本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種冬棗花藥培養(yǎng)再生單倍體植株體系及其培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
1953年，tuleck用銀杏花粉在人工培養(yǎng)基上第一次成功地誘導(dǎo)形成單倍體愈傷組織guha和maheshwari(1964)首次成功地從毛葉曼陀羅(daturainoxia)花藥培養(yǎng)中獲得單倍體植株，隨后證實是由胚狀體途徑獲得的單倍體花粉植株，從此開創(chuàng)了利用花粉培育單倍體的新途徑，近30年來，利用花藥培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體植株的技術(shù)已被廣泛應(yīng)用到10個科，24個屬，34個種的250多種植物上。果樹花藥培養(yǎng)單倍體的研究起步較晚，20世紀70年代末到80年代初先后在柑橘、蘋果、葡萄、草莓、荔枝、龍眼等樹種上取得了成功。棗(ziziphusjujubamill.)是我國特色優(yōu)勢果樹，關(guān)于棗的花藥培養(yǎng)，鮮有報道，并存在愈傷組織誘導(dǎo)率較低(43.1％)的問題。
中國專利公開號cn104041414b公開了一種辣椒花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株的方法，包括選取花蕾，花蕾消毒，花藥接種，預(yù)處理，花藥培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織再分化為單倍體植株；該發(fā)明采用固體培養(yǎng)基將小孢子和花藥壁共培養(yǎng)，低溫、熱激預(yù)處理，調(diào)節(jié)愈傷誘導(dǎo)、分化培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，提高了愈傷率和愈傷組織的分化能力；應(yīng)用此方法進行辣椒花藥培養(yǎng)，愈傷誘導(dǎo)率60％以上，出苗率80％以上，解決了辣椒花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)率低的難題。但是該發(fā)明并不適用于冬棗培養(yǎng)。
中國專利公開號cn1934932公開了一種離體誘導(dǎo)冬棗花藥愈傷組織的方法，即通過冬棗花藥的組織培養(yǎng)獲得其愈傷組織,愈傷組織誘導(dǎo)率達86.23％，包括外植體采集、消毒、初始誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)。在5～6月選取田間直徑為0.3～0.6cm、花萼尚未張開的冬棗未成熟花蕾，4℃冰箱預(yù)處理1～3d。流水沖洗1～2h,超凈工作臺上將花蕾放入70％乙醇30s，再轉(zhuǎn)入0.1％hgcl2溶液中8mic，無菌水沖洗3～4次后剝?nèi)』ㄋ?，啟動培養(yǎng)時將無菌花藥接種在ms+麥芽糖15～20g/l+tdz0.5-1.0mg/l+naa0-0.5mg/l的培養(yǎng)基上進行暗培養(yǎng)三周，然后轉(zhuǎn)至弱光下(800～1000lux)培養(yǎng)?；ㄋ幹饾u產(chǎn)生黃綠色的、松散顆粒狀的愈傷組織，且隨培養(yǎng)時間的延長逐漸增多。增殖培養(yǎng)時將獲得的初始愈傷組織轉(zhuǎn)接到ms+麥芽糖15～20g/l+tdz0.1-0.5mg/l+naa0-0.5mg/l的培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng),愈傷組織可快速增殖。該方法可在70d左右獲得大量冬棗花藥愈傷組織；但是該方法步驟繁瑣，應(yīng)用受限。
花藥培養(yǎng)是單倍體育種的重要途徑，不但縮短了育種年限，并且提高了育種效率。就棗樹而言，通過單倍體育種有可能使無性繁殖的棗樹也能用種子繁殖，并為基因型高度雜合的棗品種遺傳性研究提供純系材料，從而縮短育種年限并促進棗樹遺傳理論工作的研究。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種冬棗花藥培養(yǎng)再生單倍體植株體系及其培養(yǎng)方法，體系組成簡單，易于培養(yǎng)，通過單倍體育種使無性繁殖的棗樹也能用種子繁殖，并為基因型高度雜合的棗品種遺傳性研究提供純系材料，從而縮短育種年限并促進棗樹遺傳理論工作的研究。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
一種冬棗花藥培養(yǎng)再生單倍體植株體系，包括花藥培養(yǎng)基、一級愈傷組織培養(yǎng)基和二級愈傷組織培養(yǎng)基，
所述花藥培養(yǎng)基由1/2的ms、0.8～1.2mol/l2，4-d、18～22g/l的麥芽糖和3.2～3.7g/l的瓊脂組成；
所述一級愈傷組織培養(yǎng)基由ms、0.8～1.2mg/l的tdz、18～22g/l的麥芽糖和3.2～3.7g/l的瓊脂組成；
所述二級愈傷組織培養(yǎng)基由ms、1.8～2.2mg/l的三十烷醇、18～22g/l的麥芽糖和3.2～3.7g/l的瓊脂組成。
進一步地，所述花藥培養(yǎng)基由1/2的ms、1.0mol/l2，4-d、20g/l的麥芽糖和3.5g/l的瓊脂組成；
所述一級愈傷組織培養(yǎng)基由ms、1.0mg/l的tdz、20g/l的麥芽糖和3.5g/l的瓊脂組成；
所述二級愈傷組織培養(yǎng)基由ms、2.0mg/l的三十烷醇、20g/l的麥芽糖和3.5g/l的瓊脂組成。
一種冬棗花藥培養(yǎng)再生單倍體植株體系的培養(yǎng)方法，采用上述的冬棗花藥培養(yǎng)再生單倍體植株體系進行培養(yǎng)。
