本發(fā)明涉及植物無性快繁
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種太陽光條件下培育金花茶種胚組培苗的方法。
背景技術(shù)：
：金花茶（camellianittidissimachi），屬山茶科山茶屬，是山茶花家族中唯一具有金黃色花瓣的種類，是我國特有的傳統(tǒng)名花。也是國家8種一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物之一，在國內(nèi)外都享有盛名。國內(nèi)將金花茶譽(yù)為“茶族皇后”、“植物界的大熊貓”，國外則稱之為“幻想中的黃色山茶”、“神奇的東方魔茶”。金花茶不僅觀賞價(jià)值高，還是名貴藥材，其藥用價(jià)值也得到社會(huì)的廣泛認(rèn)可。金花茶含有d然有機(jī)鍺、鋅、硒、礬等多種對(duì)人體有重要保健作用的微量元素，以及茶多酚和人體所必需的氨基酸、維生素等，在降低血糖、血脂，防癌、抗癌方面有特殊功效。目前，市場上的金花茶產(chǎn)品倍受群眾青睞，而金花茶主產(chǎn)區(qū)廣西只能滿足其銷售量的1/10。由此可見金花茶市場前景十分廣闊。隨著金花茶藥用價(jià)值被社會(huì)廣泛認(rèn)可，產(chǎn)品暢銷，價(jià)格昂貴，資源緊俏，金花茶種植產(chǎn)業(yè)猶如雨后春筍快速地發(fā)展。為了盡快將金花茶資源應(yīng)用于社會(huì)，專業(yè)學(xué)者們開展了金花茶組織培養(yǎng)技術(shù)的研究，相關(guān)論文的報(bào)道有：顏慕勤等從1980年起陸續(xù)對(duì)七種具有重瓣，大花，芳香等特性的金花茶種進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，在1981年獲完整植株并已移栽成活；1987年廖漢刃等已開展金花茶嫩莖的組織培養(yǎng)，生根率為75%，且移栽成活，將無根苗剪下嫁接到普通油茶或越南油茶的芽苗砧木上，成活率為78%；黃曉娜等就金花茶瓶內(nèi)生根困難進(jìn)行了組培苗試管外生根研究，生根效果可達(dá)到85%。國家授權(quán)的相關(guān)專利有：①一種金花茶組培快繁方法（zl20140755440.8），以7至8月份金花茶葉片為外植體，誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生愈傷組織，將愈傷組織接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)，置于溫度25～28℃，光暗培養(yǎng)條件培養(yǎng)35～40d，愈傷組織分化出芽；將芽接種于生根培養(yǎng)基內(nèi)，置于溫度25～28℃，光暗培養(yǎng)條件培養(yǎng)20～30d，培養(yǎng)出組培幼苗；芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方為：ms+6～8g/l瓊脂+25～29g/l蔗糖+0.3～0.8mg/l6-ba+0.8～1.5mg/lnaa，生根培養(yǎng)基ms+6～8g/l瓊脂+25～29g/l蔗糖+0.8～2.5mg/liaa+0.5～1.5mg/lnaa+0.8～1.5mg/l活性炭（wc）+0.8～1.5mg/l硫酸亞鐵。②一種金花茶組培增殖方法（zl201410581398.2）以金花茶成熟種胚為外植體，5%～10%nacl2溶液消毒滅菌20～30min接種于初代配培養(yǎng)基中獲取無菌芽，無菌芽在增殖培養(yǎng)基和壯芽培養(yǎng)基中重復(fù)培養(yǎng)，培養(yǎng)周期5～6周；剪切壯芽并將壯芽基部浸于500～1000mg/liba中10～20min再轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，生根率95%～98%，苗木移栽成活率90%以上；初代培養(yǎng)基為ms+6g/l瓊脂+30g/l蔗糖+0.2～0.5mg/l6-ba+0.2～0.5mg/lnaa，增殖培養(yǎng)基為ms+6g/l瓊脂+40g/l蔗糖+1.5～2.0mg/l6-ba+1.5～2.0mg/lkt；壯芽培養(yǎng)基為ms+6g/l瓊脂+40g%蔗糖+0.5～1.0mg/liaa，采用白熾燈進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照16h，暗培養(yǎng)8h，光照強(qiáng)度2000～3000lx，溫度25±3℃～28℃。③金花茶組織培養(yǎng)基（zl85102805）改良er；nh4no31200mg/l，kno31800mg/l，caci2200mg/l，kh2po4400mg/l，h3bo31mg/l，mnso4·h2o0.5mg/l，znso4·7h2o1mg/l，nam0o4·h2o1mg/l，cuso4·5h2o0.1mg/l，feso4+na2edta【27.8+37.3(絡(luò)合物5ml)】，煙酸10mg/l，甘氨酸2.0mg/l，肌醇5mg/l，鹽酸吡哆醇1mg/l，鹽酸硫銨4mg/l，瓊脂6g/l，蔗糖30g/l，6-ba1～5mg/l，iaa1～3mg/l。以上報(bào)道主要采用白熾燈提供光照條件，然而白熾燈光譜僅紅光、綠光和藍(lán)光光譜比較強(qiáng)，對(duì)植物生長的作用遠(yuǎn)弱于太陽光。