本發(fā)明通常涉及蘆筍雜交領(lǐng)域，且特別地，涉及提高蘆筍雜交親本純度的方法。
背景技術(shù)：
蘆筍是雌雄異株，親本繁殖困難。一般采用蘆筍組織培養(yǎng)，快速大量繁殖親本。理論上，經(jīng)組織培養(yǎng)技術(shù)獲得的體細(xì)胞無(wú)性系應(yīng)該與原供體植株完全一樣，但是，實(shí)際上植物離體組織或細(xì)胞培養(yǎng)物在脫分化、分化和形成再生植株過(guò)程中，遺傳變異是經(jīng)常發(fā)生的現(xiàn)象。體細(xì)胞無(wú)性系變異頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自然突變頻率，在一個(gè)組織培養(yǎng)周期內(nèi)可產(chǎn)生1％～3％的無(wú)性系變異，有時(shí)甚至高達(dá)90％以上，某一具體性狀的變異率在0.2％～3％之間。因此，在蘆筍的雜交制種過(guò)程中，通過(guò)組織培養(yǎng)繁殖的親本群體中，可能存在較多的這種不確定性變異，這些變異對(duì)種子真實(shí)性、純度以及產(chǎn)品質(zhì)量等都有直接的不利影響，應(yīng)嚴(yán)格篩選并去除親本中變異雜株。
蘆筍是典型的雌雄異株植物，有雄株(基因型m-，即：mm超雄株或mm雄株)和雌株(基因型mm)之分。一般認(rèn)為蘆筍雌株只開(kāi)雌花，雄株只開(kāi)雄花。蘆筍雌花雌蕊正常，有健全的子房和柱頭，雄蕊一律高度退化。蘆筍雄花雄蕊健全，雌蕊退化程度高，子房很小，無(wú)柱頭。在蘆筍自然群體中，還存在一種兩性花，它的雄蕊正常發(fā)育，雌蕊未完全退化，它形同雄花，又具有一定的結(jié)實(shí)率，可結(jié)少量的果實(shí)及形成少量的種子，具有此花的植株被稱為雄性雌型株(基因型亦為mm)，俗稱兩性植株。兩性株外表酷似普通雄株，與之沒(méi)有明顯差異，兩性花花形也與雄花相似，只是花的結(jié)構(gòu)存在較大差異。兩性花不僅雄蕊健全，還有健全程度不同的雌蕊，有子房和柱頭，能夠自交結(jié)實(shí)。已有研究表明兩性株的兩性花發(fā)育及結(jié)實(shí)受常染色體上存在的性別調(diào)節(jié)因子和環(huán)境因素影響。兩性株自然發(fā)生頻率不一致，高的可以達(dá)到20％以上。因此，父本中兩性株的產(chǎn)生原因主要有兩方面：一是，自然發(fā)生；二是，在親本組培繁殖的過(guò)程中，外界的培養(yǎng)環(huán)境增加了這些調(diào)控基因表達(dá)的頻率，造成兩性株出現(xiàn)的機(jī)會(huì)增大。因此，在蘆筍雜交制種過(guò)程中，需要嚴(yán)格鑒定并去除父本中存在的兩性株。
目前，我國(guó)生產(chǎn)上應(yīng)用的蘆筍品種絕大多數(shù)是雜交種，若雜交種的種子純度不高就投放市場(chǎng)，常常會(huì)給生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。并且蘆筍是多年生草本植物，種植一次，可以連年生長(zhǎng)10-15年。因此，如果制種前蘆筍親本不純，特別是父本中殘留有兩性植株，將影響若干年制種的雜交種種子純度。而純度不高的雜交種種子一旦播種，也會(huì)影響后面10-15年左右的蘆筍產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)效益。
因此，在蘆筍雜交制種技術(shù)中，如何快速、準(zhǔn)確地鑒別和去除混雜在親本群體中的雜株，特別是兩性株，是確保蘆筍雜交種子純度和提升蘆筍雜交種產(chǎn)量的關(guān)鍵技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供由一種提高蘆筍雜交親本純度的方法，其通過(guò)檢測(cè)親本植株的光合速率值，選取異常光合速率值，將異常光合速率值所對(duì)應(yīng)的親本植株作為候選雜株，再進(jìn)一步觀察候選雜株的株高、擬葉密集程度、擬葉綠色程度等農(nóng)藝性狀，對(duì)其與親本群體植株間存在較大差異的雜株予以立即清除，最后再根據(jù)花器官結(jié)構(gòu)，鑒別出并清除兩性植株。本方法利用光合速率值對(duì)親本群體進(jìn)行初步篩選，大大縮小異常植株的數(shù)量，然后再根據(jù)花朵器官結(jié)構(gòu)鑒定兩性植株，快速、準(zhǔn)確地去除親本群體中的兩性植株，以提高親本植株制備的雜交種子的質(zhì)量。
本發(fā)明提供一種提高蘆筍雜交親本純度的方法，其包括：
(i)測(cè)量用于制備蘆筍雜交種的親本植株同一部位擬葉的光合速率值pi；
