本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型的構(gòu)建及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

成骨細(xì)胞(osteoblast，ob)是骨形成和修復(fù)的主要功能細(xì)胞。成骨細(xì)胞能合成、分泌膠原與糖蛋白形成骨基質(zhì)，并促進(jìn)基質(zhì)礦化形成骨組織；同時(shí)，成骨細(xì)胞還參與破骨細(xì)胞性骨吸收的調(diào)控作用，維持骨的代謝平衡。因此，成骨細(xì)胞的功能狀態(tài)與骨骼生長(zhǎng)、塑造、再造有著極其密切的聯(lián)系。任何抑制成骨細(xì)胞生成和分化，促進(jìn)其凋亡的因素均可使骨形成降低，骨再建失衡，導(dǎo)致骨量減少。成骨細(xì)胞成骨是一個(gè)受多基因調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，目前仍有許多相關(guān)機(jī)制尚未被闡明。

微管微絲交聯(lián)因子1(macf1)是一種新型的細(xì)胞骨架交聯(lián)分子。作為骨架交聯(lián)蛋白超家族成員之一，它既能與微管連接，也能與微絲相連，而且能選擇性地限制自身與微絲微管之間的相互作用，在協(xié)調(diào)細(xì)胞的發(fā)育及維持組織的完整性中具有重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)：macf1在前成骨細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)，并與纖維型肌動(dòng)蛋白和微管部分共定位，在成骨細(xì)胞響應(yīng)力學(xué)環(huán)境刺激時(shí)，這種共定位分布會(huì)發(fā)生改變(qianar,etal.[j].bioelectromagnetics,2009oct.30(7):545–555)；低表達(dá)macf1的前成骨細(xì)胞增殖和分化功能受到抑制(hulf,etal.[j].bmbrep.2015oct.48(10):583-588.)。

這些結(jié)果證明了macf1參與成骨細(xì)胞分化過(guò)程，在骨形成過(guò)程中可能具有重要作用。目前關(guān)于macf1對(duì)骨形成抑制作用的研究?jī)H限于細(xì)胞水平，常用的模型例如在前成骨細(xì)胞系mc3t3-e1中使macf1低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株(騫愛(ài)榮等.抑制小鼠macf1基因表達(dá)的shrna序列及其應(yīng)用[p].北京:cn104531700a,20150422.)等。然而細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)并不能完全反應(yīng)體內(nèi)的真實(shí)情況，需要進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。因此，本領(lǐng)域急需一種動(dòng)物模型，以便在動(dòng)物水平上研究macf1基因在成骨細(xì)胞中的功能及其在骨形成過(guò)程中的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型的構(gòu)建及應(yīng)用。本發(fā)明利用cre-loxp系統(tǒng)，通過(guò)macf1^fl/fl小鼠與成骨細(xì)胞特異性表達(dá)cre重組酶的sp7-cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，獲得成骨細(xì)胞特異性敲除macf1的小鼠模型(sp7-cre；macf1^fl/fl)。所述模型因macf1基因的條件性敲除造成小鼠骨形成能力降低。該模型可以用于研究macf1基因在成骨細(xì)胞中的功能及其在骨形成過(guò)程中的作用，同時(shí)還可以作為骨質(zhì)疏松癥及其它骨形成相關(guān)疾病發(fā)病/發(fā)生機(jī)制研究的動(dòng)物模型，并用于篩選預(yù)防、治療或改善此類疾病的藥物。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案：一種macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型的構(gòu)建方法，其特點(diǎn)是包括以下步驟：

步驟一、選用macf1^fl/+小鼠自交，擴(kuò)繁獲得純合子macf1^fl/fl小鼠；

步驟二、將獲得的macf1^fl/fl小鼠與sp7-cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，獲得半敲sp7-cre；macf1^fl/+小鼠；