太陽光光譜豐富，有7種可見光（赤橙紅綠青藍(lán)紫）和2種不可見光（紫外線和紅外線）。太陽光中的藍(lán)紫光與青光對(duì)植物生長及幼芽的形成有很大的作用，抑制植物節(jié)間的伸長，促進(jìn)芽的分化。藍(lán)光也是支配細(xì)胞分化最重要的光譜，同時(shí)影響植物的向光性。藍(lán)紫光有利于蛋白質(zhì)和有機(jī)酸的合成，有助于花色素和維生素的合成。紅光和紅外線光有利于碳水化合物的合成，促進(jìn)種子的萌發(fā)和莖的伸長，促進(jìn)二氧化碳的分解和葉綠素的形成。因此，通過調(diào)節(jié)太陽光的光照強(qiáng)度，有助于提高金花茶組培苗光合作用和促進(jìn)組培苗的生長。然而目前未見有關(guān)于利用太陽光對(duì)金花茶組培苗進(jìn)行工廠化育苗的文獻(xiàn)和專利。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中使用白熾燈進(jìn)行金花茶組培苗培育的不足，提供一種太陽光條件下培育金花茶種胚組培苗的方法，使金花茶的組培苗培育不受地域和氣候的限制，既能保持金花茶優(yōu)良性狀的遺傳穩(wěn)定性，又節(jié)約能源、節(jié)約成本，利于產(chǎn)業(yè)化快速培育金花茶優(yōu)良組培苗。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種太陽光條件下金花茶種胚培育組培苗的方法，包括以下步驟：（1）外植體消毒和芽初代培養(yǎng)：6月～7月采集7～8成熟、果殼呈紅綠色的金花茶果實(shí)，自來水沖洗果實(shí)外表塵埃，剝?nèi)ネ夤?，置于超凈工作臺(tái)，用75%酒精溶液消毒30s，無菌水清洗3～4次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1‰的hgcl2溶液浸泡8min，無菌水清洗3～4次，剝?nèi)?nèi)果皮，接種于初代培養(yǎng)基中，置于300～800lx的太陽光照條件下進(jìn)行初代培養(yǎng)7～10d，之后移置于1000～2500lx的太陽光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)20～23d,至胚芽高2～5cm；（2）芽繼代增殖培養(yǎng)：將2～5cm高胚芽剪切，轉(zhuǎn)接到繼代增殖培養(yǎng)基中，置于1500～4000lx的太陽光照條件下進(jìn)行芽繼代增殖培養(yǎng)10～15d，再置于4000～8000lx的太陽光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)20~25d，增殖系數(shù)為8～13；（3）芽生根培養(yǎng)：將繼代增殖芽中高3～5cm，葉片翠綠，葉面光亮，帶革質(zhì)，有葉片3～5張的單芽剪切，直插于生根培養(yǎng)基中，置于2000～8000lx太陽光照條件下培養(yǎng)15～40d，當(dāng)根系長0.5～1cm時(shí)，移至接近自然環(huán)境的煉苗棚內(nèi)煉苗，生根率90~95%；（4）苗木移栽：瓶苗在煉苗棚內(nèi)煉苗20～30d，苗木根系由白色變?yōu)榛野咨珪r(shí)進(jìn)行移栽，苗木移栽時(shí)，先打開瓶蓋，取出生根苗，清洗干凈粘附于根系上的生根培養(yǎng)基，移栽于經(jīng)過基質(zhì)消毒的營養(yǎng)杯內(nèi)，置于溫度15～28℃，濕度70～85%，遮蔭度70～80%，陰涼的環(huán)境條件下培養(yǎng)，經(jīng)苗期施肥管護(hù)，苗木高≥30cm，地徑≥0.3cm時(shí)可以出圃或上大杯培養(yǎng)大苗。優(yōu)選的，所述芽繼代增殖培養(yǎng)中，將胚芽剪切，轉(zhuǎn)接到繼代增殖培養(yǎng)基中，置于2500～4000lx的太陽光照條件下進(jìn)行芽繼代增殖培養(yǎng)10～15d，置于4000～8000lx的太陽光照條件下繼續(xù)繼代增殖培養(yǎng)20~25d，增殖系數(shù)8～13。優(yōu)選的，所述芽生根培養(yǎng)中，將繼代增殖芽中高3～5cm，葉片翠綠，葉面光亮，帶革質(zhì)，有葉片3～5張的單芽剪切，直插于生根培養(yǎng)基中，置于4000～8000lx太陽光照條件下進(jìn)行芽生根培養(yǎng)15～40d，當(dāng)根系長0.5～1cm時(shí)，移至接近自然環(huán)境的煉苗棚內(nèi)煉苗，生根率90~95%。優(yōu)選的，所述初代培養(yǎng)基的配方為：ms+50mg/lna2so4+2mg/l6-芐氨基腺嘌呤+0.5mg/l萘乙酸+10mg/l維生素c+300mg/l水解酪蛋白+4.5g/l瓊脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8。優(yōu)選的，所述繼代增殖培養(yǎng)基的配方為：ms+50mg/lna2so4+3mg/l6-芐氨基腺嘌呤+1mg/l萘乙酸+15mg/l維生素c+15～20mg/l谷氨酰氨+300mg/l水解酪蛋白+4.5g/l瓊脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8。