(ii)根據(jù)篩選規(guī)則篩選出異常光合速率值pi′，并將所述異常光合速率值pi′所對(duì)應(yīng)的植株標(biāo)記為候選雜株；
(iii)觀察所述候選雜株的株高、擬葉密集程度、擬葉綠色程度，確定雜株，并予以去除；
(iv)在開(kāi)花期觀察所述步驟(iii)剩余的父本植株的花器官，將所述花器官中同時(shí)存在雄蕊和雌蕊的兩性植株清除；
其中，所述篩選規(guī)則為：獲得所述親本植株的平均光合速率值
在某些實(shí)施方式中，其中所述篩選規(guī)則還包括：
預(yù)設(shè)一光合速率閾值p，當(dāng)所述光合速率值pi小于等于所述光合速率閾值p時(shí)，則清除該光合速率值pi所對(duì)應(yīng)的親本雜株；
其中，
在某些實(shí)施方式中，其中所述雄性父本親本植株的所述有效范圍區(qū)間的確定過(guò)程為：
將親本植株的光合速率值pi與所述親本植株的平均光合速率值
方差分析結(jié)果獲得有效光合速率值，所述有效光合速率值的方差分析結(jié)果為非顯著，且非極顯著；
統(tǒng)計(jì)所述有效光合速率值的范圍作為所述親本植株的所述有效范圍區(qū)間。
在某些實(shí)施方式中，其中制備蘆筍雜交種的親本均為組織培養(yǎng)繁殖的雌雄無(wú)性系。
在某些實(shí)施方式中，其中所述步驟(iv)中在花蕾期且花蕾的長(zhǎng)度值大于3.5mm時(shí)觀察所述異常植株的花器官。
在某些實(shí)施方式中，其中所述步驟(iv)中利用放大鏡或顯微鏡觀察父本植株的花器官。
具體實(shí)施方式
通過(guò)解釋以下本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)將變得清楚。
現(xiàn)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的多種示例性實(shí)施方式，該詳細(xì)說(shuō)明不應(yīng)認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制，而應(yīng)理解為是對(duì)本發(fā)明的某些方面、特性和實(shí)施方案的更詳細(xì)的描述。
應(yīng)理解本發(fā)明中所述的術(shù)語(yǔ)僅僅是為描述特別的實(shí)施方式，并非用于限制本發(fā)明。另外，對(duì)于本發(fā)明中的數(shù)值范圍，應(yīng)理解為具體公開(kāi)了該范圍的上限和下限以及它們之間的每個(gè)中間值。在任何陳述值或陳述范圍內(nèi)的中間值以及任何其他陳述值或在所述范圍內(nèi)的中間值之間的每個(gè)較小的范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立地包括或排除在范圍內(nèi)。
除非另有說(shuō)明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所述領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然本發(fā)明僅描述了優(yōu)選的方法和材料，但是在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中也可以使用與本文所述相似或等同的任何方法和材料。本說(shuō)明書(shū)中提到的所有文獻(xiàn)通過(guò)引用并入，用以公開(kāi)和描述與所述文獻(xiàn)相關(guān)的方法和/或材料。在與任何并入的文獻(xiàn)沖突時(shí)，以本說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容為準(zhǔn)。
本發(fā)明中，名詞術(shù)語(yǔ)既包括單數(shù)形式，也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另行明確指出。本發(fā)明中所述的“至少之一”或“至少一種”不僅僅指包含“一個(gè)”或“一種”的情況，更重要的還包含“多個(gè)”或“多種”的情況。
本發(fā)明提供一種提高蘆筍雜交親本純度的方法，其包括：
(i)測(cè)量用于制備蘆筍雜交種的親本植株同一部位擬葉的光合速率值pi；
(ii)根據(jù)篩選規(guī)則篩選出異常光合速率值pi′，并將所述異常光合速率值pi′所對(duì)應(yīng)的植株標(biāo)記為候選雜株；
(iii)觀察所述候選雜株的株高、擬葉密集程度、擬葉葉色，去除所述候選植株中的雜株；
(iv)在開(kāi)花期觀察所述步驟(iii)剩余的父本植株的花器官，將所述花器官中同時(shí)存在雄蕊和雌蕊的兩性植株清除；
