本發(fā)明涉及植物培育領(lǐng)域，具體而言，涉及一種無病毒栝樓的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：栝樓，葫蘆科栝樓屬多年生草本植物，別名瓜蔞、吊瓜、野葫蘆等?！吨腥A醫(yī)藥》記載，其果實(shí)、根是常用的名貴中藥，栝樓有解熱止渴、利尿、鎮(zhèn)咳祛痰等作用。種子含脂花肪油；果實(shí)含三萜皂苷、有機(jī)酸、樹脂、糖類、色素；根含蛋白質(zhì)、皂苷、酸類。栝樓是治療肺熱、腫痛的特效藥，近些年發(fā)現(xiàn)其還有調(diào)節(jié)免疫、抗心肌缺血、抗癌抗衰老等醫(yī)療和保健作用。目前，栝樓的繁殖主要為無性繁殖方式，即采用塊根小段無性繁殖；但栝樓在無性繁殖過程中，容易感染病毒，使優(yōu)良品種退化。因此，為培育無病毒的栝樓優(yōu)良種系，特提出本專利技術(shù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種無病毒栝樓的培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法易于控制實(shí)施，可在較短的時(shí)間內(nèi)繁殖得到大量的無病毒的優(yōu)良種系，提高栝樓種苗的品質(zhì)。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：一種無病毒栝樓的培養(yǎng)方法，其包括：取栝樓苗的莖尖分生組織，將帶有1～2個(gè)葉原基的莖尖接種到第一培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出含20～30個(gè)小芽的芽叢；將芽叢轉(zhuǎn)入第二培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至長(zhǎng)出1～2cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株并轉(zhuǎn)入第三培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到組培苗。一種栝樓的脫毒培養(yǎng)方法，其包括：取栝樓苗的莖尖分生組織，將帶有1～2個(gè)葉原基的莖尖接種到第一培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出含20～30個(gè)小芽的芽叢；其中，第一培養(yǎng)基是由ms培養(yǎng)基與0.45～0.55mg/l的6-芐氨基嘌呤、以及0.04～0.06mg/l的萘乙酸混合后形成的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本公開內(nèi)容提供的這種無病毒栝樓的培養(yǎng)方法，采用帶有1～2個(gè)葉原基的莖尖進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，使其生長(zhǎng)、分化形成無病毒的栝樓苗。該方法是基于病毒在植物體內(nèi)分布不均勻的理論，即植物的莖尖分生組織一般不帶病毒的，所以通常采用0.1毫米左右的莖尖分生組織，帶1-2個(gè)葉原基，進(jìn)行培養(yǎng)，即可得到無病毒種苗，故而無需進(jìn)行病毒鑒定工作即可進(jìn)行擴(kuò)大繁殖。該培養(yǎng)方法易于控制實(shí)施，操作相對(duì)較簡(jiǎn)單，成苗時(shí)間短，可在較短的時(shí)間內(nèi)繁殖得到大量的無病毒的優(yōu)良種系，提高栝樓種苗的品質(zhì)。通過這種培養(yǎng)方法培育的無病毒栝樓，具有生長(zhǎng)健壯、不帶病毒、品質(zhì)優(yōu)良的特性，從而大幅提高栝樓藥材的質(zhì)量和藥效。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。本實(shí)施方式提供一種無病毒栝樓的培養(yǎng)方法，其包括下述步驟：步驟s1初代培養(yǎng)：取栝樓苗的莖尖分生組織，將帶有1～2個(gè)葉原基的莖尖接種到第一培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出含20～30個(gè)小芽的芽叢。在本實(shí)施方式中，栝樓苗既可以為無菌苗，也可以為大田兩年生的正常苗，都可以滿足初代培養(yǎng)的植株取材需求。較為具體的，將栝樓苗在無菌條件和解剖顯微鏡下剝?nèi)∏o尖分生組織，以帶有1～2個(gè)葉原基的莖尖為度，莖尖分離后，迅速接入第一培養(yǎng)基中。值得強(qiáng)調(diào)的是，由于本實(shí)施方式提供的培養(yǎng)方法，選用的植物組織為莖尖分生組織，該分生組織一般不帶病毒，所以采用0.1毫米左右的帶1～2個(gè)葉原基的莖尖分生組織，進(jìn)行培養(yǎng)，即可得到無病毒苗，故而無需進(jìn)行病毒鑒定工作即可進(jìn)行擴(kuò)大繁殖。可選擇的，培養(yǎng)莖尖的條件為：環(huán)境溫度23～28℃、日照時(shí)間13～14h、光照強(qiáng)度1200～1300lx、相對(duì)濕度75～85％。進(jìn)一步優(yōu)選的，培養(yǎng)莖尖的條件為：環(huán)境溫度24～27℃、日照時(shí)間13.4～13.7h、光照強(qiáng)度1230～1280lx、相對(duì)濕度78～82％；更為具體的培養(yǎng)條件為：環(huán)境溫度25℃、日照時(shí)間13.5h、光照強(qiáng)度1250lx、相對(duì)濕度80％。在這些條件下，進(jìn)行莖尖分生組織的培養(yǎng)，莖尖所處的環(huán)境適宜，生長(zhǎng)和分化速度快，能夠在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)長(zhǎng)出小芽，形成芽叢，發(fā)芽率高、培養(yǎng)周期短。進(jìn)一步的，第一培養(yǎng)基是由ms培養(yǎng)基與0.45～0.55mg/l的6-芐氨基嘌呤、以及0.04～0.06mg/l的萘乙酸混合后形成的；或者第一培養(yǎng)基是由ms培養(yǎng)基與0.5mg/l的6-芐氨基嘌呤、以及0.05mg/l的萘乙酸混合后形成的。