本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)種植技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種柳樹幼胚成苗組織培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

柳樹自然雜交的種子很細(xì)小，千粒重也就在0.4克左右，而在室內(nèi)雜交的柳樹種子千粒重就更低。利用室內(nèi)雜交的柳樹種子在后期播種成苗過程中，由于柳樹種子本身的營養(yǎng)成份不足，在生長過程中抵御外界不利環(huán)境因素的能力差，進(jìn)而導(dǎo)致成苗率低，成苗的比率約為30％。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的缺陷，現(xiàn)提供一種柳樹幼胚成苗組織培養(yǎng)方法，以解決在利用室內(nèi)雜交的柳樹種子播種，成苗率低的問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，提供一種柳樹幼胚成苗組織培養(yǎng)方法，包括：

采集未成熟的柳樹種子；

將所述柳樹種子消毒處理并從所述柳樹種子中取得幼胚；

將所述幼胚經(jīng)由誘導(dǎo)培養(yǎng)形成胚性愈傷組織；

將所述胚性愈傷組織經(jīng)由芽分化培養(yǎng)形成叢生芽；

將所述叢生芽經(jīng)由生根培養(yǎng)形成柳樹苗。

進(jìn)一步的，所述采集未成熟的柳樹種子的步驟包括于柳樹蒴果的果皮開裂前且所述果皮呈黃色時(shí)，從所述柳樹蒴果中采集所述柳樹種子。

進(jìn)一步的，所述將所述幼胚經(jīng)由誘導(dǎo)培養(yǎng)形成胚性愈傷組織步驟包括將所述幼胚無菌接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，使所述幼胚形成所述胚性愈傷組織。

進(jìn)一步的，所述將所述胚性愈傷組織經(jīng)由芽分化培養(yǎng)形成叢生芽步驟包括將所述胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到芽分化培養(yǎng)基中，使所述胚性愈傷組織形成所述叢生芽。

進(jìn)一步的，所述將所述叢生芽經(jīng)由生根培養(yǎng)形成柳樹苗步驟包括將所述叢生芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，使所述叢生芽生根形成所述柳樹苗。

進(jìn)一步的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基、所述芽分化培養(yǎng)基及所述生根培養(yǎng)基均以改良型wpm培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述改良型wpm培養(yǎng)基包括濃度為270mg/l～290mg/l的nh4no3、濃度為760mg/l～770mg/l的k2so4、濃度為90mg/l～110mg/l的kh2po4、濃度為145mg/l～155mg/l的mgso4·7h2o以及濃度為390mg/l～400mg/l的ca(no3)2·4h2o。

進(jìn)一步的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為每升所述改良型wpm培養(yǎng)基添加0.8mg～1.2mg的二氯苯氧乙酸、2mg～2.4mg的6-芐氨基腺嘌呤、195mg～205mg鹽酸硫素。

進(jìn)一步的，所述芽分化培養(yǎng)基為每升所述改良型wpm培養(yǎng)基添加0.5mg～0.7mg的6-芐氨基腺嘌呤、0.15mg～0.25mg的萘乙酸、290mg～310mg的赤霉素。

進(jìn)一步的，所述生根培養(yǎng)基為每升所述改良型wpm培養(yǎng)基添加0.75mg～0.85mg的萘乙酸、950mg～1050mg的活性炭。

本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明柳樹幼胚成苗組織培養(yǎng)方法尤為適用于室內(nèi)雜交柳樹的種子幼胚成苗，在適宜的時(shí)機(jī)采集未成熟的室內(nèi)雜交柳樹種子，進(jìn)而獲得柳樹幼胚并通過組織培養(yǎng)成柳樹樹苗，能有效提高室內(nèi)雜交柳樹的種子成苗率。

具體實(shí)施方式

以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

本發(fā)明柳樹幼胚成苗組織培養(yǎng)方法適用于柳樹種子。柳樹是植物界被子植物門雙子葉植物綱原始花被亞綱楊柳目楊柳科柳屬，主要產(chǎn)自北半球溫帶地區(qū)，寒帶次之，熱帶和南半球極少，原產(chǎn)地為中國大陸南方。柳樹是一類植物的總稱，柳樹的品種包括旱柳、腺柳、垂柳等品種。柳屬多為灌木，稀喬木，無頂芽，合軸分枝，雄蕊數(shù)目較少，蟲媒花等特征表明，較楊屬與鉆天柳屬進(jìn)化。

