本發(fā)明涉及一種微生物制劑及其制備方法，具體涉及一種抑制根結(jié)線蟲繁殖的微生物制劑及其制備方法和應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
根結(jié)線蟲(meloidogyne)是一種高度專化型的雜食性植物病原線蟲。根結(jié)線蟲主要為害各種蔬菜的根部，表現(xiàn)為側(cè)根和須根較正常增多，并在幼根的須根上形成球形或圓錐形大小不等的白色根瘤，有的呈念珠狀。被害株地上部生長矮小、緩慢、葉色異常，結(jié)果少，產(chǎn)量低，甚至造成植株提早死亡。
根結(jié)線蟲的生活史要經(jīng)歷卵、幼蟲和成蟲三個時期。根結(jié)線蟲主要以卵、卵囊或2齡幼蟲隨病殘體在土壤中越冬，當(dāng)氣溫達到10℃以上時，卵就能孵化出幼蟲。多數(shù)根結(jié)線蟲只進行孤雌生殖(castagnone-sereno,2006)，雌成蟲產(chǎn)卵繁殖后代的速度極快，產(chǎn)卵多，且卵和卵囊難以被普通藥物殺死，這也是多次施藥根結(jié)線蟲卻反復(fù)復(fù)發(fā)的根本原因。
活動狀態(tài)的根結(jié)線蟲對環(huán)境的適應(yīng)能力較差，不耐高溫、低溫、淹水、干旱、缺氧、高或低ph值和高滲透壓等；未孵化的卵和卵囊中的卵適應(yīng)惡劣環(huán)境的能力較強，以休眠狀態(tài)存活在土壤中。有研究發(fā)現(xiàn)0-5℃的低溫能殺死南方根結(jié)線蟲幼蟲，但不能殺死卵(劉維志，2000)，在根結(jié)線蟲在土壤里無寄主存在的條件下，仍可存活3年之久(劉善勇，2005)。
現(xiàn)有技術(shù)的防治根結(jié)線蟲的方法對成蟲殺滅效果較好，對卵和卵囊的殺滅效果較差。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種抑制根結(jié)線蟲繁殖的微生物制劑及其制備方法和應(yīng)用，提高根結(jié)線蟲的卵和卵囊的致死率，有效抑制根結(jié)線蟲繁殖。
為解決現(xiàn)有的技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
一種抑制根結(jié)線蟲繁殖的微生物制劑，包括以下組分：側(cè)孢芽孢桿菌菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、艾草粉、蒼耳子粉、煙草粉、鈣鎂磷肥。
所述的微生物制劑還包括以下組分：納豆芽孢桿菌菌粉、苦楝素、木質(zhì)素磺酸鹽、香葉烯。
所述的微生物制劑各組分的重量份配比為：
納豆芽孢桿菌菌粉0-9份、側(cè)孢芽孢桿菌菌粉1-4份、枯草芽孢桿菌菌粉4-7份、地衣芽孢桿菌菌粉3-5份、艾草粉27-32份、蒼耳子粉19-24份、煙草粉17-22份、鈣鎂磷肥18-23份、苦楝素0-2.5份、木質(zhì)素磺酸鹽0-3.5份、香葉烯0-4份。
進一步優(yōu)選，所述的微生物制劑各組分的重量份配比為：
納豆芽孢桿菌菌粉7-9份、側(cè)孢芽孢桿菌菌粉1-4份、枯草芽孢桿菌菌粉4-7份、地衣芽孢桿菌菌粉3-5份、艾草粉27-32份、蒼耳子粉19-24份、煙草粉17-22份、鈣鎂磷肥18-23份、苦楝素1-2.5份、木質(zhì)素磺酸鹽2.5-3.5份、香葉烯1-4份。