優(yōu)選的，所述生根培養(yǎng)基的配方為：2/3(ms+50mg/lna2so4)+3mg/l吲哚丁酸+5mg/l吲哚乙酸+0.3mg/l萘乙酸+4.5g/l瓊脂粉+30g/l蔗糖，或2/3（ms+50mg/lna2so4－1650mg/lnh4no3+100mg/lca(no3)2·4h2o）+3mg/l吲哚丁酸+5mg/l吲哚乙酸+0.3mg/l萘乙酸+4.5g/l瓊脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8。在ms培養(yǎng)基中增加適當(dāng)濃度的na+可以調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的滲透勢(shì)，促進(jìn)細(xì)胞分裂，提高葉片的光合作用，促進(jìn)苗木健壯生長，在生根培養(yǎng)中，將ms培養(yǎng)基去除nh4no3增加100mg/lca(no3)2·4h2o，可以解決培養(yǎng)基中n含量偏低，生根芽生長過程中缺n現(xiàn)象，避免葉片黃化，影響芽的生根率。優(yōu)選的，所述芽初代培養(yǎng)、芽繼代增殖培養(yǎng)和芽生根培養(yǎng)均在墻體80%為雙層玻璃窗的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)室的光照時(shí)間為11～14h/d，溫度為22~28℃。本發(fā)明具備以下的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：（1）本發(fā)明采用的光源來自太陽光，通過對(duì)光照強(qiáng)度和光照時(shí)間調(diào)節(jié)，充分發(fā)揮太陽光對(duì)金花茶組培苗生長的促進(jìn)作用，金花茶組培苗生根率高達(dá)90%～95%，比使用白熾燈作為光源的方法生根率提高20%以上，同一生根培養(yǎng)基，太陽光條件下芽長根點(diǎn)的時(shí)間為20～25d，白熾燈下芽長根點(diǎn)時(shí)間為30～35d，前者比后者芽長根點(diǎn)時(shí)間縮短5～10d。（2）本發(fā)明培育的金花茶組培苗增殖系數(shù)高達(dá)8～13，移栽成活率95%以上，達(dá)到了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)金花茶苗木的要求。（3）本發(fā)明的外植體來源于具有生長優(yōu)勢(shì)的植株，生長茂盛，花多（2500朵/a.株以上），產(chǎn)花大小年不明顯，采用“以種繁芽”的組培方法，培育的組培苗遺傳穩(wěn)定性好，能保持母樹優(yōu)良的性狀。（4）本培養(yǎng)基為ms培養(yǎng)基，在ms培養(yǎng)基中添加低濃度的na2so4，na+能夠調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的滲透勢(shì)，促進(jìn)細(xì)胞分裂，提高葉片的光合作用，促進(jìn)苗木健壯生長，在初代和增殖中培養(yǎng)基中添加適量濃度的水解酪蛋白，能促進(jìn)酶活性，對(duì)細(xì)胞和組織的增殖和分化有明顯促進(jìn)作用。（5）本發(fā)明工藝簡單，可操作性強(qiáng)，不使用白熾燈光源，降低了電力成本本發(fā)明所用基。附圖說明圖1：培養(yǎng)室；圖2：培養(yǎng)室太陽光光譜圖；圖3：白熾燈光譜圖；圖4：繼代增殖芽形態(tài)對(duì)比圖，圖左為實(shí)施例1培育的繼代增殖芽，圖右為對(duì)比例1培育的繼代增殖芽：圖5：生根苗根系形態(tài)對(duì)比圖，圖左為實(shí)施例1培育的生根苗，圖右為對(duì)比例1培育的生根苗；圖6：生根苗生產(chǎn)圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)例描述本發(fā)明一種太陽光條件下培育金花茶種胚組培苗的方法，這些描述并不是對(duì)本
發(fā)明內(nèi)容的限定。實(shí)施例1一種以種子為外植體的太陽光培育金花茶組培苗的方法，一種太陽光條件下培育金花茶種胚組培苗的方法包括以下步驟：（1）外植體消毒和芽初代培養(yǎng)：6月采集7～8成熟、果殼呈紅綠色的金花茶果實(shí)，自來水沖洗果實(shí)外表塵埃，剝?nèi)ネ夤?，置于超凈工作臺(tái)，用75%酒精溶液消毒30s，無菌水清洗3次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1‰的hgcl2溶液浸泡8min，無菌水清洗3次，剝?nèi)?nèi)果皮，接種于初代培養(yǎng)基中，初代培養(yǎng)基的配方為ms+50mg/lna2so4+2mg/l6-芐氨基腺嘌呤+0.5mg/l萘乙酸+10mg/l維生素c+300mg/l水解酪蛋白+4.5g/l瓊脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于墻體80%為雙層玻璃窗的培養(yǎng)室內(nèi)（圖1），培養(yǎng)室內(nèi)光照時(shí)間11～14h/d,溫度22~28℃，300～800lx的太陽光照條件下進(jìn)行初代培養(yǎng)8d，之