本發(fā)明屬于組培苗
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種利用水楊酸(SA)進(jìn)行雜交鵝掌楸體胚發(fā)生的方法。
背景技術(shù)：
：近年來，人們不斷地加大對(duì)植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究，使其在幾十年內(nèi)得到了快速的發(fā)展，并取得很大的成果。由于體細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的體胚具備發(fā)生數(shù)量多、生長(zhǎng)速度快、結(jié)構(gòu)完整、繁殖效率高等特點(diǎn)，使體胚發(fā)生技術(shù)成為植物快速繁殖的有效手段，有利于保存優(yōu)良的林木品種、縮短優(yōu)良品種培育時(shí)間、加快產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展等，在林業(yè)的發(fā)展中具有重要意義。植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生是細(xì)胞工程中植株再生的有效途徑，它可以在一些植物尤其是木本植物生長(zhǎng)繁殖周期較長(zhǎng)，或者有的植物種子難以萌發(fā)中發(fā)揮巨大作用。體胚發(fā)生主要分為誘導(dǎo)胚性愈傷組織的形成和體胚的形態(tài)建成。第一階段選擇外植體，選取未成熟胚、根、莖、葉、花器官等組織誘導(dǎo)形成胚性愈傷組織；第二階段誘導(dǎo)胚性愈傷組織分化形成體細(xì)胞胚。胚性細(xì)胞經(jīng)過一系列的發(fā)育形成球形胚，最終形成子葉胚，子葉胚再經(jīng)進(jìn)一步培養(yǎng)形成完整的植株。植物直接的體細(xì)胞胚胎發(fā)生是在外植體包括器官、組織、細(xì)胞等直接發(fā)育分化成體細(xì)胞胚。而間接體胚發(fā)生是外植體形成愈傷愈傷組織后進(jìn)一步發(fā)育成體細(xì)胞胚，或者形成胚性愈傷組織后經(jīng)過懸浮培養(yǎng)后形成體細(xì)胞胚。林木體細(xì)胞胚胎研究起源于20世紀(jì)70年代Rao等對(duì)檀香的體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究。盡管大部分木本植物的體胚發(fā)生存在一定難度，但幾十年的努力，木本植物通過體胚發(fā)生形成再生植株已經(jīng)達(dá)到二百種以上，還有一些用材樹種的體胚發(fā)生的研究也取得新進(jìn)展。馬尾松、火炬松等部分裸子植物的體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系已經(jīng)較成熟，能夠組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)植株再生。陳金慧等首次成功建立雜交鵝掌楸體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系，并進(jìn)一步誘導(dǎo)出體胚苗，加快雜交鵝掌楸的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。體胚發(fā)生時(shí)，外界因素誘導(dǎo)內(nèi)部發(fā)生變化或內(nèi)部自身因素使調(diào)控基因表達(dá)，從而完成植物體胚的發(fā)生。其主要的影響因素有：外植體選擇、基因型、培養(yǎng)基的選擇、環(huán)境條件、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)等。其中植物激素在體胚發(fā)生中起到不可替代的作用。1)基因型與外植體的選擇只要是活的植物組織或器官都可作為組織培養(yǎng)的材料。體胚發(fā)生會(huì)因外植體的狀態(tài)、類型、基因型等因素的不同而存在很大差異。在進(jìn)行組織培養(yǎng)過程中，選擇的外植體器官分化程度低并且生理狀態(tài)較好，可以大大提升體胚發(fā)生誘導(dǎo)率。因此在進(jìn)行組織誘導(dǎo)時(shí)，通常選擇生理狀態(tài)好、品質(zhì)優(yōu)良的材料，可以加大植物體胚誘導(dǎo)的成功率。由于植物基因型的不同，使得體細(xì)胞胚誘導(dǎo)時(shí)在激素的使用、培養(yǎng)條件等方面都存在差異。不同基因型的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)效率存在較大差異，有可能是因?yàn)椴煌蛐偷淖罴雅囵B(yǎng)條件不同。