步驟三、選用sp7-cre轉(zhuǎn)基因小鼠與spf級(jí)c57bl/6j小鼠交配，獲得sp7-cre轉(zhuǎn)基因小鼠。

步驟四、將獲得的半敲sp7-cre；macf1^fl/+小鼠自交，獲得macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除小鼠模型，即全敲sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠。

其中，所述步驟一、二所得到的小鼠利用特異性引物通過(guò)pcr方法進(jìn)行基因型的鑒定。

步驟一所得到的小鼠基因型鑒定的引物為：

macf1-ap179：5'-aaagaaacggaaatactggcc-3'；

macf1-ap180：5'-gcagcttaattctgccaaattc-3'。

步驟二所得到的小鼠基因型鑒定的引物為：

sp7-icre-wt-f：5'-taccagaagcgaccacttgagc-3'；

icre-mut-r：5'-gcacacagacaggagcatcttc-3'。

所述步驟三、四所得到的小鼠通過(guò)雙重pcr方法篩選鑒定，基因型鑒定所用的引物為：

macf1-ap179：5'-aaagaaacggaaatactggcc-3'；

macf1-ap180：5'-gcagcttaattctgccaaattc-3'

和

sp7-icre-wt-f：5'-taccagaagcgaccacttgagc-3'；

icre-mut-r：5'-gcacacagacaggagcatcttc-3'。

一種macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型的應(yīng)用，其特點(diǎn)是：

其一，macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型作為研究macf1基因在成骨細(xì)胞中的功能及其在骨形成過(guò)程中的作用的動(dòng)物模型。包括以下內(nèi)容中的一種或幾種：

(1)對(duì)macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型與對(duì)比動(dòng)物的成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化能力進(jìn)行檢測(cè)；

(2)對(duì)macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型與對(duì)比動(dòng)物的成骨細(xì)胞成骨分化過(guò)程中的標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)；

(3)采用qrt-pcr技術(shù)對(duì)macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型與對(duì)比動(dòng)物的骨組織成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)；

(4)采用鈣黃綠素雙標(biāo)法對(duì)macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型與對(duì)比動(dòng)物的骨形成速率進(jìn)行檢測(cè)；

(5)利用micro-ct掃描對(duì)macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型與對(duì)比動(dòng)物的骨密度及骨組織微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

其二，macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型作為研究骨質(zhì)疏松癥及其它骨形成相關(guān)疾病發(fā)病/發(fā)生機(jī)制的動(dòng)物模型。macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型可自發(fā)的產(chǎn)生骨形成相關(guān)疾病的表型特征。

其三，macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型作為篩選預(yù)防、治療或改善骨質(zhì)疏松癥及其它骨形成相關(guān)疾病的藥物的動(dòng)物模型。其包括以下步驟：

(1)給macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型施用待篩選的測(cè)試藥物；

(2)檢測(cè)macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型中的骨密度及骨組織微結(jié)構(gòu)，并與對(duì)照組進(jìn)行比較。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明利用cre-loxp系統(tǒng)，通過(guò)macf1^fl/fl小鼠與成骨細(xì)胞特異性表達(dá)cre重組酶的sp7-cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，獲得成骨細(xì)胞特異性敲除macf1的小鼠模型(sp7-cre；macf1^fl/fl)。所述模型因macf1基因的條件性敲除造成小鼠骨形成能力降低。該模型可以用于研究macf1基因在成骨細(xì)胞中的功能及其在骨形成過(guò)程中的作用，同時(shí)還可以作為骨質(zhì)疏松癥及其它骨形成相關(guān)疾病發(fā)病/發(fā)生機(jī)制研究的動(dòng)物模型，并用于篩選預(yù)防、治療或改善此類疾病的藥物。

首次建立了macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型；

運(yùn)用該模型可在體內(nèi)驗(yàn)證macf1基因在成骨細(xì)胞中的功能及其在骨形成過(guò)程中的作用；

為骨質(zhì)疏松癥及其它骨形成相關(guān)疾病發(fā)病/發(fā)生機(jī)制的研究及預(yù)防、治療或改善此類疾病的藥物的篩選提供一個(gè)可信的動(dòng)物模型。