第一培養(yǎng)基采用ms培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中，ms培養(yǎng)基具有無機(jī)鹽和離子濃度較高，是較穩(wěn)定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，能滿足植物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和生理需要，因而適用范圍比較廣，多數(shù)植物組織培養(yǎng)快速繁殖用它作為培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。ms培養(yǎng)基可以采用現(xiàn)有技術(shù)中的配方進(jìn)行配置。當(dāng)然，也可以用其他配比的ms培養(yǎng)基。在本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，發(fā)明人經(jīng)過多次實(shí)踐探索之后，優(yōu)選得到的ms培養(yǎng)基的重量百分比組分為：30-35％的硝酸銨、40-42％的硝酸鉀、7-8％的硫酸鎂、8-10％的二水氯化鈣、3.5-4％的磷酸二氫鉀、1.2-1.5％的鐵鹽、0.05-0.1％的微量元素，余量為有機(jī)物。其中，鐵鹽為乙二胺四乙酸二鈉與硫酸亞鐵的混合物，二者的質(zhì)量比為10～11：9。微量元素由碘化鉀、硼酸、一水硫酸錳、硫酸鋅、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷的一種或多種組成，有機(jī)物由肌醇、煙酸、vb6、vb1、甘氨酸的一種或多種組成。采用這種ms培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其所含的離子濃度更加適合瓜蔞子莖尖的生長(zhǎng)、分化。6-芐氨基嘌呤，是一種人工合成的細(xì)胞分裂素，能夠誘導(dǎo)芽的分化。萘乙酸，是一種光譜型的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，能促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，誘導(dǎo)形成不定根。發(fā)明人通過調(diào)節(jié)這兩種激素的含量，得到一種能夠促進(jìn)莖尖誘導(dǎo)和分化的培養(yǎng)基，無需分步培養(yǎng)，且生長(zhǎng)快，分化率高。步驟s2繼代培養(yǎng)：將芽叢轉(zhuǎn)入第二培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至長(zhǎng)出1～2cm的叢生苗?？蛇x擇的，第二培養(yǎng)基是由ms培養(yǎng)基與0.09～0.11mg/l的6-芐氨基嘌呤、以及0.04～0.06mg/l的萘乙酸混合后形成的。較為優(yōu)選的，第二培養(yǎng)基是由ms培養(yǎng)基與0.10mg/l的6-芐氨基嘌呤、以及0.05mg/l的萘乙酸混合后形成的。該培養(yǎng)基適合芽叢的誘導(dǎo)分化，發(fā)育成叢生苗。可選擇的，該培養(yǎng)方法還包括：將叢生苗分成單株后再轉(zhuǎn)入另一個(gè)第二培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到大量的叢生苗。此為擴(kuò)大繁殖步驟，由于一個(gè)芽尖分化得到的芽叢數(shù)量有限，為了避免反復(fù)取材進(jìn)行初代培養(yǎng)，在本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，將繼代培養(yǎng)后得到的1～2cm的叢生苗分成單株，再重新接種至新的第二培養(yǎng)基中，進(jìn)行分化培養(yǎng)，由此可得到大量的叢生苗，大幅提高培養(yǎng)效率，縮短培養(yǎng)時(shí)間以及降低培養(yǎng)成本。步驟s3生根培養(yǎng)：將叢生苗分成單株并轉(zhuǎn)入第三培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到組培苗。可選擇的，第三培養(yǎng)基是由ms培養(yǎng)基與0.18～0.22mg/l的吲哚丁酸混合后形成的。較為優(yōu)選的，第三培養(yǎng)基是由ms培養(yǎng)基與0.20mg/l的吲哚丁酸混合后形成的。吲哚丁酸，使一種植物生長(zhǎng)激素，能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，尤其是促進(jìn)植物根系的生長(zhǎng)發(fā)育。該培養(yǎng)基適合叢生苗的誘導(dǎo)分化，能夠促進(jìn)叢生苗根系的生長(zhǎng)。進(jìn)一步的，在本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，還包括將組培苗進(jìn)行馴化培養(yǎng)。通過馴化培養(yǎng)，篩選得到長(zhǎng)勢(shì)健壯、不帶病毒、品系優(yōu)良的栝樓植株?？蛇x擇的，馴化培養(yǎng)包括：將組培苗根部的培養(yǎng)基清洗后晾置0.5～1.5h，再將組培苗插入基質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)；其中基質(zhì)為經(jīng)消毒處理后的腐殖土、蛭石和河砂的混合料。進(jìn)一步的，為了提高根系的成活率，將組培苗根部的培養(yǎng)基清洗后，于溫度為18～22℃、濕度為78～82％的環(huán)境下晾置0.5～1.5h，優(yōu)選的，將組培苗根部的培養(yǎng)基清洗后，于溫度為20℃、濕度為80％的環(huán)境下晾置1h，進(jìn)行移栽。更為具體的，將組培苗插入基質(zhì)中，壓實(shí)組培苗基本周圍的基質(zhì)，澆透水，以利幼苗基部和基質(zhì)緊密接合，直至根系生出，逐漸降低濕度和土壤含水量。通過上述培養(yǎng)方法培育得到的栝樓，具有生長(zhǎng)健壯、不帶病毒、品質(zhì)優(yōu)良的特性，從而能夠大幅提高栝樓藥材的質(zhì)量和藥效。以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述：實(shí)施例1本實(shí)施例提供一種無病毒栝樓的培育方法，其包括：a.按常規(guī)方法配制ms培養(yǎng)基。b.取栝樓的無菌苗在無菌條件和解剖顯微鏡下，解剖剝?nèi)∏o尖分生組織(20個(gè))，以帶有1個(gè)葉原基的莖尖為度,莖尖分離后，迅速接入第一培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出30個(gè)小芽的芽叢。