黃璐等誘導(dǎo)胚性愈傷組織和體胚發(fā)生時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同基因型的體胚誘導(dǎo)率存在差異。2)培養(yǎng)基的選擇通常培養(yǎng)基主要由碳水化合物、氮源、無機(jī)鹽、維生素等成分組成，每個(gè)組成部分都起到重要作用。其中氮源對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生有較大的影響。崔凱榮等在培養(yǎng)基中加不同比例的硝態(tài)氮及氨態(tài)氮誘導(dǎo)枸杞體胚發(fā)生時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中只加氨態(tài)氮不加硝態(tài)氮時(shí)，枸杞體細(xì)胞胚胎發(fā)生誘導(dǎo)率最高。3)環(huán)境條件通常暗培養(yǎng)環(huán)境下有利于木本植物胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，待體胚進(jìn)行成熟培養(yǎng)時(shí)則需要光照，光照也有利于降低畸形率。雖然黑暗與光照條件下都可以誘導(dǎo)胚性愈傷組織，但在光照條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚性愈傷組織可能會(huì)褐化或者體胚再生頻率不高。陳金慧等在研究雜交鵝掌楸體細(xì)胞胚胎發(fā)生時(shí)，發(fā)現(xiàn)暗環(huán)境有利于胚性愈傷組織生長(zhǎng)和體胚發(fā)生，體胚發(fā)生后及時(shí)移至光照條件下培養(yǎng)，有利于體胚發(fā)育和植株再生。溫度也是影響體胚發(fā)生的重要因素。高溫或低溫都有可能影響胚性愈傷組織的體胚發(fā)生能力。陳小鵬在黃瓜的體胚發(fā)生研究中發(fā)現(xiàn)高溫會(huì)導(dǎo)致體胚數(shù)量減少，降低體胚誘導(dǎo)率。張宇等在研究水曲柳的體胚發(fā)生中，發(fā)現(xiàn)低溫處理后能夠促進(jìn)體胚同步化。4)外源激素在體胚發(fā)生中的作用植物激素在一定濃度下能夠調(diào)控植物生理反應(yīng)，在生長(zhǎng)發(fā)育、成熟衰老等方面發(fā)揮最重要作用。在植物體胚發(fā)生過程中植物激素的選擇是至關(guān)重要的。植物體胚發(fā)生所需要的植物激素及含量是不同的，即使同種植物在誘導(dǎo)體胚發(fā)生中的不同階段所需植物激素也是不同的。從大多數(shù)的報(bào)道看，生長(zhǎng)素是體細(xì)胞胚分裂所必需的，可促使內(nèi)源生長(zhǎng)素的增加，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞分裂和內(nèi)源激素平衡，最終促使細(xì)胞進(jìn)入胚胎狀態(tài)。對(duì)大多數(shù)植物來說，除了生長(zhǎng)素，體胚發(fā)生還需要細(xì)胞分裂素。6-BA(細(xì)胞分裂素)有利于愈傷組織的形成。KT則有助于改善愈傷組織的質(zhì)量。近年有研究發(fā)現(xiàn)TDZ活性更高，已經(jīng)誘導(dǎo)出體胚，如花生的體胚誘導(dǎo)。許多研究都證實(shí)ABA在許多植物體胚的不同階段都一定的促進(jìn)作用。對(duì)一些植物的ABA突變體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在植物體胚成熟階段ABA發(fā)揮重要功能，有利于體細(xì)胞胚胎后期的發(fā)育。許多植物的體胚誘導(dǎo)過程中ABA都能夠刺激體細(xì)胞胚成熟，能夠有效提高體胚發(fā)生率。由于樹種特性的不同，一些植物在體細(xì)胞胚胎發(fā)生中添加外源ABA不利于體胚發(fā)生或者抑制體胚發(fā)生，如火炬松、白云松等。水楊酸(salicylicacid，SA)是植物體內(nèi)普遍存在的一種簡(jiǎn)單的小分子酚類化合物，化學(xué)名稱為“鄰羥基苯甲酸”，是肉桂酸的衍生物。它是從柳樹皮分離出的活性成分。1938年RaffaelePiria將這組有效組分命名為水楊酸。1992年，Raskin提出可以把SA看成是一種新的植物內(nèi)源激素。20世紀(jì)60年代后，人們開始發(fā)現(xiàn)SA在植物中具有重要的生理作用。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中，SA能有效的調(diào)控植物的發(fā)育、成熟和衰老。