因此，macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型將具有廣闊的應(yīng)用前景。

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中macf1基因條件性敲除小鼠模型的構(gòu)建策略示意圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中最初引入的macf1^fl/+小鼠的pcr基因型鑒定結(jié)果圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中最初引入的sp7-cre小鼠的pcr基因型鑒定結(jié)果圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中最終獲得的sp7-cre；macf1^fl/fl(cko)小鼠的pcr基因型鑒定結(jié)果圖；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例2中對(duì)cko小鼠的成骨細(xì)胞中macf1的表達(dá)鑒定結(jié)果圖；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例3中對(duì)cko小鼠的成骨細(xì)胞中相關(guān)成骨基因的表達(dá)鑒定結(jié)果圖；

圖7是本發(fā)明實(shí)施例4中利用microct對(duì)cko小鼠股骨進(jìn)行骨密度掃描的結(jié)果圖；

圖8是本發(fā)明實(shí)施例4中利用鈣黃綠素雙標(biāo)法檢測(cè)cko小鼠的骨形成速率的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例參照?qǐng)D1-8。

實(shí)施例1：構(gòu)建macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型。

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

macf1^fl/+小鼠與sp7-cre轉(zhuǎn)基因小鼠的飼養(yǎng)。

macf1^fl/+小鼠與sp7-cre轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)隔離觀察未見(jiàn)異常后進(jìn)入飼養(yǎng)區(qū)，飼養(yǎng)按照spf動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照spf動(dòng)物管理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2macf1^fl/+小鼠基因型鑒定

剪取小鼠腳趾，提取macf1^fl/+小鼠基因組dna，采用引物進(jìn)行小鼠基因型鑒定；以小鼠macf1基因序列為模板，具體設(shè)計(jì)引物序列如下：

ap179：5’-aaagaaacggaaatactggcc-3’；

ap180：5'-gcagcttaattctgccaaattc-3’。

參照?qǐng)D2，pcr鑒定結(jié)果顯示擴(kuò)增出700bp和750bp兩條帶，證明為雜合子macf1^fl/+小鼠。

1.3sp7-cre轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定。

剪取小鼠腳趾，提取sp7-cre轉(zhuǎn)基因小鼠基因組dna，采用引物進(jìn)行小鼠基因型鑒定；根據(jù)cre基因序列為模板引物序列具體設(shè)計(jì)如下：

sp7-icre-wt-f：5'-taccagaagcgaccacttgagc-3'；

icre-mut-r：5'-gcacacagacaggagcatcttc-3'。

參照?qǐng)D3，pcr鑒定結(jié)果顯示擴(kuò)增得一條445bp的條帶，證明為sp7-cre轉(zhuǎn)基因小鼠。

1.4參照?qǐng)D1，構(gòu)建macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除純合子小鼠模型。

(1)選用macf1^fl/+小鼠自交，獲得純合子macf1^fl/fl小鼠。

(2)選用sp7-cre轉(zhuǎn)基因小鼠與spf級(jí)c57bl/6j小鼠交配，獲得sp7-cre轉(zhuǎn)基因小鼠。

(3)將獲得的macf1^fl/fl小鼠與sp7-cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，獲得macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的雜合子小鼠，即半敲sp7-cre；macf1^fl/+小鼠；再利用sp7-cre；macf1^fl/+小鼠進(jìn)行自交，獲得macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的純合子小鼠，即全敲sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠，其基因型通過(guò)雙重pcr方法篩選鑒定。參照?qǐng)D4，分別獲得750bp和445bp兩個(gè)條帶，表明獲得了全敲sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠。

