本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說(shuō)，涉及苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法。

背景技術(shù)：

苗族藥材槍墻葉即青莢葉(Helwingia japonica.japonica)，為山茱萸科青莢葉屬落葉灌木。青莢葉屬有青莢葉、中華青莢葉、西藏青莢葉、浙江青莢葉和峨眉青莢葉等5種，主要分布于亞洲東部的尼泊爾、錫金、不丹、印度北部、緬甸北部、越南北部、中國(guó)和日本等國(guó)。我國(guó)5種均產(chǎn)，主要分布于陜西、河南、長(zhǎng)江流域及華南地區(qū)等海拔1500米以上的原始森林中。由于青莢葉雌花無(wú)梗，花和果實(shí)在葉面中央的主脈上生長(zhǎng)，又被稱(chēng)為葉上花或葉上果。其根莖葉入藥，具有舒筋活絡(luò)、調(diào)經(jīng)、止咳等功效，苗族民間常以葉上花、無(wú)花果、月季花搭配治療月經(jīng)不調(diào),以葉上花、矮陀陀、土三七搭配治療勞傷,單獨(dú)使用青莢葉來(lái)治療年久咳喘。此外，青莢葉為落葉小灌木，雌雄異株，雌株的花和雄株的果均具有很強(qiáng)的直觀性，這種奇特的現(xiàn)象總能吸引路人的駐足觀賞。景觀配置上，種植在陰濕肥沃處，如配植紫丁香、垂絲海棠樹(shù)下，或種植于水塘、墻邊或臺(tái)階前，或盆栽于室內(nèi)，均有良好的觀賞效果。

目前，青莢葉尚處于引種階段，少量栽培于貴州、廣西苗族地區(qū)。青莢葉主要采用種子繁殖，但由于其種子常被鳥(niǎo)類(lèi)采食，難以獲得足夠用于繁殖的種子。因此，為了解決青莢葉規(guī)?；N植中其種苗缺乏的問(wèn)題，有必要建立青莢葉的組織培養(yǎng)快繁體系，本發(fā)明選擇青莢葉帶節(jié)莖段為外植體，經(jīng)不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)以及移栽等步驟，實(shí)現(xiàn)了苗族藥材青莢葉的快速繁殖。本發(fā)明具成本低、工藝簡(jiǎn)單、成苗快等特點(diǎn)，可直接用于青莢葉種苗的工廠化生產(chǎn)，對(duì)于青莢葉的遺傳改良和種質(zhì)資源保護(hù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，國(guó)內(nèi)外尚未有青莢葉組織培養(yǎng)技術(shù)的報(bào)道，也未有青莢葉組培快繁專(zhuān)利的申請(qǐng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法，本發(fā)明選擇青莢葉帶節(jié)莖段為外植體，經(jīng)不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)以及移栽等步驟，實(shí)現(xiàn)了苗族藥材青莢葉的快速繁殖，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：一種苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法，包括依次進(jìn)行的如下步驟：獲取青莢葉的外植體、不定芽誘導(dǎo)、不定芽的繼代培養(yǎng)、不定芽的生根培養(yǎng)、試管苗移栽；

所述的不定芽誘導(dǎo)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括：MS培養(yǎng)基、0.5～1.0mg/L ZT、0.1～0.3mg/L NAA、25～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L瓊脂、0.5～1.0g/L活性炭，pH為5.4～5.8。

在上述的苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法中，所述的不定芽誘導(dǎo)的方法為：將青莢葉的外植體經(jīng)清洗消毒處理后切成1.0～1.5cm左右的帶節(jié)莖段并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在25～28℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)25～30天即可誘導(dǎo)形成不定芽。

在上述的苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法中，不定芽的繼代培養(yǎng)所用的繼代培養(yǎng)基包括：MS培養(yǎng)基、0.5～1.0mg/L 6-BA、0.1～0.5mg/L NAA、20～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L瓊脂、0.1～0.5g/L活性炭，pH為5.4～5.8。

在上述的苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法中，所述的不定芽的繼代培養(yǎng)的方法具體為：將經(jīng)過(guò)不定芽誘導(dǎo)得到的不定芽切成長(zhǎng)約1～2cm的莖段并接種到繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)25～30天即可實(shí)現(xiàn)不定芽的繼代。

在上述的苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法中，不定芽的生根培養(yǎng)所用的生根培養(yǎng)基包括：1/2MS、0.1～0.3mg/L 6-BA、0.1～0.3mg/L IBA、0.5～1.0mg/L NAA、15～20g/L蔗糖、3.0～4.0g/L瓊脂，pH為5.4～5.8。

在上述的苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法中，所述的不定芽的生根培養(yǎng)的方法為：將經(jīng)過(guò)不定芽的繼代培養(yǎng)得到的長(zhǎng)約2.0～3.0cm的不定芽從基部切取并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)25～30天即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根。

在上述的苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法中，所述的試管苗移栽的方法具體為：將經(jīng)過(guò)不定芽的生根培養(yǎng)得到的生長(zhǎng)良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗1～3天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、樹(shù)皮混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗。

在上述的苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法中，所述的不定芽誘導(dǎo)、不定芽的繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度為25～28℃，光照強(qiáng)度為2000～2500lx，光照時(shí)間為10～12小時(shí)/天。

在上述的苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法中，獲取青莢葉的外植體的具體方法為：在野外選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病害的青莢葉植株的帶節(jié)莖段為外植體，采集后立即進(jìn)行保水保濕處理。

有益效果：

本發(fā)明利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了苗族藥材青莢葉的快速繁殖，本發(fā)明具成本低、工藝簡(jiǎn)單、成苗快等特點(diǎn)，成活率達(dá)到91％以上，可直接用于青莢葉種苗的工廠化生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。