并且在一些逆境環(huán)境中，如干旱、鹽堿、重金屬、低溫等條件下，它能有效的減緩這些非生物脅迫。研究發(fā)現(xiàn)包括水稻、大豆、大麥等作物在內(nèi)的34種植物葉片和生殖器官含有水楊酸，含量大于1μg/g鮮重，說明它在植物界中是普遍存在的。SA以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式存在于植物體內(nèi)。游離態(tài)SA呈晶狀體，結(jié)合態(tài)SA是由SA于核苷、糖脂、甲基或氨基酸結(jié)合形成的，易溶于極性有機(jī)溶劑，微溶于水，飽和水溶液的pH呈酸性其值為2.4。水楊酸作為一種新型植物激素，可調(diào)節(jié)植物生理反應(yīng)，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和抗性等方面具有重要影響。近年來，對(duì)水楊酸的抗性研究較多，其他領(lǐng)域的研究較少，尤其是在植物組織或細(xì)胞離體培養(yǎng)條件下促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)分化，誘導(dǎo)體胚發(fā)生等方面作用鮮見報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種利用水楊酸進(jìn)行雜交鵝掌楸體胚發(fā)生的方法，提高體胚誘導(dǎo)率、發(fā)育的同步性，提高雜交鵝掌楸體細(xì)胞工程種苗繁育的效益。技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種利用水楊酸進(jìn)行雜交鵝掌楸體胚發(fā)生的方法，包括雜交鵝掌楸懸浮系的建立、液體單細(xì)胞的獲得及過渡、誘導(dǎo)雜交鵝掌楸體胚的發(fā)生步驟，在誘導(dǎo)雜交鵝掌楸體胚的發(fā)生時(shí)，在培養(yǎng)基中同時(shí)添加水楊酸和ABA，或單獨(dú)添加水楊酸。所述的水楊酸的用量為0.01～1.25mg/Lmol/L，ABA的用量為2mg/L。所述的培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基。所述的雜交鵝掌楸的基因型為C38、C138、243012、253010。所述的雜交鵝掌楸的基因型為C138，培養(yǎng)基配方為3/4MS+SA0.25mg/L或3/4MS+ABA2.0mg/L+SA0.05mg/L。所述的雜交鵝掌楸的基因型為243012，培養(yǎng)基配方為3/4MS+ABA2.0mg/L+SA0.05mg/L。所述的雜交鵝掌楸的基因型為253010，培養(yǎng)基配方為3/4MS+ABA2.0mg/L+SA0.05mg/L或3/4MS+ABA2.0mg/L+SA0.25mg/L。所述的水楊酸的用量為0.05～0.25mg/L。有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的利用水楊酸進(jìn)行雜交鵝掌楸體胚發(fā)生的方法，在雜交鵝掌楸體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中，加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑SA有效提高提高體胚誘導(dǎo)率，在體細(xì)胞發(fā)育過程中有效降低其畸形率的產(chǎn)生，提高雜交鵝掌楸細(xì)胞工程的育種質(zhì)量。在生長(zhǎng)過程中，可以提高體胚再生植株的抗逆境脅迫能力，提高雜交鵝掌楸體細(xì)胞工程種苗繁育的效益，促進(jìn)雜交鵝掌楸體胚再生植株的規(guī)模化應(yīng)用，提高林業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)效益，降低后期管理非生物脅迫成本。附圖說明圖1是不同基因型誘導(dǎo)率差異性結(jié)果圖；圖2是顯微鏡下的單細(xì)胞圖；圖中，a為C138，b為243012，c為253010；圖3是c138在不同培養(yǎng)基上體胚發(fā)育情況圖；圖4是243012在不同培養(yǎng)基上體胚發(fā)育情況圖；圖5是253010在不同培養(yǎng)基上體胚發(fā)育情況圖；圖6是C138在不同培養(yǎng)基上體胚發(fā)育情況圖；圖7是243012在不同培養(yǎng)基上體胚發(fā)育情況圖；圖8是253010在不同培養(yǎng)基上體胚發(fā)育情況圖；圖9是不同基因型在不同培養(yǎng)基上體胚發(fā)育結(jié)果圖；圖A.253010在1號(hào)培養(yǎng)基，圖B.243