后移置于1000～2500lx的太陽光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)22d，種胚萌芽率≥98%，一般情況下，培養(yǎng)10～15d種胚萌芽，待萌芽高2～5cm時(shí)，將芽接種于增殖培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽；（2）芽繼代增殖培養(yǎng)：將胚芽剪切，轉(zhuǎn)接到繼代增殖培養(yǎng)基中，繼代增殖培養(yǎng)基的配方為：ms+50mg/lna2so4+3mg/l6-芐氨基腺嘌呤+1mg/l萘乙酸+15mg/l維生素c+20mg/l谷氨酰氨+300mg/l水解酪蛋白+4.5g/l瓊脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于2500～4000lx的太陽光照條件下進(jìn)行芽繼代增殖培養(yǎng)10d，再置于4000～8000lx的太陽光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)，光照時(shí)間11～14h/d，溫度22~28℃，：繼代增殖培養(yǎng)第35d，芽高3～5cm，翠綠，莖干半木質(zhì)化，葉片2/3展開，增殖系數(shù)13；繼代增殖培養(yǎng)第40d，芽高3～6cm，翠綠，莖干木質(zhì)化，葉片2/3展開，帶革質(zhì)，葉面光亮，增殖系數(shù)13；繼代增殖培養(yǎng)第50d，芽高3～6cm，翠綠，莖干木質(zhì)化較強(qiáng)，葉片2/3展開，較大，葉面光亮，革質(zhì)，增殖系數(shù)13；（3）芽生根培養(yǎng)：分別取培養(yǎng)35d、40d和50d的繼代增殖芽中芽高3～6cm，葉片翠綠，葉面光亮，帶革質(zhì)，有葉片3～5張的單芽剪切，直插式插于生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基的配方為2/3(ms+50mg/lna2so4)+3mg/l吲哚丁酸+5mg/l吲哚乙酸+0.3mg/l萘乙酸+4.5g/l瓊脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于4000～8000lx太陽光照條件下進(jìn)行芽生根培養(yǎng)，光照時(shí)間11～14h/d，溫度22~28℃，培養(yǎng)35d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第16d長出根點(diǎn)，第25d根系長0.5~1.0cm，平均生根率96.7%；培養(yǎng)40d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第15d長出根點(diǎn)，第24d根系長0.5~1.0cm，平均生根率98.3%；培養(yǎng)50d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第30d長出根點(diǎn)，第45d根系長0.5~1.0cm，平均生根率83.3%；（4）苗木移栽：將根系長0.5～1cm的瓶苗移至煉苗棚內(nèi)煉苗20d，苗木根系由白色變?yōu)榛野咨珪r(shí)進(jìn)行移栽，苗木移栽時(shí)，先打開瓶蓋，取出生根苗，清洗干凈粘附于根系上的生根培養(yǎng)基，移栽于經(jīng)過基質(zhì)消毒的營養(yǎng)杯內(nèi)，置于溫度15～28℃，濕度70～85%，遮蔭度70～80%，陰涼的環(huán)境條件下培養(yǎng)，經(jīng)苗期施肥管護(hù)，苗木高≥30cm，地徑≥0.3cm時(shí)可以出圃或上大杯培養(yǎng)大苗，平均移栽成活率99.4%。實(shí)施例2一種太陽光條件下培育金花茶種胚組培苗的方法，包括以下步驟：（1）外植體消毒和芽初代培養(yǎng)：6月采集7～8成熟、果殼呈紅綠色的金花茶果實(shí)，自來水沖洗果實(shí)外表塵埃，剝?nèi)ネ夤?，置于超凈工作臺(tái)，用75%酒精溶液消毒30s，無菌水清洗4次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1‰的hgcl2溶液浸泡8min，無菌水清洗4次，剝?nèi)?nèi)果皮，接種于初代培養(yǎng)基中，初代培養(yǎng)基的配方為ms+50mg/lna2so4+2mg/l6-芐氨基腺嘌呤+0.5mg/l萘乙酸+10mg/l維生素c+300mg/l水解酪蛋白+4.5g/l瓊脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于墻體80%為雙層玻璃窗的培養(yǎng)室內(nèi)（圖1），培養(yǎng)室內(nèi)光照時(shí)間11～14h/d，溫度22~28℃，300～800lx的太陽光照條件下進(jìn)行初代培養(yǎng)7d，之后移置于1000～2500lx的太陽光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)23d，種胚萌芽率≥98%，一般情況下，培養(yǎng)10～15d種胚萌芽，待萌芽高2～5cm時(shí)，將芽接種于增殖培