(4)將獲得的sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠與macf1^fl/fl小鼠進(jìn)行交配，獲得更多的sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠與macf1^fl/fl小鼠，然后對(duì)7-9天齡子代小鼠剪腳趾提取基因組dna，用雙重pcr篩選鑒定基因型，理論上產(chǎn)生的后代有1/2的macf1^fl/fl子鼠和1/2的sp7-cre；macf1^fl/fl子鼠。子鼠基因型確定后，用于macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除小鼠模型的表型鑒定。

實(shí)施例2：檢測(cè)條件性敲除的小鼠模型的成骨細(xì)胞中macf1的表達(dá)情況。

取新生小鼠顱骨成骨細(xì)胞，并提取其rna進(jìn)行sybrgreenreal-timequantitativepcr(簡(jiǎn)稱qrt-pcr)，檢測(cè)macf1在mrna水平的表達(dá)情況，以驗(yàn)證macf1在macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型的成骨細(xì)胞中低表達(dá)，從而確定動(dòng)物模型構(gòu)建成功。

參照?qǐng)D5，macf1在sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠的成骨細(xì)胞中的表達(dá)量顯著低于macf1^fl/fl小鼠，說(shuō)明macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型構(gòu)建成功。

實(shí)施例3：成骨細(xì)胞中敲除macf1對(duì)小鼠成骨細(xì)胞中相關(guān)成骨基因表達(dá)的影響。

取新生小鼠顱骨成骨細(xì)胞，提取其rna進(jìn)行qrt-pcr，檢測(cè)成骨分化標(biāo)志基因(alp、runx2、col-i、ocn)的表達(dá)情況。

參照?qǐng)D6，結(jié)果表明，與macf1^fl/fl小鼠相比，sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠成骨細(xì)胞中相關(guān)成骨基因的表達(dá)量均顯著降低，說(shuō)明在成骨細(xì)胞中敲除macf1降低了成骨細(xì)胞的分化能力。

實(shí)施例4：macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型表型的鑒定

發(fā)現(xiàn)macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠股骨骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏、骨形成能力降低。

4.1成骨細(xì)胞中敲除macf1對(duì)小鼠股骨發(fā)育的影響。

選取3月齡的sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠和macf1^fl/fl小鼠，取血處死后，剝離取出股骨，去除骨表面的軟組織，用70％乙醇固定后，采用小動(dòng)物micro-ct掃描，獲取數(shù)據(jù)后，用siemensinveonresearchworkplace軟件進(jìn)行三維重建處理。

參照?qǐng)D7，與macf1^fl/fl小鼠相比，sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠的股骨骨組織骨小梁數(shù)量明顯減少。說(shuō)明在成骨細(xì)胞中敲除macf1降低了小鼠骨密度，并改變了骨組織微結(jié)構(gòu)。

4.2成骨細(xì)胞中敲除macf1對(duì)小鼠骨形成能力的影響。

選取3月齡的sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠和macf1^fl/fl小鼠，分別于處死前10天和3天進(jìn)行腹腔注射鈣黃綠素(25mg/kg)。取脛骨，40％乙醇固定，樹(shù)脂包埋，選擇10μm脛骨樹(shù)脂切片浸泡于乙酸乙二醇乙醚溶液中避光脫脂過(guò)夜；無(wú)水乙醇漂洗后避光室溫晾干，中性樹(shù)膠封片；熒光顯微鏡495nm波長(zhǎng)下進(jìn)行雙標(biāo)觀察、測(cè)量，形態(tài)計(jì)量。

參照?qǐng)D8，與macf1^fl/fl小鼠相比，sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠的骨形成速率明顯降低，說(shuō)明在成骨細(xì)胞中敲除macf1使小鼠的骨形成能力降低。

sequencelisting

<110>西北工業(yè)大學(xué)

<120>macf1基因在成骨細(xì)胞中條件性敲除的小鼠模型的構(gòu)建及應(yīng)用

<130>說(shuō)明書，權(quán)利要求書

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aaagaaacggaaatactggcc21

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gcagcttaattctgccaaattc22

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gcacacagacaggagcatcttc22

序列表

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