012在1號(hào)培養(yǎng)基，圖C.c138在1號(hào)培養(yǎng)基，圖D.253010在7號(hào)培養(yǎng)基，圖E.243012在7號(hào)培養(yǎng)基，圖F.c138在7號(hào)培養(yǎng)基，圖G.253010在7號(hào)培養(yǎng)基光照后，圖H.243012在7號(hào)培養(yǎng)基光照后，圖I.c138在7號(hào)培養(yǎng)基光照后；圖10是不同基因型在顯微鏡下觀察結(jié)果圖；A圖為253010，A-1為其放大圖，B圖為243012，B-1為其放大圖，C圖為C138，C-1為其放大圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。以下實(shí)施例中使用的供試材料選用本申請(qǐng)人的課題組于2012年及2013年期間選配的雜交鵝掌楸優(yōu)良組合，由未成熟胚誘導(dǎo)成的愈傷組織材料，具體誘導(dǎo)方法參見文獻(xiàn)[陳金慧.雜交鵝掌楸體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究[D].南京：南京林業(yè)大學(xué),2003.]?；蛐头謩e為253010、c38、c138、243012。水楊酸母液的配置：采用的水楊酸購(gòu)自Sigma公司化學(xué)純級(jí)產(chǎn)品，呈粉末狀，純度大于95％。取所需重量的SA用無水乙醇助溶，再加水定容配制成0.1mg/mL的母液備用。以下實(shí)施例中，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析：30d后統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基上體胚個(gè)數(shù)，體胚狀態(tài)，用EXCEL軟件進(jìn)行方差分析。將愈傷狀態(tài)分為黃色緊密型、褐色緊密型、白色粗糙型、白色圓滑型，根據(jù)愈傷狀態(tài)來確定培養(yǎng)基的優(yōu)與差。體胚發(fā)生率(％)＝體胚發(fā)生總數(shù)/觀察細(xì)胞數(shù)(團(tuán))；體胚成熟率(％)＝成熟胚總數(shù)/觀察細(xì)胞數(shù)(團(tuán))；畸形胚發(fā)生率(％)＝畸形胚總數(shù)/觀察細(xì)胞數(shù)(團(tuán))；實(shí)施例11、雜交鵝掌楸懸浮系的建立將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到愈傷組織250mL液體培養(yǎng)基上震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為暗培養(yǎng)，24℃，搖床轉(zhuǎn)速為96rpm。每種基因型愈傷組織接種3瓶，按照1：9的比例配置懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物，每個(gè)三角瓶懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)液混合后體積為50mL。材料繼代周期為7天，繼代2次后，進(jìn)行細(xì)胞過篩。通過400目的單細(xì)胞經(jīng)液體調(diào)整培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)1d，培養(yǎng)基為3/4MS+NAA0.2mg/L+KT0.5mg/L+BA0.2mg/L+ABA1.0mg/L+VC5.0mg/L，糖50g/L，水解酪蛋白0.5mg/L，培養(yǎng)環(huán)境為暗培養(yǎng)，24℃，搖床轉(zhuǎn)速為96rpm。2、液體培養(yǎng)基進(jìn)行體胚的誘導(dǎo)在顯微鏡下觀察過度培養(yǎng)2天的液體懸浮細(xì)胞，根據(jù)其濃度以及細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行體胚的初步誘導(dǎo)。用移液槍吸取2mL液體懸浮細(xì)胞，均勻的鋪在添加不同濃度SA(表1)固體培養(yǎng)基上，利用體式顯微鏡等觀察不同胚期狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)出胚日期及體胚苗生長(zhǎng)勢(shì)。每個(gè)濃度處理6皿，3個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)。