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽；（2）芽繼代增殖培養(yǎng)：將胚芽剪切，轉(zhuǎn)接到繼代增殖培養(yǎng)基中，繼代增殖培養(yǎng)基的配方為：ms+50mg/lna2so4+3mg/l6-芐氨基腺嘌呤+1mg/l萘乙酸+15mg/l維生素c+16mg/l谷氨酰氨+300mg/l水解酪蛋白+4.5g/l瓊脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于1500～3000lx的太陽光照條件下進(jìn)行芽繼代增殖培養(yǎng)10d，再置于4000～6000lx的太陽光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)，光照時(shí)間11～14h/d，溫度22~28℃：繼代增殖培養(yǎng)第35d，芽高2～4cm，翠綠，莖干半木質(zhì)化，葉片1/2展開，增殖系數(shù)10；繼代增殖培養(yǎng)第40d，芽高3～4cm，翠綠，莖干剛木質(zhì)化，葉片2/3展開，帶革質(zhì)，葉面光亮，增殖系數(shù)11；繼代增殖培養(yǎng)第50d，芽高3～5cm，翠綠，莖干木質(zhì)化，葉片2/3展開，葉面光亮，革質(zhì)，增殖系數(shù)11；（3）芽生根培養(yǎng)：分別取培養(yǎng)35d、40d和50d的繼代增殖芽中芽高3～5cm，葉片翠綠，葉面光亮，帶革質(zhì)，有葉片3～5張的單芽剪切，直插式插于生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基的配方為2/3(ms+50mg/lna2so4)+3mg/l吲哚丁酸+5mg/l吲哚乙酸+0.3mg/l萘乙酸+4.5g/l瓊脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于3000～6000lx太陽光照條件下進(jìn)行芽生根培養(yǎng)，光照時(shí)間11～14h/d,溫度22~28℃，培養(yǎng)35d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第20d長出根點(diǎn)，第30d根系長0.5~1.0cm，平均生根率93.3%；培養(yǎng)40d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第17d長出根點(diǎn)，第26d根系長0.5~1.0cm，平均生根率94.8%；培養(yǎng)50d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第30d長出根點(diǎn)，第45d根系長0.5~1.0cm，平均生根率85.3%；（4）苗木移栽：將根系長0.5～1cm的瓶苗移至煉苗棚內(nèi)煉苗20d，苗木根系由白色變?yōu)榛野咨珪r(shí)進(jìn)行移栽，苗木移栽時(shí)，先打開瓶蓋，取出生根苗，清洗干凈粘附于根系上的生根培養(yǎng)基，移栽于經(jīng)過基質(zhì)消毒的營養(yǎng)杯內(nèi)，置于溫度15～28℃，濕度70～85%，遮蔭度70～80%，陰涼的環(huán)境條件下培養(yǎng)，經(jīng)苗期施肥管護(hù)，苗木高≥30cm，地徑≥0.3cm時(shí)可以出圃或上大杯培養(yǎng)大苗，平均移栽成活率98.9%。實(shí)施例3一種太陽光條件下培育金花茶種胚組培苗的方法，包括以下步驟：（1）外植體消毒和芽初代培養(yǎng)：7月采集7～8成熟果殼呈紅綠色的金花茶果實(shí)，自來水沖洗果實(shí)外表塵埃，剝?nèi)ネ夤?，置于超凈工作臺(tái)，用75%酒精溶液消毒30s，無菌水清洗4次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1‰的hgcl2溶液浸泡8min，無菌水清洗4次，剝?nèi)?nèi)果皮，接種于初代培養(yǎng)基中，初代培養(yǎng)基的配方為ms+50mg/lna2so4+2mg/l6-芐氨基腺嘌呤+0.5mg/l萘乙酸+10mg/l維生素c+300mg/l水解酪蛋白+4.5g/l瓊脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于墻體的80%為雙層玻璃窗的培養(yǎng)室內(nèi)（圖1），培養(yǎng)室內(nèi)光照時(shí)間11～14h/d,溫度22~28℃，300～800lx的太陽光照條件下進(jìn)行初代培養(yǎng)8d，之后移置于1000～2500lx的太陽光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)22d，種胚萌芽率≥98%，一般情況下，培養(yǎng)10～15d種胚萌芽，待萌芽高2～5cm時(shí)，將芽接種于增殖培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽；（2）芽繼代增殖培養(yǎng)：將胚芽剪切，轉(zhuǎn)接到繼代增殖培養(yǎng)基中，繼代增殖培養(yǎng)基的配方為：ms+50mg/lna2so4+3mg/l6-芐氨基腺嘌呤+1mg/l萘乙酸+15mg/l維生素c+18mg/l谷氨酰氨+300mg/l水解酪蛋白+4.5