的培養(yǎng)基。

實施例6

方法同實施例1，僅變動了步驟（2）中芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在1L的MS培養(yǎng)基中添加了1.5 mg的TDZ、30g的蔗糖和8g的瓊脂混合，調(diào)節(jié)pH值為5.8，121℃高壓滅菌15 min，制備而成的培養(yǎng)基。

對比例1

方法同實施例1，僅變動了步驟（2）中芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在1L的MS培養(yǎng)基中添加了1.0mg的6-BA、30g的蔗糖和8g的瓊脂混合，調(diào)節(jié)pH值為5.8，121℃高壓滅菌15 min，制備而成的培養(yǎng)基。

對比例2

方法同實施例1，將步驟（2）中“切取胚根和胚軸”改為“切取真葉和子葉”；其誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方同實施例2。

對比例3

方法同實施例1，將步驟（2）中“切取胚根和胚軸芽”改為“切取真葉和子葉”；其誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方同對比例1。

對比例4

方法同實施例1，僅變動了步驟（2）中芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在1L的MS培養(yǎng)基中添加了2.0mg的TDZ、0.2mgNAA、30g的蔗糖和8g的瓊脂混合，調(diào)節(jié)pH值為5.8，121℃高壓滅菌15 min，制備而成的培養(yǎng)基。

對比例5

方法同實施例1，僅變動了步驟（2）中芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在1L的MS培養(yǎng)基中添加了1.5mg的TDZ、1.2mgNAA、30g的蔗糖和8g的瓊脂混合，調(diào)節(jié)pH值為5.8，121℃高壓滅菌15 min，制備而成的培養(yǎng)基。

實施例7

在相同培育條件和時間下，統(tǒng)計實施例和對比例中步驟（2）的芽分化率/%和每個外植體平均芽數(shù)。統(tǒng)計結(jié)果見表1和表2。

表1 實施例和對比例分化不定芽及愈傷組織誘導(dǎo)率的統(tǒng)計

*不同小寫字母表示差異顯著(P <0.01)

表2 對比例2和3分化不定芽及愈傷組織誘導(dǎo)率的統(tǒng)計

由表1和表2的統(tǒng)計數(shù)據(jù)可以看出，不同的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基對不定芽分化率的影響很大，其中胚根在不同的培養(yǎng)基中的不定芽分化數(shù)目有極顯著的差異（P<0.01）；與在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加6-BA相比，無論是胚軸外植體還是胚根外植體，添加TDZ的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中芽誘導(dǎo)率較高、產(chǎn)生不定芽數(shù)目較多；表明TDZ誘導(dǎo)白術(shù)外植體產(chǎn)生不定芽的效果更好，但TDZ對真葉和子葉卻效果非常差，可見TDZ僅對于分化胚軸和胚根具有適配性。此外，我們從實施例和對比例統(tǒng)計的數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，胚根和上胚軸外植體不定芽分化率和不定芽個數(shù)均受到不同TDZ濃度的顯著影響（P <0.01）；當(dāng)兩種外植體不定芽分化率均在TDZ濃度為1.5 mg·L^-1時最高，而當(dāng)TDZ濃度為2.0mg·L^-1時卻表現(xiàn)很不理想；在相同TDZ濃度條件下，上胚軸外植體的不定芽分化率和每個外植體平均分化芽個數(shù)均高于胚根外植體；且可以看到NAA濃度較高時，會抑制白術(shù)胚根和上胚軸外植體不定芽的分化。

從愈傷組織誘導(dǎo)率方面考慮，胚根和胚軸外植體在實施例1步驟（2）中誘導(dǎo)不定芽，培養(yǎng)至4 周時，胚根和胚軸外植體均從外植體上直接分化出了不定芽，無愈傷組織產(chǎn)生，其胚根的生長狀態(tài)如圖1所示，胚軸的生長狀態(tài)如圖2所示；切取綠芽（不定芽）轉(zhuǎn)栽到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)20天左右，在芽的基部接觸培養(yǎng)基的部分出現(xiàn)根原基，25天開始生根，培養(yǎng)40 d后根長可達2-3 cm，其生長狀態(tài)如圖3所示；待白術(shù)再生植株根長至2-3 cm 左右時，經(jīng)煉苗2-3天后，移栽至土壤基質(zhì)中，其生長狀態(tài)如圖4所示。

此外，實施例1中第（4）步的生根培養(yǎng)基中的“NAA”可用“IBA”替換，其實際效果與實施例1相當(dāng)。

實施例8

對比例6為2010年陶元景等在《醫(yī)藥生物技術(shù)》期刊上發(fā)表的“白術(shù)莖尖組織培養(yǎng)及快繁技術(shù)優(yōu)化研究”。

對比例7為2006年陳娟等在《中國農(nóng)學(xué)通報》期刊上發(fā)表的“白術(shù)葉片再生植株和叢生芽快繁的研究”。

本發(fā)明提供的方法與對比文件6和對比文件7相比，其實驗效果見表3。

表3 本發(fā)明與對比文件繁殖頻率和繁殖時間的對比結(jié)果

從表3的數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明的繁殖方法較現(xiàn)有的一些外植體的繁殖方法，其繁殖頻率更快、繁殖時間更短，無愈傷組織，產(chǎn)品的品質(zhì)更穩(wěn)定。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受所述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。