表1SA添加濃度培養(yǎng)基號(hào)ABA(mg/L)SA(mg/L)10022.00300.01400.05500.25601.2572.00.0182.00.0592.00.25102.01.25其中瓊脂6.8g/L，水解酪蛋白0.2g/L，蔗糖30g/L，pH5.7-5.8。在很多情況下，基因型是影響體胚發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵因素，不同的基因型誘導(dǎo)結(jié)果存在明顯的差異。本實(shí)施例統(tǒng)計(jì)了基因型為c38，c138，253010，243012共四個(gè)雜交鵝掌楸胚性愈傷組織誘導(dǎo)率，求取不同平均值，結(jié)果如表2和圖1所示。表2SA對(duì)不同基因型雜交鵝掌楸體胚發(fā)生影響由表2和圖1看出，SA對(duì)不同基因型雜交鵝掌楸體胚發(fā)生存在明顯的差異。在這4個(gè)基因型中，體胚誘導(dǎo)率較高的基因型是243012、c138，這兩個(gè)基因型的誘導(dǎo)率均達(dá)到60％以上，而且愈傷組織狀態(tài)也較好。其次是253010，體胚誘導(dǎo)率達(dá)到55％，但是愈傷狀態(tài)不穩(wěn)定。最后，c38的體胚誘導(dǎo)率最低，愈傷狀態(tài)最差，顆粒較粗糙，顏色泛白。因此，在本階段試驗(yàn)中可以得出結(jié)論，243012和c138這兩個(gè)基因型較好。利用方差分析法對(duì)不同基因型體胚誘導(dǎo)率進(jìn)行差異性顯著分析，結(jié)果如表3所示。表3不同基因型誘導(dǎo)差異性顯著分析結(jié)果注：SS表示離均差平方和，代表數(shù)據(jù)的總變異；MS表示平均的離均差平方和；F表示方差分析求出的統(tǒng)計(jì)量；P就是P值，根據(jù)F值而得。crit表示F值的標(biāo)準(zhǔn)，即F值大于crit時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值小于0.05。由表3差異性顯著分析可以看出，P值小于0.05，達(dá)到了顯著型水平。說明基因型對(duì)體胚誘導(dǎo)率存在有著重要因素。實(shí)施例21)經(jīng)液體懸浮培養(yǎng)過度后，在顯微鏡下觀察不同基因型液體細(xì)胞狀態(tài)，如圖2所示。選擇基因型C138的雜交鵝掌楸懸浮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。用移液槍吸取2mL鋪在不同濃度的SA體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(SA濃度為編號(hào)1：0mg/L，編號(hào)2：0.01mg/L，編號(hào)3：0.05mg/L，編號(hào)4：0.25mg/L，編號(hào)5：1.25mg/L)，在28天后在顯微鏡下觀察和統(tǒng)計(jì)體胚發(fā)育數(shù)量，45天后統(tǒng)計(jì)體胚苗的數(shù)量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4所示。表4基因型為C138在不同培養(yǎng)基上體胚誘導(dǎo)情況注：+生長(zhǎng)差，++生長(zhǎng)一般；+++生長(zhǎng)好；++++生長(zhǎng)較好；+++++生長(zhǎng)最好，下同。由表4看出，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的SA，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)率均高于對(duì)照組，不同培養(yǎng)基體胚發(fā)育情況如圖3所示。在不添加任何激素的基本培養(yǎng)基上，基因型為C138的雜交鵝掌楸體胚誘導(dǎo)率為0，當(dāng)在基本培養(yǎng)基中添加SA時(shí)，其體胚誘導(dǎo)率明顯上升，并隨著濃度的上升，誘導(dǎo)率也隨之提高。但是，當(dāng)SA濃度高于0.25mg/L時(shí)，體胚誘導(dǎo)率開始下降。從表格中可以看出，該基因型在4號(hào)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率(3/4MS+SA0.25mg/L)最高，達(dá)到了60.2％，生長(zhǎng)勢(shì)最好。成熟率與其它培養(yǎng)基相比，均高出4％-8％左右，但是畸形率差別不大，均在8％左右。因此單一SA對(duì)C138體胚誘導(dǎo)的最佳濃度是0.25mg/L。