其中，第一培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.45mg/l)+萘乙酸(0.06mg/l)。c.將芽叢轉(zhuǎn)入第二培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至長(zhǎng)出1cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株，并轉(zhuǎn)入第三培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到無病無的栝樓組培苗。其中，第二培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.09mg/l)+萘乙酸(0.06mg/l)。第三培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+吲哚丁酸(0.22mg/l)。實(shí)施例2本實(shí)施例提供一種無病毒栝樓的培育方法，其包括：a.按常規(guī)方法配制ms培養(yǎng)基。b.取栝樓的無菌苗在無菌條件和解剖顯微鏡下，解剖剝?nèi)∏o尖分生組織(20個(gè))，以帶有1個(gè)葉原基的莖尖為度,莖尖分離后，迅速接入第一培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出25個(gè)小芽的芽叢。培養(yǎng)條件為：白天溫度為28℃，夜間溫度為25℃、日照時(shí)間14h、光照強(qiáng)度1200lx、相對(duì)濕度85％。其中，第一培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.5mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。c.將芽叢轉(zhuǎn)入第二培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至長(zhǎng)出1.5cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株，并轉(zhuǎn)入第三培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到無病無的栝樓組培苗。其中，第二培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.10mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。第三培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+吲哚丁酸(0.20mg/l)。實(shí)施例3本實(shí)施例提供一種無病毒栝樓的培育方法，其包括：a.按常規(guī)方法配制ms培養(yǎng)基。b.取栝樓的無菌苗在無菌條件和解剖顯微鏡下，解剖剝?nèi)∏o尖分生組織(20個(gè))，以帶有2個(gè)葉原基的莖尖為度,莖尖分離后，迅速接入第一培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出20個(gè)小芽的芽叢。培養(yǎng)條件為：白天溫度為26℃，夜間溫度為23℃、日照時(shí)間13h、光照強(qiáng)度1300lx、相對(duì)濕度75％。其中，第一培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.55mg/l)+萘乙酸(0.04mg/l)。c.將芽叢轉(zhuǎn)入第二培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至長(zhǎng)出2cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株，并轉(zhuǎn)入第三培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到無病無的栝樓組培苗。其中，第二培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.11mg/l)+萘乙酸(0.04mg/l)。第三培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+吲哚丁酸(0.18mg/l)。實(shí)施例4本實(shí)施例提供一種無病毒栝樓的培育方法，其包括：a.按常規(guī)方法配制ms培養(yǎng)基。b.取栝樓的無菌苗在無菌條件和解剖顯微鏡下，解剖剝?nèi)∏o尖分生組織(20個(gè))，以帶有1個(gè)葉原基的莖尖為度,莖尖分離后，迅速接入第一培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出25個(gè)小芽的芽叢。培養(yǎng)條件為：白天溫度為27℃，夜間溫度為24℃、日照時(shí)間13.5h、光照強(qiáng)度1250lx、相對(duì)濕度80％。其中，第一培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.5mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。c.將芽叢轉(zhuǎn)入第二培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至長(zhǎng)出1.5cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株，再轉(zhuǎn)入另一個(gè)所述第二培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到大量的叢生苗。其中，第二培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.10mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。d.將叢生苗分成單株，并轉(zhuǎn)入第三培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到無病無的栝樓組培苗。