進一步優(yōu)選，所述的微生物制劑各組分的重量份配比為：
納豆芽孢桿菌菌粉7.5份、側(cè)孢芽孢桿菌菌粉2份、枯草芽孢桿菌菌粉6份、地衣芽孢桿菌菌粉4.5份、艾草粉31份、蒼耳子粉23份、煙草粉20份、鈣鎂磷肥21份、苦楝素2份、木質(zhì)素磺酸鹽3.2份、香葉烯3份。
一種抑制根結(jié)線蟲繁殖的微生物制劑的制備方法，包括以下步驟：制備微生物菌粉、噴菌后處理、稱量、非微生物組分處理和共混；
所述的噴菌后處理：將菌粉放入恒溫箱，-18℃保持60min后，以0.2℃/min的升溫速率升溫至28℃，恒溫2h，然后以0.2℃/min的降溫速率降溫至20℃。
所述的制備微生物菌粉：
將大豆磷脂和土豆淀粉按照1：5的質(zhì)量比混合均勻，過80目篩，70-80℃烘干40min，得到載體a；
將大豆粉和松花粉按2：1的質(zhì)量比混合均勻，過100目篩，經(jīng)60-65℃低溫烘干60min，得到載體b；
將魔芋粉和凹凸棒粉按照1：3的質(zhì)量比混合均勻，過100目篩，得到載體c；
將玉米淀粉和脫脂魚粉按1：1的質(zhì)量比混合均勻，過80目篩，得到載體d；
將納豆芽孢桿菌菌體均勻噴灑于載體a中，得到納豆芽孢桿菌含量為18億/g的納豆芽孢桿菌菌粉；
將側(cè)孢芽孢桿菌菌體均勻噴灑于載體b中，得到側(cè)孢芽孢桿菌含量為62億/g的側(cè)孢芽孢桿菌菌粉；
將枯草芽孢桿菌菌體均勻噴灑于載體c中，得到枯草芽孢桿菌含量為35億/g的枯草芽孢桿菌菌粉；
將地衣芽孢桿菌均勻噴灑于載體d中,得到地衣芽孢桿菌含量為54億/g的地衣芽孢桿菌菌粉。
所述的非微生物組分處理：將艾草粉、煙草粉和蒼耳子粉混合，研磨至200目的細(xì)粉，加入水配制成混合液，料液比為1:33；將混合液置于超聲波破碎儀中，超聲波破碎儀功率為1500w，處理時間為5min；將混合液濃縮烘干至含水量為9-10%的混合粉末。
一種抑制根結(jié)線蟲繁殖的微生物制劑的應(yīng)用，所述的應(yīng)用：用于植物苗期，施用量為植物培養(yǎng)基質(zhì)質(zhì)量的百分之一。
應(yīng)用后，對根結(jié)線蟲蟲卵的致死率可達85.8-99.2%，對根結(jié)線蟲卵囊的致死率可達87.8-99.7%。
由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明達到的技術(shù)效果是：
1、對根結(jié)線蟲蟲卵的致死率可達85.8-99.2%；
2、對根結(jié)線蟲卵囊的致死率可達87.8-99.7%；
3、施用本發(fā)明微生物制劑15天后，病株治愈率可達88-98%。
具體實施方式
本發(fā)明所述納豆芽孢桿菌保藏號為cicc10023；側(cè)孢芽孢桿菌保藏號為accc11079；枯草芽孢桿菌保藏號cicc10071；地衣芽孢桿菌保藏號為accc02002，上述菌種均來源于市售。
實施例1一種抑制根結(jié)線蟲繁殖的微生物制劑
所述微生物制劑包括以下重量份的組分：
側(cè)孢芽孢桿菌菌粉2份、枯草芽孢桿菌菌粉5份、地衣芽孢桿菌菌粉3份、艾草粉30份、蒼耳子粉20份、煙草粉20份、鈣鎂磷肥20份。
上述微生物制劑的制備方法包括以下步驟：
1、制備微生物菌粉
采用傳統(tǒng)的發(fā)酵方法，制備側(cè)孢芽孢桿菌菌液、枯草芽孢桿菌菌液和地衣芽孢桿菌菌液；
分別將上述菌液離心，收集菌體；