其中，所述篩選規(guī)則為：獲得所述親本植株的平均光合速率值
本發(fā)明中蘆筍親本的繁育為無(wú)性繁殖，檢測(cè)變異植株與正常植株間的光合速率值的差異，在制備蘆筍雜交種的親本植株群體間進(jìn)行初步篩選鑒別出候選雜株，并進(jìn)一步觀察候選雜株的株高、擬葉密集程度、擬葉綠色程度等農(nóng)藝性狀，最終確定雜株，并去除雜株。通過(guò)觀察父本花器官結(jié)構(gòu)確定兩性植株并及時(shí)清除，解決蘆筍雜交制種過(guò)程中，親本群體中摻雜的變異株和兩性植株，提高雜交親本群體的純度，確保利用雜交親本制備雜交種的質(zhì)量。
蘆筍雜交制種時(shí)，親本群體數(shù)量較大，但是摻雜在親本群體中的雜株和兩性植株相對(duì)較少，如果每株親本植株都要調(diào)查株高、擬葉密集程度、擬葉綠色程度等農(nóng)藝性狀，非常耗時(shí)間，且難度較大，不利于大批量制備雜交種。
本發(fā)明中，所述篩選規(guī)則還包括：
在制備某一蘆筍雜交種時(shí)，親本群體中雌性母本和雄性父本均為組織培養(yǎng)繁殖的雌、雄無(wú)性系，因此，雄性父本群體中每個(gè)植株間的光合速率值的差異不大，且雌性母本群體中每個(gè)植株間的光合速率值的差異也不大，因此，當(dāng)親本群體中存在某一植株的光合速率值與平均光合速率值的差異很大時(shí)，則說(shuō)明該植株是親本群體中的雜株，因此，將該植株直接從親本群體中去除，提升效率，提高親本純度。
本發(fā)明中，所述親本植株的所述有效范圍區(qū)間的確定過(guò)程為：
將親本植株的光合速率值pi與所述親本植株的平均光合速率值
方差分析結(jié)果獲得有效光合速率值，所述有效光合速率值的方差分析結(jié)果為非顯著，且非極顯著；
統(tǒng)計(jì)所述有效光合速率值的范圍作為所述親本植株的所述有效范圍區(qū)間。
親本群體中，擬葉密集程度、擬葉綠色程度等性狀變異的植株與親本植株的光合速率具有很大的差異，將每個(gè)親本植株的光合速率值與平均光合速率值
方差分析可以利用spss進(jìn)行方差分析，或者其他方差分析軟件，在95％置信度時(shí)，對(duì)光合速率值p1i進(jìn)行顯著性分析，若顯著性水平sig<0.05，說(shuō)明該光合速率值p1i為顯著，若顯著性水平sig<0.01，說(shuō)明該光合速率值p1i為極顯著，因此，從親本植株中篩選出方差分析結(jié)果中既不顯著，也不極顯著，即非顯著且非極顯著的光合速率值作為有效光合速率值。
本發(fā)明中根據(jù)親本群體中各個(gè)植株的光合速率的實(shí)際情況，利用方差分析進(jìn)行顯著性分析，提高確定有效范圍區(qū)間端點(diǎn)值的準(zhǔn)確性，提高篩選異常植株的準(zhǔn)確性。
本發(fā)明中，所述平均光合速率值
分別測(cè)量雄性父本群體單株和雌性母本群體植單株的光合速率值，并分別計(jì)算雄性父本植株的平均光合速率值
進(jìn)一步地，其中雄性父本植株的所述有效范圍區(qū)間可以通過(guò)上述方差分析方法，而所述雌性母本植株的所述有效范圍區(qū)間為
本發(fā)明中，制備蘆筍雜交種的親本均為組織培養(yǎng)繁殖獲得的雌、雄無(wú)性系。
本發(fā)明中，所述步驟(iv)中在花蕾期且花蕾的長(zhǎng)度值大于3.5mm時(shí)觀察所述父本植株的花朵器官。
在花蕾的長(zhǎng)度值大于3.5mm時(shí)觀察蘆筍花朵器官的結(jié)構(gòu)，兩性植株的花朵結(jié)構(gòu)包括：雄蕊健全，還有健全程度不同的雌蕊，子房和柱頭。兩性植株的花朵結(jié)構(gòu)與雄性植株的花朵結(jié)構(gòu)和雌性植株的花朵結(jié)構(gòu)差異明顯，方便花器官觀察。
本發(fā)明中，所述步驟(iv)中利用放大鏡或顯微鏡觀察所述異常植株的花朵器官。
對(duì)兩性花植株進(jìn)行鑒別可以通過(guò)放大裝置來(lái)進(jìn)行，為了更好的鑒別兩性花，有助于觀察花器官的放大裝置例如但不限于便攜式放大裝置或臺(tái)式放大裝置。所述便攜式放大裝置例如便攜式放大鏡或顯微鏡。所述臺(tái)式放大裝置例如但不限于臺(tái)式顯微鏡，如實(shí)體纖維鏡。
去除兩性植株可以通過(guò)去除兩性植株的花結(jié)構(gòu)或直接去除兩性植株，本發(fā)明可以在制種階段簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速的提高父本群體純度，避免或減少兩性花自交結(jié)實(shí)，從而達(dá)到提高蘆筍雜交制種種子純度的目的。此方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、低成本、安全無(wú)污染，可用于大田操作。