實(shí)施例一

(1)外植體采集：在野外選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病害的青莢葉植株的帶節(jié)莖段為外植體，采集后立即進(jìn)行保水保濕處理并及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室。

(2)不定芽誘導(dǎo)：當(dāng)步驟(1)采集回實(shí)驗(yàn)室外植體先用10％的洗衣粉溶液清洗3次后，在自來(lái)水下沖洗20分鐘后置于超凈工作臺(tái)中于75％的乙醇溶液中消毒15秒鐘，無(wú)菌水沖洗2次后用無(wú)菌濾紙吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒15分鐘，無(wú)菌水沖洗3次后用無(wú)菌濾紙吸干水分后切成1.0～1.5cm左右的帶節(jié)莖段并接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在25℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)25天即可誘導(dǎo)形成不定芽，誘導(dǎo)率為82.8％，污染率低于20％。所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+1.0mg/L ZT(玉米素)+0.3mg/L NAA+25g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+0.5g/L活性炭，pH為5.4。

(3)繼代培養(yǎng)：將步驟(2)誘導(dǎo)得到的不定芽切成長(zhǎng)約1～2cm的莖段并接種到繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天即可實(shí)現(xiàn)不定芽的繼代，增殖系數(shù)達(dá)到7倍。所述的繼代培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+20g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+0.1g/L活性炭，pH為5.4。

(4)生根培養(yǎng)：將步驟(3)繼代得到的長(zhǎng)約2.0～3.0cm的不定芽從基部切取并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根，生根率為89.5％。所述的生根培養(yǎng)基為：1/2MS+0.3mg/L 6-BA+0.3mg/L IBA+1.0mg/L NAA+15g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂，pH為5.4。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長(zhǎng)良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗1天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、樹(shù)皮混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率為91.8％。

上述步驟(3)～(4)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2000lx，光照時(shí)間為10小時(shí)/天。

實(shí)施例二

(1)外植體采集：在野外選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病害的青莢葉植株的帶節(jié)莖段為外植體，采集后立即進(jìn)行保水保濕處理并及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室。

(2)不定芽誘導(dǎo)：當(dāng)步驟(1)采集回實(shí)驗(yàn)室外植體先用10％的洗衣粉溶液清洗4次后，在自來(lái)水下沖洗25分鐘后置于超凈工作臺(tái)中于75％的乙醇溶液中消毒23秒鐘，無(wú)菌水沖洗2次后用無(wú)菌濾紙吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒24分鐘，無(wú)菌水沖洗4次后用無(wú)菌濾紙吸干水分后切成1.0～1.5cm左右的帶節(jié)莖段并接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在27℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)27天即可誘導(dǎo)形成不定芽，誘導(dǎo)率為81.3％，污染率低于15％。所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+0.8mg/L ZT(玉米素)+0.2mg/L NAA+23g/L蔗糖+3.7g/L瓊脂+0.7g/L活性炭，pH為5.6。

(3)繼代培養(yǎng)：將步驟(2)誘導(dǎo)得到的不定芽切成長(zhǎng)約1～2cm的莖段并接種到繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)27天即可實(shí)現(xiàn)不定芽的繼代，增殖系數(shù)達(dá)到6倍。所述的繼代培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+0.7mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+25g/L蔗糖+3.7g/L瓊脂+0.3g/L活性炭，pH為5.6。

(4)生根培養(yǎng)：將步驟(3)繼代得到的長(zhǎng)約2.0～3.0cm的不定芽從基部切取并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)28天即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根，生根率為90％。所述的生根培養(yǎng)基為：1/2MS+0.2mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+0.8mg/L NAA+17g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂，pH為5.6。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長(zhǎng)良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗2天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、樹(shù)皮混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率為93％。上述步驟(3)～(4)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為26℃，光照強(qiáng)度為2700lx，光照時(shí)間為11小時(shí)/天。

實(shí)施例三

(1)外植體采集：在野外選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病害的青莢葉植株的帶節(jié)莖段為外植體，采集后立即進(jìn)行保水保濕處理并及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室。

(2)不定芽誘導(dǎo)：當(dāng)步驟(1)采集回實(shí)驗(yàn)室外植體先用10％的洗衣粉溶液清洗5次后，在自來(lái)水下沖洗30分鐘后置于超凈工作臺(tái)中于75％的乙醇溶液中消毒30秒鐘，無(wú)菌水沖洗3次后用無(wú)菌濾紙吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒20分鐘，無(wú)菌水沖洗5次后用無(wú)菌濾紙吸干水分后切成1.0～1.5cm左右的帶節(jié)莖段并接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在28℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)30天即可誘導(dǎo)形成不定芽，誘導(dǎo)率為80.9％，污染率為9.2％。所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+0.5mg/L ZT(玉米素)+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.0g/L瓊脂+1.0g/L活性炭，pH為5.8。

(3)繼代培養(yǎng)：將步驟(2)誘導(dǎo)得到的不定芽切成長(zhǎng)約1～2cm的莖段并接種到繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天即可實(shí)現(xiàn)不定芽的繼代，增殖系數(shù)達(dá)到5倍。所述的繼代培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.0g/L瓊脂+0.5g/L活性炭，pH為5.8。

(4)生根培養(yǎng)：將步驟(3)繼代得到的長(zhǎng)約2.0～3.0cm的不定芽從基部切取并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根，生根率為86.1％。所述的生根培養(yǎng)基為：1/2MS+0.1mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+0.5mg/L NAA+20g/L蔗糖+4.0g/L瓊脂，pH為5.8。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長(zhǎng)良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗3天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、樹(shù)皮混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率為93.7％。

上述步驟(3)～(4)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為28℃，光照強(qiáng)度為2500lx，光照時(shí)間為12小時(shí)/天

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。