從市場上購買玉米淀粉作為微生物載體；
將側(cè)孢芽孢桿菌菌體、枯草芽孢桿菌菌體、地衣芽孢桿菌菌體分別噴灑于載體上,得到含菌量為62億/g的側(cè)孢芽孢桿菌菌粉、含菌量為35億/g的枯草芽孢桿菌菌粉和含菌量為54億/g的地衣芽孢桿菌菌粉。
2、稱量
按照一種抑制根結(jié)線蟲繁殖的微生物制劑的配方，用電子稱準(zhǔn)確稱取各原料，備用。
3、非微生物組分處理
將艾草粉、煙草粉和蒼耳子粉混合，研磨至200目的細(xì)粉，加入水配制成混合液，料液比為1:33；將混合液置于超聲波破碎儀中，超聲波破碎儀功率為1500w，處理時間為5min；將混合液濃縮烘干至含水量為9-10%的混合粉末；
將制得的混合粉末置于混料罐內(nèi)；加入鈣鎂磷肥，開啟攪拌800rpm，30min后，放料，得到非微生物組分混合料。
4、共混
將上述步驟得到的非微生物組分混合料與側(cè)孢芽孢桿菌菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉混合，為保證微生物活性，在120rpm攪拌40-50min，混合均勻，制得抑制根結(jié)線蟲繁殖的微生物制劑。
實施例2一種抑制根結(jié)線蟲繁殖的微生物制劑
所述微生物制劑包括以下重量份的組分：
納豆芽孢桿菌菌粉7份、側(cè)孢芽孢桿菌菌粉1份、枯草芽孢桿菌菌粉4份、地衣芽孢桿菌菌粉3份、艾草粉27份、蒼耳子粉19份、煙草粉17份、鈣鎂磷肥18份、苦楝素1份、木質(zhì)素磺酸鹽2.5份、香葉烯1份。
所述納豆芽孢桿菌菌粉：納豆芽孢桿菌含量為18億/g，載體由大豆磷脂、土豆淀粉按1：5的質(zhì)量比混合而成；
所述側(cè)孢芽孢桿菌菌粉：側(cè)孢芽孢桿菌含量為62億/g，載體由大豆粉、松花粉按2：1的質(zhì)量比混合而成；
所述枯草芽孢桿菌菌粉：枯草芽孢桿菌含量為35億/g，載體由魔芋粉、凹凸棒粉按1：3的質(zhì)量比混合而成；
所述地衣芽孢桿菌菌粉：地衣芽孢桿菌含量為54億/g，載體由玉米淀粉、脫脂魚粉按1：1的質(zhì)量比混合而成；
所述鈣鎂磷肥：p2o5含量7%，cao含量40%，sio2含量23%，mgo含量1%。
上述一種抑制根結(jié)線蟲繁殖的微生物制劑的制備方法，包括以下步驟：
1、制備微生物菌粉
采用傳統(tǒng)的發(fā)酵方法，制備納豆芽孢桿菌菌液、側(cè)孢芽孢桿菌菌液、枯草芽孢桿菌菌液和地衣芽孢桿菌菌液；
分別將上述菌液離心，收集菌體；
從市場上購買大豆磷脂、土豆淀粉、大豆粉、松花粉、魔芋粉、凹凸棒粉、玉米淀粉、脫脂魚粉
將大豆磷脂和土豆淀粉按照1：5的質(zhì)量比混合均勻，過80目篩，70-80℃烘干40min，得到載體a；
將大豆粉和松花粉按2：1的質(zhì)量比混合均勻，過100目篩，經(jīng)60-65℃低溫烘干60min，得到載體b；
將魔芋粉和凹凸棒粉按照1：3的質(zhì)量比混合均勻，過100目篩，得到載體c；
將玉米淀粉和脫脂魚粉按1：1的質(zhì)量比混合均勻，過80目篩，得到載體d；
將納豆芽孢桿菌菌體均勻噴灑于載體a中，得到納豆芽孢桿菌含量為18億/g的納豆芽孢桿菌菌粉；
將側(cè)孢芽孢桿菌菌體均勻噴灑于載體b中，得到側(cè)孢芽孢桿菌含量為62億/g的側(cè)孢芽孢桿菌菌粉；
將枯草芽孢桿菌菌體均勻噴灑于載體c中，得到枯草芽孢桿菌含量為35億/g的枯草芽孢桿菌菌粉；