實(shí)施例1
以群體數(shù)量為250株的親本群體為例，利用本發(fā)明的提高蘆筍雜交親本純度的方法提高其親本的純度，其具體為：
上述親本群體中包括125株雄性父本植株和125株雌性母本植株。
(i)測(cè)量250株親本植株每一株的光合速率值pi；包括125株雄性父本植株的p1i和125株雌性母本植株的光合速率值p2i；
(ii)利用篩選規(guī)則分別對(duì)125株雄性父本植株和125株雌性母本植株進(jìn)行初步篩選，分別從雄性父本植株和雌性母本植株中篩選異常植株；
(a)從雄性父本植株群體中篩選異常植株：
計(jì)算所有雄性父本植株的光合速率值p1i的平均光合速率值
每個(gè)雄性父本植株的光合速率值p1i與所述雄性父本植株的平均光合速率值
在方差分析結(jié)果中將標(biāo)記出方差分析結(jié)果為顯著或極顯著的光合速率值，將未標(biāo)注的光合速率值作為有效光合速率值；
將所有有效光合速率值順序排列，以其中的光合速率最大值m和光合速率最小值n作為端點(diǎn)值，確定該雄性父本植株光合速率值的有效范圍區(qū)間n-m；
查找所有雄性父本植株的光合速率值p1i未位于有效范圍區(qū)間[n,m]范圍內(nèi)的雄性父本植株的光合速率值，并將該光合速率值所對(duì)應(yīng)的雄性父本植株作為候選雜株；
在對(duì)125株雄性父本植株進(jìn)行異常植株的篩選過(guò)程中，該雄性父本植株的光合速率有效范圍區(qū)間為20.25至21.36，且在125株雄性父本植株中發(fā)現(xiàn)8株候選雜株；
此外，根據(jù)平均光合速率值
因此，最終在上述雄性父本群中確定8株候選雜株。
對(duì)8株候選雜株的株高、擬葉密集程度、擬葉綠色程度等農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)有1株雄性父本植株擬葉明顯比其它植株密集，直接清除雄性父本植株中的異常雜株。
在花蕾期且花蕾的長(zhǎng)度值大于4mm時(shí)觀察雄性父本植株的花器官。在本實(shí)施例中使用放大鏡在田間觀察上述父本植株的花器官結(jié)構(gòu)；通過(guò)花器官的觀察發(fā)現(xiàn)，其中有1株雄性植株的花器官中存在雄蕊和子房，且子房上有花柱和柱頭，將這1株雄性父本植株確定為兩性株；去除雄性父本群體中的兩性植株。
(b)從雌性母本植株群體中篩選異常植株：
計(jì)算125株雌性母本植株的光合速率值p2i的平均光合速率值
在方差分析結(jié)果中將標(biāo)記出方差分析結(jié)果為顯著或極顯著的光合速率值，將未標(biāo)注的光合速率值作為有效光合速率值；
將所有有效光合速率值順序排列，以其中的光合速率最大值m和光合速率最小值n作為端點(diǎn)值，確定該雌性母本植株光合速率值的有效范圍區(qū)間n-m；
查找所有雌性母本植株的光合速率值p2i未位于有效范圍區(qū)間[n,m]范圍內(nèi)的雌性母本植株的光合速率值，并將該光合速率值所對(duì)應(yīng)的雌性母本植株作為候選雜株；
在對(duì)125株雌性母本植株進(jìn)行異常植株的篩選過(guò)程中，該雌性母本植株的光合速率有效范圍區(qū)間為19.15至20.56，且在125株雌性母本植株中發(fā)現(xiàn)10株候選雜株；
此外，根據(jù)平均光合速率值
因此，最終在上述雌性母本群中確定5株候選雜株。
對(duì)5株候選雜株的株高、擬葉密集程度、擬葉綠色程度等農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)有1株雌性母本植株擬葉明顯比其它植株密集，有1株雌性母本植株擬葉明顯比其它植株顏色更深，直接清除雌性母本植株中的異常雜株。
在本實(shí)施例中，利用光合速率檢測(cè)儀在一天內(nèi)完成250株的親體群體的光合速率檢測(cè)工作，快速?gòu)?50株親本群體植株中確定13株候選雜株。
在不背離本發(fā)明的范圍或精神的情況下，可對(duì)本發(fā)明說(shuō)明書(shū)的具體實(shí)施方式做多種改進(jìn)和變化，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。由本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)得到的其他實(shí)施方式對(duì)技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例僅是示例性的。