柳屬的形態(tài)特征如下：?jiǎn)棠净蛸橘霠?、墊狀、直立灌木。枝圓柱形，髓心近圓形。無頂芽，側(cè)芽通常緊貼枝上，芽鱗單一。葉互生，稀對(duì)生，通常狹而長，多為披針形，羽狀脈，有鋸齒或全緣；葉柄短；具托葉，多有鋸齒，常早落，稀宿存。葇荑花序直立或斜展，先葉開放，或與葉同時(shí)開放，稀后葉開放；苞片全緣，有毛或無毛，宿存，稀早落；雄蕊2-多數(shù)，花絲離生或部分或全部合；腺體1-2(位于花序軸與花絲之間者為腹腺，近苞片者為背腺)；雌蕊由2心皮組成，子房無柄或有柄，花柱長短不一，或缺，單1或分裂，柱頭1-2，分裂或不裂。柳樹的果實(shí)為蒴果，成熟后2瓣裂，內(nèi)藏種子多枚，種子上具有一叢綿毛，柳樹種子小。在成熟的過程中，蒴果由黃色向暗褐色慢慢轉(zhuǎn)變并干燥開裂。

柳樹自然雜交的種子很細(xì)小，千粒重約為0.4克，而在室內(nèi)雜交的柳樹種子千粒重更小。直接利用室內(nèi)雜交的柳樹種子播種成苗，后期的成苗率極低。本發(fā)明柳樹幼胚成苗組織培養(yǎng)方法尤為適用于室內(nèi)雜交柳樹的種子幼胚成苗，能有效提高室內(nèi)雜交柳樹的種子成苗率，柳樹試管苗成活率達(dá)70％，比采用播種成苗的成活率提高30％左右。

本發(fā)明提供了一種柳樹幼胚成苗組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

s1：采集未成熟的柳樹種子。

在室內(nèi)柳樹雜交授粉后的25天～26天時(shí)，采集呈黃色快成熟且還末開裂的柳樹蒴果，并從上述柳樹蒴果中取出柳樹種子。

s2：將未成熟的柳樹種子消毒處理并于消毒后的柳樹種子中取得幼胚。

具體的，包括以下步驟：

將采集的柳樹種子，先用無菌水沖洗10分種后，移至超凈工作臺(tái)上。

繼續(xù)用75％的酒精對(duì)超凈工作臺(tái)內(nèi)的柳樹種子進(jìn)行表面消毒30秒。

將已用75％的酒精消毒的柳樹種子置于0.1％的升汞溶液中滅菌10分鐘。

從升汞溶液中取出柳樹種子并用無菌水沖洗3次～4次，再用濾紙吸干柳樹種子的表面的水分。

將表面的水分已吸干的柳樹種子的種皮切開，挑出柳樹種子的幼胚。

s3：將幼胚無菌接種到以改良型wpm培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，使幼胚形成胚性愈傷組織。

具體的，包括以下步驟：

誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制備。

準(zhǔn)備改良型的wpm培養(yǎng)基。

本發(fā)明針對(duì)傳統(tǒng)wpm培養(yǎng)基配方進(jìn)行了改進(jìn)，形成改良型wpm培養(yǎng)基。

傳統(tǒng)的wpm培養(yǎng)基配方如下：

本發(fā)明的改良型wpm培養(yǎng)基的配方如下：

作為一種較佳的實(shí)施方式，本發(fā)明的改良型wpm培養(yǎng)基的配方如下：

誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以改良型wpm培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

具體的，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為每升改良型wpm培養(yǎng)基中添加0.8mg～1.2mg的二氯苯氧乙酸(2,4-d)、2mg～2.4mg的6-芐氨基腺嘌呤(6-ba)、195mg～205mg鹽酸硫素。

作為一種較佳的實(shí)施方式，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為每升所述改良型wpm培養(yǎng)基添加1.0mg的二氯苯氧乙酸(2,4-d)、2.2mg的6-芐氨基腺嘌呤(6-ba)、200mg鹽酸硫素。

將幼胚無菌接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，使幼胚形成胚性愈傷組織。

將接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的幼胚先暗培養(yǎng)2周后，再光照培養(yǎng)約26天形成胚性愈傷組織后。

s4：將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到以改良型wpm培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基的芽分化培養(yǎng)基中，使胚性愈傷組織形成叢生芽。