將地衣芽孢桿菌均勻噴灑于載體d中,得到地衣芽孢桿菌含量為54億/g的地衣芽孢桿菌菌粉。
2、噴菌后處理
將步驟1制備的納豆芽孢桿菌菌粉、側(cè)孢芽孢桿菌菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉和地衣芽孢桿菌菌粉分別放入恒溫箱，-18℃保持60min后，以0.2℃/min的升溫速率升溫至28℃，恒溫2h，然后以0.2℃/min的降溫速率降溫至20℃，恒溫備用。
3、稱量
按照一種抑制根結(jié)線蟲繁殖的微生物制劑的配方，用電子稱準(zhǔn)確稱取各原料，備用。
4、非微生物組分處理
將艾草粉、煙草粉和蒼耳子粉混合，研磨至200目的細(xì)粉，加入水配制成混合液，料液比為1:33；將混合液置于超聲波破碎儀中，超聲波破碎儀功率為1500w，處理時間為5min；將混合液濃縮烘干至含水量為9-10%的混合粉末；
將制得的混合粉末置于混料罐內(nèi)；依次加入鈣鎂磷肥、苦楝素，開啟攪拌800rpm，30min；將攪拌速率升至2000rpm，邊攪拌邊向混料罐中依次加入木質(zhì)素磺酸鹽、香葉烯；攪拌10min后，放料，得到非微生物組分混合料。
5、共混
將上述步驟得到的非微生物組分混合料與納豆芽孢桿菌菌粉、側(cè)孢芽孢桿菌菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉混合，為保證微生物活性，在120rpm攪拌40-50min，混合均勻，制得抑制根結(jié)線蟲繁殖的微生物制劑。
實施例3一種抑制根結(jié)線蟲繁殖的微生物制劑
所述微生物制劑包括以下重量份的組分：
納豆芽孢桿菌菌粉8份、側(cè)孢芽孢桿菌菌粉3份、枯草芽孢桿菌菌粉5份、地衣芽孢桿菌菌粉4份、艾草粉29份、蒼耳子粉22份、煙草粉18份、鈣鎂磷肥20份、苦楝素1.5份、木質(zhì)素磺酸鹽3份、香葉烯2份。
所述納豆芽孢桿菌菌粉：納豆芽孢桿菌含量為18億/g，載體由大豆磷脂、土豆淀粉按1：5的質(zhì)量比混合而成；
所述側(cè)孢芽孢桿菌菌粉：側(cè)孢芽孢桿菌含量為62億/g，載體由大豆粉、松花粉按2：1的質(zhì)量比混合而成；
所述枯草芽孢桿菌菌粉：枯草芽孢桿菌含量為35億/g，載體由魔芋粉、凹凸棒粉按1：3的質(zhì)量比混合而成；
所述地衣芽孢桿菌菌粉：地衣芽孢桿菌含量為54億/g，載體由玉米淀粉、脫脂魚粉按1：1的質(zhì)量比混合而成；
所述鈣鎂磷肥：p2o5含量7%，cao含量40%，sio2含量23%，mgo含量1%。
上述一種抑制根結(jié)線蟲繁殖的微生物制劑的制備方法與實施例2相同。
實施例4一種抑制根結(jié)線蟲繁殖的微生物制劑
所述微生物制劑包括以下重量份的組分：
納豆芽孢桿菌菌粉7.5份、側(cè)孢芽孢桿菌菌粉2份、枯草芽孢桿菌菌粉6份、地衣芽孢桿菌菌粉4.5份、艾草粉31份、蒼耳子粉23份、煙草粉20份、鈣鎂磷肥21份、苦楝素2份、木質(zhì)素磺酸鹽3.2份、香葉烯3份。
所述納豆芽孢桿菌菌粉：納豆芽孢桿菌含量為18億/g，載體由大豆磷脂、土豆淀粉按1：5的質(zhì)量比混合而成；
所述側(cè)孢芽孢桿菌菌粉：側(cè)孢芽孢桿菌含量為62億/g，載體由大豆粉、松花粉按2：1的質(zhì)量比混合而成；
所述枯草芽孢桿菌菌粉：枯草芽孢桿菌含量為35億/g，載體由魔芋粉、凹凸棒粉按1：3的質(zhì)量比混合而成；