g/l瓊脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于1500～2500lx的太陽光照條件下進(jìn)行芽繼代增殖培養(yǎng)10d，再置于4000～5000lx的太陽光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)，光照時(shí)間11～14h/d,溫度22~28℃；繼代增殖培養(yǎng)第35d，芽高2～4cm，翠綠，莖干半木質(zhì)化，葉片1/2展開，增殖系數(shù)8.0；繼代增殖培養(yǎng)第40d，高3～4cm，翠綠，莖干剛木質(zhì)化，葉片2/3展開，帶革質(zhì)，葉面光亮，增殖系數(shù)9；繼代增殖培養(yǎng)第50d，芽高3～5cm，翠綠，莖干木質(zhì)化，葉片2/3展開，葉面光亮，革質(zhì)，增殖系數(shù)9.5；（3）芽生根培養(yǎng)：分別取培養(yǎng)35d、40d和50d的繼代增殖芽中芽高3～5cm，葉片翠綠，葉面光亮，帶革質(zhì)，有葉片3～5張的單芽剪切，直插式插于生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基的配方為2/3(ms+50mg/lna2so4)+3mg/l吲哚丁酸+5mg/l吲哚乙酸+0.3mg/l萘乙酸+4.5g/l瓊脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于2000～5000lx太陽光照條件下進(jìn)行芽生根培養(yǎng)，光照時(shí)間11～14h/d,溫度22~28℃。培養(yǎng)35d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第25d長出根點(diǎn)，第35d根系長0.5~1.0cm，平均生根率90.1%；培養(yǎng)40d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第20d長出根點(diǎn)，第30d根系長0.5~1.0cm，平均生根率91.3%；培養(yǎng)50d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第25d長出根點(diǎn)，第40d根系長0.5~1.0cm，平均生根率86.3%；（4）苗木移栽：將根系長0.5～1cm的瓶苗移至煉苗棚內(nèi)煉苗22d，苗木根系由白色變?yōu)榛野咨珪r(shí)進(jìn)行移栽，苗木移栽時(shí)，先打開瓶蓋，取出生根苗，清洗干凈粘附于根系上的生根培養(yǎng)基，移栽于經(jīng)過基質(zhì)消毒的營養(yǎng)杯內(nèi)，置于溫度15～28℃，濕度70～85%，遮蔭度70～80%，陰涼的環(huán)境條件下培養(yǎng)，經(jīng)苗期施肥管護(hù)，苗木高≥30cm，地徑≥0.3cm時(shí)可以出圃或上大杯培養(yǎng)大苗，平均移栽成活率96.7%。實(shí)施例4一種太陽光條件下培育金花茶種胚組培苗的方法，包括以下步驟：（1）外植體消毒和芽初代培養(yǎng)：6月月采集7～8成熟、果殼呈紅綠色的金花茶果實(shí)，自來水沖洗果實(shí)外表塵埃，剝?nèi)ネ夤?，置于超凈工作臺(tái)，用75%酒精溶液消毒30s，無菌水清洗3次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1‰的hgcl2溶液浸泡8min，無菌水清洗3次，剝?nèi)?nèi)果皮，接種于初代培養(yǎng)基中，初代培養(yǎng)基的配方為ms+50mg/lna2so4+2mg/l6-芐氨基腺嘌呤+0.5mg/l萘乙酸+10mg/l維生素c+300mg/l水解酪蛋白+4.5g/l瓊脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于墻體的80%為雙層玻璃窗的培養(yǎng)室內(nèi)（圖1），培養(yǎng)室內(nèi)光照時(shí)間11～14h/d,溫度22~28℃，300～800lx的太陽光照條件下進(jìn)行初代培養(yǎng)10d，之后移置于1000～2500lx的太陽光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)20d，種胚萌芽率≥98%，一般情況下，培養(yǎng)10d～15d種胚萌芽，待萌芽高2～5cm時(shí)，將芽接種于增殖培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽；（2）芽繼代增殖培養(yǎng)：將胚芽剪切，轉(zhuǎn)接到繼代增殖培養(yǎng)基中，繼代增殖培養(yǎng)基的配方為：ms+50mg/lna2so4+3mg/l6-芐氨基腺嘌呤+1mg/l萘乙酸+15mg/l維生素c+15mg/l谷氨酰氨+300mg/l水解酪蛋白+4.5g/l瓊脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于2500～4000lx的太陽光照條件下進(jìn)行芽繼代增殖培養(yǎng)10d，之后置于4000～8000lx的太陽光照條件下繼續(xù)進(jìn)行芽繼代增殖培養(yǎng)光照時(shí)間11～14h/d