其中，第三培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+吲哚丁酸(0.20mg/l)。實(shí)施例5本實(shí)施例提供一種無病毒栝樓的培育方法，其包括：a.按常規(guī)方法配制ms培養(yǎng)基。b.取栝樓的無菌苗在無菌條件和解剖顯微鏡下，解剖剝?nèi)∏o尖分生組織(20個(gè))，以帶有1個(gè)葉原基的莖尖為度,莖尖分離后，迅速接入第一培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出25個(gè)小芽的芽叢。培養(yǎng)條件為：白天溫度為27℃，夜間溫度為24℃、日照時(shí)間13.5h、光照強(qiáng)度1250lx、相對(duì)濕度80％。其中，第一培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.5mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。c.將芽叢轉(zhuǎn)入第二培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至長(zhǎng)出1.5cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株，再轉(zhuǎn)入另一個(gè)所述第二培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到大量的叢生苗。其中，第二培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.10mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。d.將叢生苗分成單株，并轉(zhuǎn)入第三培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到無病無的栝樓組培苗。其中，第三培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+吲哚丁酸(0.20mg/l)。e.將組培苗根部的培養(yǎng)基清洗后晾置1h，再將組培苗插入基質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)；其中基質(zhì)為經(jīng)消毒處理后的腐殖土、蛭石和河砂的混合料。對(duì)比例1本對(duì)比例提供一種栝樓種苗，其培育方法，其包括：a.按常規(guī)方法配制ms培養(yǎng)基。b.取栝樓的無菌苗在無菌條件和解剖顯微鏡下，解剖剝?nèi)∏o尖分生組織(20個(gè))，以帶有1個(gè)葉原基的莖尖為度,莖尖分離后，迅速接入第一培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出20個(gè)小芽的芽叢。培養(yǎng)條件為：白天溫度為30℃，夜間溫度為25℃、日照時(shí)間12h、光照強(qiáng)度1500lx、相對(duì)濕度75％。其中，第一培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.1mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。c.將芽叢轉(zhuǎn)入第二培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至長(zhǎng)出1cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株，并轉(zhuǎn)入第三培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到無病無的栝樓組培苗。其中，第二培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(0.12mg/l)+萘乙酸(0.07mg/l)。第三培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基+吲哚丁酸(0.27mg/l)。觀察實(shí)施例1～5以及對(duì)比例1在在培養(yǎng)過程中的分化情況，并記算出芽數(shù)、分化率、出苗總數(shù)和出苗率，結(jié)果如表1所示：表1.實(shí)施例1～5以及對(duì)比例1的培養(yǎng)結(jié)果分化出芽的芽尖數(shù)(個(gè))分化率(％)出苗總數(shù)(株)出苗率(％)實(shí)施例11470％1890％實(shí)施例21575％20100％實(shí)施例31680％24120％實(shí)施例41680％67335％實(shí)施例51785％70350％對(duì)比例1735％1575％由表1可知，本發(fā)明實(shí)施例1～5所提供的培養(yǎng)方法，用20個(gè)植物分生組織進(jìn)行培養(yǎng)，分化出芽的芽尖數(shù)在14個(gè)以上，分化率(分化出芽的芽尖數(shù)/接入的芽尖數(shù)×100％)在70％以上，遠(yuǎn)大于對(duì)比例1提供的培養(yǎng)方法(分化出芽的芽尖數(shù)為7個(gè)，分化率為35％)，由此可見，本發(fā)明實(shí)施例1～5所提供的培養(yǎng)方法，在芽尖分化培養(yǎng)階段，分化率高、且分化出芽生長(zhǎng)快；進(jìn)一步培養(yǎng)后的，實(shí)施例1～5中，由于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)好，培養(yǎng)條件適宜，芽生長(zhǎng)快，植物健壯，因此出苗率(出苗數(shù)/接入的芽尖數(shù)×100％)高達(dá)90％以上。值得注意的是，實(shí)施例4～5的出苗率高達(dá)330％以上，這主要是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)得到叢生苗之后，還將其分成單株后，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到大量的叢生苗，從而大幅提高叢生苗的數(shù)量。盡管已用具體實(shí)施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。當(dāng)前第1頁12