所述地衣芽孢桿菌菌粉：地衣芽孢桿菌含量為54億/g，載體由玉米淀粉、脫脂魚粉按1：1的質(zhì)量比混合而成；
所述鈣鎂磷肥：p2o5含量7%，cao含量40%，sio2含量23%，mgo含量1%。
上述一種抑制根結(jié)線蟲繁殖的微生物制劑的制備方法與實施例2相同。
實施例5一種抑制根結(jié)線蟲繁殖的微生物制劑
所述微生物制劑包括以下重量份的組分：
納豆芽孢桿菌菌粉9份、側(cè)孢芽孢桿菌菌粉4份、枯草芽孢桿菌菌粉7份、地衣芽孢桿菌菌粉5份、艾草粉32份、蒼耳子粉24份、煙草粉22份、鈣鎂磷肥23份、苦楝素2.5份、木質(zhì)素磺酸鹽3.5份、香葉烯4份。
所述納豆芽孢桿菌菌粉：納豆芽孢桿菌含量為18億/g，載體由大豆磷脂、土豆淀粉按1：5的質(zhì)量比混合而成；
所述側(cè)孢芽孢桿菌菌粉：側(cè)孢芽孢桿菌含量為62億/g，載體由大豆粉、松花粉按2：1的質(zhì)量比混合而成；
所述枯草芽孢桿菌菌粉：枯草芽孢桿菌含量為35億/g，載體由魔芋粉、凹凸棒粉按1：3的質(zhì)量比混合而成；
所述地衣芽孢桿菌菌粉：地衣芽孢桿菌含量為54億/g，載體由玉米淀粉、脫脂魚粉按1：1的質(zhì)量比混合而成；
所述鈣鎂磷肥：p2o5含量7%，cao含量40%，sio2含量23%，mgo含量1%。
上述一種抑制根結(jié)線蟲繁殖的微生物制劑的制備方法與實施例2相同。
實驗1：
將實施例1-5的抑制根結(jié)線蟲繁殖的微生物制劑分別制備成培養(yǎng)基質(zhì)，具體方法如下：稱取5克微生物制劑與500g滅菌土混合均勻，噴水至含水量為28-33%，得到培養(yǎng)基質(zhì)；
向?qū)嵤├?-5微生物制劑制備的培養(yǎng)基質(zhì)中分別混入等量根結(jié)線蟲的卵（未孵化的卵）和卵囊（卵囊中的卵），并置于26℃、濕度58%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h。
檢測并統(tǒng)計根結(jié)線蟲卵和卵囊的致死率，具體結(jié)果如表1所示；
表1根結(jié)線蟲卵和卵囊的致死率
可見，本發(fā)明微生物制劑對根結(jié)線蟲蟲卵的致死率可達85.8-99.2%，對根結(jié)線蟲卵囊的致死率可達87.8-99.7%，能夠很好的抑制根結(jié)線蟲的繁殖。
實驗2：
將600棵感染根結(jié)線蟲的西瓜苗株（病株）分別移栽至營養(yǎng)缽內(nèi)培養(yǎng)，分為六組，其中一組為對照組：營養(yǎng)缽內(nèi)為西瓜育苗基質(zhì)；其余五組為實驗組：營養(yǎng)缽內(nèi)分別為西瓜育苗基質(zhì)和本發(fā)明實施例1-5的微生物制劑，基質(zhì)與微生物制劑的質(zhì)量配比為100:1；培養(yǎng)15天后，檢測西瓜苗株感染根結(jié)線蟲的情況，具體結(jié)果見表2；
表2西瓜苗株感染根結(jié)線蟲的情況
可見，感染根結(jié)線蟲的西瓜苗株在施用本發(fā)明微生物制劑15天后，病株治愈率可達88-98%。
除非特殊說明和本領(lǐng)域常用單位，本發(fā)明所述比例，均為質(zhì)量比例，所述百分比，均為質(zhì)量百分比。
最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。