具體的，包括以下步驟：

芽分化培養(yǎng)基的制備。

芽分化培養(yǎng)基是以上述改良型wpm培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。芽分化培養(yǎng)基為每升改良型的wpm培養(yǎng)基在添加0.5mg～0.7mg的6-芐氨基腺嘌呤、0.15mg～0.25mg的萘乙酸(naa)、290mg～310mg的赤霉素(ga3)。

作為一種較佳的實(shí)施方式，芽分化培養(yǎng)基為每升改良型的wpm培養(yǎng)基添加0.6mg的6-芐氨基腺嘌呤、0.2mg的萘乙酸(naa)、300mgd赤霉素(ga3)。

再將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到芽分化培養(yǎng)基中約35天，使胚性愈傷組織形成高達(dá)4cm～5cm叢生芽。

s5：將叢生芽轉(zhuǎn)接到以改良型wpm培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基的生根培養(yǎng)基中，使叢生芽生根形成柳樹苗。

具體的，包括以下步驟：

s51：制備生根培養(yǎng)基。

生根培養(yǎng)基以上述改良型wpm培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)基為每升所述改良型的wpm培養(yǎng)基添加0.75mg～0.85mg的萘乙酸、950mg～1050mg的活性炭。

作為一種較佳的實(shí)施方式，生根培養(yǎng)基為每升改良型的wpm培養(yǎng)基中添加0.8mg的萘乙酸、1000mg的活性炭。

s52：將高達(dá)4cm～5cm的叢生芽切接成單芽。

s53：將單芽轉(zhuǎn)接在生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)32天后即可生根成柳樹試管苗。柳樹試管苗成苗培養(yǎng)期間，外部環(huán)境以普通日光燈為光源，光照強(qiáng)度為1500-2000lx，每天光照時(shí)間為20小時(shí)，溫度25±2℃，相對(duì)濕度在65％～70％。

s54：煉苗、栽培。

將柳樹試管苗在常溫下開瓶進(jìn)行煉苗2天。

取出并洗凈柳樹試管苗，將洗凈的柳樹試管苗移栽到基質(zhì)(質(zhì)量比為石炭土：蛭石＝1：2)保持溫度24℃左右，相對(duì)濕度75％左右，培養(yǎng)兩個(gè)星期可適應(yīng)存活，柳樹試管苗成活率達(dá)70％，比采用播種成苗的成活率提高30％左右。

柳樹自然雜交的種子很細(xì)小，千粒重約為0.4克，而在室內(nèi)雜交的柳樹種子千粒重更小。直接利用室內(nèi)雜交的柳樹種子播種成苗，后期的成苗率極低。本發(fā)明柳樹幼胚成苗組織培養(yǎng)方法尤為適用于室內(nèi)雜交柳樹的種子幼胚成苗，在適宜的時(shí)機(jī)采集未成熟的室內(nèi)雜交柳樹種子，進(jìn)而獲得柳樹幼胚并通過組織培養(yǎng)成柳樹樹苗，能有效提高室內(nèi)雜交柳樹的種子成苗率。在采用以改良型的wpm培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基的誘導(dǎo)培養(yǎng)基、芽分化培養(yǎng)基以及生根培養(yǎng)基，能使得柳樹幼胚組培成苗率達(dá)到90％以上。

需要說明的是，本說明書所示的結(jié)構(gòu)、比例、大小等，均僅用以配合說明書所揭示的內(nèi)容，以供熟悉此技術(shù)的人士了解與閱讀，并非用以限定本發(fā)明可實(shí)施的限定條件，故不具技術(shù)上的實(shí)質(zhì)意義，任何結(jié)構(gòu)的修飾、比例關(guān)系的改變或大小的調(diào)整，在不影響本發(fā)明所能產(chǎn)生的功效及所能達(dá)成的目的下，均應(yīng)仍落在本發(fā)明所揭示的技術(shù)內(nèi)容得能涵蓋的范圍內(nèi)。同時(shí)，本說明書中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中間”及“一”等的用語，亦僅為便于敘述的明了，而非用以限定本發(fā)明可實(shí)施的范圍，其相對(duì)關(guān)系的改變或調(diào)整，在無實(shí)質(zhì)變更技術(shù)內(nèi)容下，當(dāng)亦視為本發(fā)明可實(shí)施的范疇。

以上結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員可根據(jù)上述說明對(duì)本發(fā)明做出種種變化例。因而，實(shí)施例中的某些細(xì)節(jié)不應(yīng)構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定，本發(fā)明將以所附權(quán)利要求書界定的范圍作為保護(hù)范圍。