進一步地，包括以下步驟：
s1.將冬棗花蕾浸泡在0.10mol/l的甘露醇中3天，然后接種在花藥培養(yǎng)基上，培養(yǎng)40～60天，得到愈傷組織；
s2.將愈傷組織接種在一級愈傷組織培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25～35天；
s3然后將愈傷組織再接種到二級愈傷組織培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25～35天。
進一步地，所述步驟s1中，接種到花藥培養(yǎng)基后，在25～28℃下進行暗培養(yǎng)。
進一步地，所述步驟s2、步驟s3分別在25～28℃下進行培養(yǎng)。
進一步地，單倍體發(fā)生率達到33.33％。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的體系組成簡單，易于培養(yǎng)，通過單倍體育種使無性繁殖的棗樹也能用種子繁殖，并為基因型高度雜合的棗品種遺傳性研究提供純系材料，從而縮短育種年限并促進棗樹遺傳理論工作的研究。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例進一步詳細描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護范圍不局限于以下所述。
實施例1
一種冬棗花藥培養(yǎng)再生單倍體植株體系，包括花藥培養(yǎng)基、一級愈傷組織培養(yǎng)基和二級愈傷組織培養(yǎng)基，
所述花藥培養(yǎng)基由1/2的ms、0.8mol/l的2，4-d、18g/l的麥芽糖和3.2g/l的瓊脂組成；
所述一級愈傷組織培養(yǎng)基由ms、0.8mg/l的tdz、19g/l的麥芽糖和3.3g/l的瓊脂組成；
所述二級愈傷組織培養(yǎng)基由ms、2.2mg/l的三十烷醇、18g/l的麥芽糖和3.7g/l的瓊脂組成。
實施例2
一種冬棗花藥培養(yǎng)再生單倍體植株體系，包括花藥培養(yǎng)基、一級愈傷組織培養(yǎng)基和二級愈傷組織培養(yǎng)基，
所述花藥培養(yǎng)基由1/2的ms、1.2mol/l2，4-d、19g/l的麥芽糖和3.7g/l的瓊脂組成；
所述一級愈傷組織培養(yǎng)基由ms、1.1mg/l的tdz、22g/l的麥芽糖和3.2g/l的瓊脂組成；
所述二級愈傷組織培養(yǎng)基由ms、1.9mg/l的三十烷醇、20g/l的麥芽糖和3.4g/l的瓊脂組成。
實施例3
一種冬棗花藥培養(yǎng)再生單倍體植株體系，包括花藥培養(yǎng)基、一級愈傷組織培養(yǎng)基和二級愈傷組織培養(yǎng)基，
所述花藥培養(yǎng)基由1/2的ms、1.1mol/l2，4-d、22g/l的麥芽糖和3.6g/l的瓊脂組成；
所述一級愈傷組織培養(yǎng)基由ms、1.2mg/l的tdz、18g/l的麥芽糖和3.7g/l的瓊脂組成；
所述二級愈傷組織培養(yǎng)基由ms、1.8mg/l的三十烷醇、22g/l的麥芽糖和3.2g/l的瓊脂組成。
實施例4
一種冬棗花藥培養(yǎng)再生單倍體植株體系，包括花藥培養(yǎng)基、一級愈傷組織培養(yǎng)基和二級愈傷組織培養(yǎng)基，
所述花藥培養(yǎng)基由1/2的ms、1.0mol/l2，4-d、20g/l的麥芽糖和3.5g/l的瓊脂組成；
所述一級愈傷組織培養(yǎng)基由ms、1.0mg/l的tdz、20g/l的麥芽糖和3.5g/l的瓊脂組成；
所述二級愈傷組織培養(yǎng)基由ms、2.0mg/l的三十烷醇、20g/l的麥芽糖和3.5g/l的瓊脂組成。
實施例5
一種冬棗花藥培養(yǎng)再生單倍體植株體系，包括花藥培養(yǎng)基、一級愈傷組織培養(yǎng)基和二級愈傷組織培養(yǎng)基，
所述花藥培養(yǎng)基由1/2的ms、1.50mol/l2，4-d、20g/l的麥芽糖和3.5g/l的瓊脂組成；
所述一級愈傷組織培養(yǎng)基由ms、1.0mg/l的tdz、20.5g/l的麥芽糖和3.5g/l的瓊脂組成；
所述二級愈傷組織培養(yǎng)基由ms、2.0mg/l的三十烷醇、20g/l的麥芽糖和3.6g/l的瓊脂組成。
試驗例
一種冬棗花藥培養(yǎng)再生單倍體植株體系的培養(yǎng)方法，采用上述的冬棗花藥培養(yǎng)再生單倍體植株體系進行培養(yǎng)。
具體地，包括以下步驟：
s1.選擇從外觀看為黃綠色的冬棗花蕾(此時的花粉多處于單核靠邊期)，將花蕾浸泡在0.10mol/l的甘露醇中3d，然后將花藥接種在1/2ms+2，4-d1.0mol/l+麥芽糖20g/l+瓊脂3.5g/l培養(yǎng)基上，置于25-28℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，50天后花藥出愈率達98.56％；
s2.將愈傷組織接種在ms+tdz1.0mg/l+麥芽糖20g/l+瓊脂3.5g/l的培養(yǎng)基上進行增殖和分化，30天后進行觀察，愈傷組織增殖迅速，顏色翠綠，生長健壯；
s3.將愈傷組織接種到ms+三十烷醇2.0mg/l+麥芽糖20g/l+瓊脂3.5g/l的培養(yǎng)基上，經(jīng)過30天后觀察，愈傷組織分化率達100％，再生植株率8.22％；
s4.通過流式細胞儀對冬棗花藥培養(yǎng)將再生植株進行鑒定，發(fā)現(xiàn)有單倍體，以及單倍體和二倍體的嵌合體，單倍體發(fā)生率33.33％。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進行改動。而本領(lǐng)域人員所進行的改動和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。