2)用移液槍吸取2mL基因型為243012的液體懸浮細(xì)胞，均勻的鋪在不同濃度的不同濃度的SA體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(SA濃度為編號(hào)1：0mg/L，編號(hào)2：0.01mg/L，編號(hào)3：0.05mg/L，編號(hào)4：0.25mg/L，編號(hào)5：1.25mg/L)，在28天后在顯微鏡下觀察和統(tǒng)計(jì)體胚發(fā)育數(shù)量，45天后統(tǒng)計(jì)體胚苗的數(shù)量，不同培養(yǎng)基體胚發(fā)育情況如圖4所示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表5所示：表5基因型為243012在不同培養(yǎng)基上體胚誘導(dǎo)情況由表5看出，基因型為243012的雜交鵝掌楸在單一SA處理后體胚誘導(dǎo)情況與基因型為C138的雜交鵝掌楸體胚誘導(dǎo)情況相似，其誘導(dǎo)率均高于正對(duì)照，即不加任何激素的3/4MS基本培養(yǎng)基。當(dāng)隨著SA濃度的上升，其體胚誘導(dǎo)率也隨之提高。在此次試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基依舊是4號(hào)培養(yǎng)基(3/4MS+SA0.25mg/L)，誘導(dǎo)率達(dá)到了60％，生長(zhǎng)勢(shì)較高。從上表中明顯看出，當(dāng)SA濃度達(dá)到1.25mg/L時(shí)，體胚誘導(dǎo)率明顯下降，比1號(hào)培養(yǎng)基(SA0.01mg/L)低了5.4％，比4號(hào)培養(yǎng)基(SA0.25mg/L)低了9％。說明該基因型在高濃度的SA條件下對(duì)體胚發(fā)生有一定的抑制作用。3)用移液槍吸取2mL基因型為253010的液體懸浮細(xì)胞，均勻的鋪在不同濃度不同濃度的SA體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(SA濃度為編號(hào)1：0mg/L，編號(hào)2：0.01mg/L，編號(hào)3：0.05mg/L，編號(hào)4：0.25mg/L，編號(hào)5：1.25mg/L)，在28天后在顯微鏡下觀察和統(tǒng)計(jì)體胚發(fā)育數(shù)量，45天后統(tǒng)計(jì)體胚苗的數(shù)量，不同培養(yǎng)基體胚發(fā)育情況如5所示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表6所示。表6基因型為253010在不同培養(yǎng)基上體胚誘導(dǎo)情況由表6可以看出，基因型為253010雜交鵝掌楸在4號(hào)培養(yǎng)基(SA0.25mg/L)上體胚誘導(dǎo)率最高，為51.9％。該基因型在不同濃度的SA誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，體胚發(fā)生率隨著SA濃度的提高而上升，但與前兩組基因型相比，該基因型的誘導(dǎo)率偏低，在50％左右，體胚成熟率在40％左右。并且不同濃度間的差異性不大，成熟率變化幅度在2％-3％之間，生長(zhǎng)勢(shì)較均一，但與對(duì)照組相比，其誘導(dǎo)率為較高。與前2組相比較，當(dāng)SA濃度超過0.25mg/L時(shí)，此時(shí)體胚發(fā)生率沒有明顯的下降，只下降了0.5％。4)用移液槍吸取2mL基因型為C138的液體懸浮細(xì)胞，均勻的鋪在不同濃度的SA和ABA的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(激素配比濃度為編號(hào)1：ABA2.0mg/L+SA0.0mg/L，編號(hào)2：ABA2.0mg/L+SA0.01mg/L，編號(hào)3：ABA2.0mg/L+SA0.05mg/L，編號(hào)4：ABA2.0mg/L+SA0.25mg/L，編號(hào)5：ABA2.0mg/L+SA1.25mg/L)，在28天后在顯微鏡下觀察和統(tǒng)計(jì)體胚發(fā)育數(shù)量，45天后統(tǒng)計(jì)體胚苗的數(shù)量，體胚發(fā)育情況如圖6所示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表7所示。表7基因型為C138在不同培養(yǎng)基上體胚誘導(dǎo)情況由表7可以看出，分別選擇濃度為ABA2.0mg/L與不同濃度的SA進(jìn)行體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)，結(jié)果顯示，該基因型在3號(hào)培養(yǎng)基(SA0.05mg/L)時(shí)，誘導(dǎo)率最高，為57.8％，成熟率為54.3％，畸形率為3.4％。