,溫度22~28℃：繼代增殖培養(yǎng)第35d，芽高3～6cm，紅綠色，莖干較脆，葉片1/2展開，增殖系數(shù)9.0；繼代增殖培養(yǎng)第40d，芽高3.5～6cm，翠綠，莖干半木質(zhì)化，葉片2/3展開，帶革質(zhì)，葉面光亮，增殖系數(shù)10；繼代增殖培養(yǎng)第50d，芽高4～6cm，翠綠，莖干木質(zhì)化，葉片2/3展開，葉面光亮，革質(zhì)，增殖系數(shù)10；（3）芽生根培養(yǎng)：分別取培養(yǎng)35d、40d和50d的繼代增殖芽中芽高3～6cm，葉片翠綠，葉面光亮，帶革質(zhì)，有葉片3～5張的單芽剪切，直插式插于生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基的配方為2/3（ms+50mg/lna2so4－1650mg/lnh4no3+100mg/lca(no3)2·4h2o）+3mg/l吲哚丁酸+5mg/l吲哚乙酸+0.3mg/l萘乙酸+4.5g/l瓊脂粉+30g/l蔗糖，ph=5.8，置于4000～8000lx太陽光照條件下進(jìn)行芽生根培養(yǎng)，光照時(shí)間11～14h/d,溫度22~28℃，培養(yǎng)35d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第21d長出根點(diǎn)，第29d根系長0.5~1.0cm，平均生根率91.3%；培養(yǎng)40d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第18d長出根點(diǎn)，第30d根系長0.5~1.0cm，平均生根率92.6%；培養(yǎng)50d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第25d長出根點(diǎn)，第43d根系長0.5~1.0cm，平均生根率85.3%；（4）苗木移栽：將根系長0.5～1cm的瓶苗移至煉苗棚內(nèi)煉苗28d，苗木根系由白色變?yōu)榛野咨珪r(shí)進(jìn)行移栽，苗木移栽時(shí)，先打開瓶蓋，取出生根苗，清洗干凈粘附于根系上的生根培養(yǎng)基，移栽于經(jīng)過基質(zhì)消毒的營養(yǎng)杯內(nèi)，置于溫度15～28℃，濕度70～85%，遮蔭度70～80%，陰涼的環(huán)境條件下培養(yǎng)，經(jīng)苗期施肥管護(hù)，苗木高≥30cm，地徑≥0.3cm時(shí)可以出圃或上大杯培養(yǎng)大苗，平均移栽成活率94.1%。對(duì)比例1對(duì)比例1與實(shí)施例1的區(qū)別在于，對(duì)比例1采用的光源為白熾燈，太陽光和白熾燈光譜如圖2、圖3所示，對(duì)比例1在芽初代培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)每個(gè)步驟中，都采用接種后8d置于300～800lx的太陽光照條件下培養(yǎng)，之后置于2500lx白熾燈光培養(yǎng)，對(duì)比例1所用的外植體處理方法、初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基以及培養(yǎng)室溫度環(huán)境與實(shí)例1同；在芽初代培養(yǎng)中，培養(yǎng)10d～15d種胚萌芽，芽較弱，待萌芽高1.5～2cm時(shí)，接種于增殖培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽，種胚萌芽率97%；在芽繼代增殖培養(yǎng)中，繼代增殖培養(yǎng)第35d，芽高2～3cm，紅綠色，莖干較脆，葉片1/3展開，葉面暗淡，增殖系數(shù)2.5；繼代增殖培養(yǎng)第40d，芽高2.5～4cm，綠棕色，莖干較脆，葉片1/3展開，增殖系數(shù)3.0；繼代增殖培養(yǎng)第50d，芽高3～5cm，綠棕色，莖干半木質(zhì)化，葉片1/2展開，葉面有光澤，增殖系數(shù)3.5；在芽生根培養(yǎng)中，培養(yǎng)35d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第35d長出根點(diǎn)，第55d根系長0.5~1.0cm，平均生根率33.1%；培養(yǎng)40d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第30d長出根點(diǎn)，第50d根系長0.5~1.0cm，平均生根率38.5%；培養(yǎng)50d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第25d長出根點(diǎn)，第45d根系長0.5~1.0cm，平均生根率62.0%，移栽后的平均成活率為51.7%。