其次為4號(hào)培養(yǎng)基(SA0.25mg/L),誘導(dǎo)率與3號(hào)培養(yǎng)基僅相差0.2％。根據(jù)表中數(shù)據(jù)顯示，在SA與ABA配合培養(yǎng)基上，體胚誘導(dǎo)率隨著SA濃度的上升而上升。當(dāng)SA為0.01mg/L時(shí)，體胚誘導(dǎo)率高出對(duì)照組5.9％，說明SA對(duì)體胚誘導(dǎo)有著明顯的效果。但是當(dāng)濃度達(dá)到1.25mg/L時(shí)，體胚誘導(dǎo)率明顯下降，且低于對(duì)照，比對(duì)照組低了5％左右。從畸形率發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組畸形率為7.2％，當(dāng)在ABA的培養(yǎng)基上添加SA后，畸形率顯著下降，均在3％-4％左右，可見ABA與SA組合后，有利于抑制畸形胚的萌發(fā)。5)用移液槍吸取2mL基因型為243012的液體懸浮細(xì)胞，均勻的鋪在不同濃度的SA和ABA的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(激素配比濃度為編號(hào)1：ABA2.0mg/L+SA0.0mg/L，編號(hào)2：ABA2.0mg/L+SA0.01mg/L，編號(hào)3：ABA2.0mg/L+SA0.05mg/L，編號(hào)4：ABA2.0mg/L+SA0.25mg/L，編號(hào)5：ABA2.0mg/L+SA1.25mg/L)，在28天后在顯微鏡下觀察和統(tǒng)計(jì)體胚發(fā)育數(shù)量，45天后統(tǒng)計(jì)體胚苗的數(shù)量，體胚發(fā)育情況如圖7所示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表8所示。表8基因型為243012在不同培養(yǎng)基上體胚誘導(dǎo)情況由表8所示，在不同濃度SA與2.0mg/LABA的組合培養(yǎng)基上，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，體胚發(fā)生率隨之SA濃度的上升而提高。當(dāng)SA濃度為0.05mg/L時(shí)，體胚誘導(dǎo)率最高，生長(zhǎng)勢(shì)較好，此時(shí)體胚發(fā)生率為62.6％，成熟率為59.5％，畸形率為3.1％。與C138基因型相似的是，當(dāng)濃度提高到0.25mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率有所下降，但是不是很明顯，僅低于3號(hào)培養(yǎng)基1.6％。但是當(dāng)濃度繼續(xù)提高至1.25mg/L時(shí)，體胚誘導(dǎo)率直線下降，比4號(hào)培養(yǎng)基下降了12％，同時(shí)，比對(duì)照組實(shí)驗(yàn)低了3％。猜測(cè)高濃度的SA與ABA相結(jié)合后，對(duì)體胚發(fā)生具有抑制作用。從畸形率，可以看出，對(duì)照組畸形率較高，為6.2％，當(dāng)添加不同濃度的SA后，畸形率明顯下降，畸形率均在3％左右?？梢奡A與ABA組合使用時(shí)，能有效的抑制畸形胚的發(fā)生。5)用移液槍吸取2mL基因型為253010的液體懸浮細(xì)胞，均勻的鋪在不同濃度的SA和ABA的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(激素配比濃度為編號(hào)1：ABA2.0mg/L+SA0.0mg/L，編號(hào)2：ABA2.0mg/L+SA0.01mg/L，編號(hào)3：ABA2.0mg/L+SA0.05mg/L，編號(hào)4：ABA2.0mg/L+SA0.25mg/L，編號(hào)5：ABA2.0mg/L+SA1.25mg/L)，在28天后在顯微鏡下觀察和統(tǒng)計(jì)體胚發(fā)育數(shù)量，45天后統(tǒng)計(jì)體胚苗的數(shù)量，體胚發(fā)育情況如圖8所示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表9所示。表9基因型為253010在不同培養(yǎng)基上體胚誘導(dǎo)情況由表9所示，該基因型與前2組基因型相比，誘導(dǎo)率偏低，均在45％-53％左右。與前兩組實(shí)驗(yàn)相似的是體胚誘導(dǎo)率隨著SA濃度的上升而提高，但是當(dāng)濃度達(dá)到1.25mg/L時(shí)，體胚誘導(dǎo)率明顯下降。在結(jié)果中，可以發(fā)現(xiàn)有2組培養(yǎng)基配方均達(dá)到了52.6％，分別是3號(hào)培養(yǎng)(SA0.05mg/L)和4號(hào)培養(yǎng)基(SA0.25mg/L)。但是當(dāng)SA濃度為0.05mg/L時(shí)的體胚成熟率比SA濃度為0.25mg/L時(shí)高出1.4％；并且在畸形率上，當(dāng)SA0.05mg/L時(shí)的畸形率比SA0.25mg/L的畸形率低1.4％。因此，為了能高效的培育出優(yōu)良的體胚苗，應(yīng)選擇3號(hào)培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基，即3/4MS+ABA2.0mg/L+SA0.05mg/L?；温实慕Y(jié)果表明，在不添加SA的培養(yǎng)基上，畸形率較高，達(dá)到了9.1％，當(dāng)添加SA后，畸形率開始下降，在5％-7％左右，比前兩個(gè)基因型的畸形率要高。實(shí)施例3將雜交鵝掌楸愈傷組織直接轉(zhuǎn)接到添加不同濃度的SA固體培養(yǎng)基上，每皿接5個(gè)細(xì)胞塊，每個(gè)濃度接種6皿。初代培養(yǎng)環(huán)境為暗培養(yǎng)，待愈傷組織長(zhǎng)出胚型結(jié)構(gòu)后，調(diào)整光照環(huán)境，改為光培養(yǎng)16h，暗培養(yǎng)8h，溫度為24℃。具體添加濃度如表10所示。表10SA添加濃度其中瓊脂8.0g/L，水解乳蛋白0.5g/L，活性炭4.0g/L，蔗糖40g/L，pH5.7-5.8。分別將基因型為C138、243012、253010雜交鵝掌楸愈傷組織轉(zhuǎn)接于添加不同濃度的SA固體培養(yǎng)基上(表10)，培養(yǎng)28天后，未見有明顯的體胚出現(xiàn)，但是在繼代兩次后，愈傷組織上開始出現(xiàn)胚性組織，在體視顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)體胚數(shù)量和發(fā)育情況。結(jié)果如表11、12和13所示。表11基因型為C138在不同培養(yǎng)基上體胚發(fā)育情況表12基因型為243012在不同培養(yǎng)基上體胚發(fā)育情況表13基因型為253010在不同培養(yǎng)基上體胚發(fā)育情況如表11、12、13所示，這三個(gè)基因型的雜交鵝掌楸在這幾個(gè)不同培養(yǎng)基上，出胚最多的培養(yǎng)基為7號(hào)培養(yǎng)基，即3/4MS+SA0.05mg/L。雖然在添加SA的培養(yǎng)基上均能成功誘導(dǎo)出體胚，但是不同濃度的SA誘導(dǎo)率有明顯的差異，隨著SA的濃度的提高，出胚率也隨之上升。C138隨著SA的濃度從0.01mg/L到0.05mg/L,體胚誘導(dǎo)率從11％提高到了30％；243012隨著SA的濃度從0.01mg/L到0.05mg/L,體胚誘導(dǎo)率從15％提高到了47.5％從；253010隨著SA的濃度從0.01mg/L到0.05mg/L，體胚誘導(dǎo)率從5％提高到了95％。從整個(gè)結(jié)果可以看出，基因型為C138和243012的雜交鵝掌楸出胚率較低，而基因型為253010的出胚率較高，最高值達(dá)到95％，同時(shí)，在不添加任何激素的培養(yǎng)基上，該基因型也能出胚。從愈傷組織狀態(tài)來看，253010的狀態(tài)最佳，均為黃色，顆粒較小。在高濃度的SA條件下，雖有褐色愈傷組織出現(xiàn)，但是不影響出胚率。而其余兩個(gè)基因型愈傷組織狀態(tài)均有顆粒粗糙，細(xì)胞含水量較多的情況如圖9，10所示。從出胚時(shí)間來看，在不添加SA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，不管是哪種基因型，其出胚時(shí)間普遍較晚，要到80d左右，最好的基因型253010也要到40d左右才能出胚，但是在后期添加不同濃度的SA后，出胚時(shí)間開始提前。當(dāng)SA濃度為0.01mg/L時(shí)，C138和243012在57d后就能出胚，而253010出胚時(shí)間較早，在30天左右就能出胚。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，隨著SA濃度的提高，不同基因型出胚時(shí)間也隨之提前。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3