對(duì)比例2對(duì)比例2與實(shí)施例2的區(qū)別在于，對(duì)比例2采用的光源為白熾燈，太陽光和白熾燈光譜如圖2、圖3所示，對(duì)比例2在芽初代培養(yǎng)、芽繼代增殖培養(yǎng)、芽生根培養(yǎng)每個(gè)步驟中，都采用接種后7d置于300～800lx的太陽光照條件下培養(yǎng)，之后置于2500lx白熾燈光培養(yǎng)，對(duì)比例2所用的外植體處理方法、初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基以及培養(yǎng)室溫度環(huán)境與實(shí)例2一致；在芽初代培養(yǎng)中，培養(yǎng)10d～15d種胚萌芽，芽較弱，待萌芽高1.5～2cm時(shí)，接種于增殖培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽，種胚萌芽率97.1%；在芽繼代增殖培養(yǎng)中，繼代增殖培養(yǎng)第35d，芽高2～4cm，紅紫色，莖干較脆，葉片1/3展開，葉面暗淡，增殖系數(shù)2.6；繼代增殖培養(yǎng)第40d，芽高2.5～4cm，綠棕色，莖干較脆，葉片1/3展開，增殖系數(shù)3.0；繼代增殖培養(yǎng)第50d，高3～5cm，綠棕色，莖干半木質(zhì)化，葉片1/2展開，葉面有光澤，增殖系數(shù)3.3；在芽生根培養(yǎng)中，培養(yǎng)35d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第35d長出根點(diǎn)，第55d根系長0.5~1.0cm，平均生根率32.2%；培養(yǎng)40d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第30d長出根點(diǎn)，第50d根系長0.5~1.0cm，平均生根率33.6%；培養(yǎng)50d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第25d長出根點(diǎn)，第45d根系長0.5~1.0cm，平均生根率61.8%，移栽后的平均成活率為52.4%。對(duì)比例3對(duì)比例3與實(shí)施例3的區(qū)別在于，對(duì)比例2采用的光源為白熾燈，太陽光和白熾燈光譜如圖2、圖3所示，對(duì)比例2在芽初代培養(yǎng)、芽繼代增殖培養(yǎng)、芽生根培養(yǎng)每個(gè)步驟中，都采用接種后8d置于300～800lx的太陽光照條件下培養(yǎng)，之后置于2500lx白熾燈光培養(yǎng)。對(duì)比例3所用的外植體處理方法、初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基以及培養(yǎng)室溫度環(huán)境與實(shí)例3一致；在芽初代培養(yǎng)中，培養(yǎng)10d～15d種胚萌芽，芽較弱，待萌芽高1.5～2cm時(shí)，接種于增殖培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽，種胚萌芽率97.5%；在芽繼代增殖培養(yǎng)中，繼代增殖培養(yǎng)第35d，芽高2～4cm，紅紫色，莖干較脆，葉片1/3展開，葉面暗淡，增殖系數(shù)2.5；繼代增殖培養(yǎng)第40d，芽高2.5～4cm，綠棕色，莖干較脆，葉片1/3展開，增殖系數(shù)2.8；繼代增殖培養(yǎng)第50d，芽高3～5cm，綠棕色，莖干半木質(zhì)化，葉片1/2展開，葉面有光澤，增殖系數(shù)3.2；在芽生根培養(yǎng)中，培養(yǎng)35d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第35d長出根點(diǎn)，第55d根系長0.5~1.0cm，平均生根率30.6%；培養(yǎng)40d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第30d長出根點(diǎn)，第50d根系長0.5~1.0cm，平均生根率35.8%；培養(yǎng)50d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第25d長出根點(diǎn)，第45d根系長0.5~1.0cm，平均生根率60.2%，移栽后的平均成活率為51.3%。對(duì)比例4對(duì)比例4與實(shí)施例4的區(qū)別在于，對(duì)比例2采用的光源為白熾燈，太陽光和白熾燈光譜如圖2、圖3所示，對(duì)比例2在芽初代培養(yǎng)、芽繼代增殖培養(yǎng)、芽生根培養(yǎng)每個(gè)步驟中，都采用接種后10d置于300～800lx的太陽光照條件下培養(yǎng)，之后置于2500lx白熾燈光培養(yǎng)。對(duì)比例4所用的外植體處理方法、初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基以及培養(yǎng)室溫度環(huán)境與實(shí)例4一致；在芽初代培養(yǎng)中，培養(yǎng)10～15d種胚萌芽，芽較弱，待萌芽高1.5～2cm時(shí)，接種于增殖培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽，種胚萌芽率97.8%；在芽繼代增殖培養(yǎng)中，繼代增殖培養(yǎng)第35d，芽高2～4cm，紅紫色，莖干較脆，葉片1/3展開，葉面暗淡，增殖系數(shù)2.5；繼代增殖培養(yǎng)第40d，芽高2.5～4cm，綠棕色，莖干較脆，葉片1/3展開，增殖系數(shù)2.8；繼代增殖培養(yǎng)第50d，芽高3～5cm，綠棕色，莖干半木質(zhì)化，葉片1/2展開，葉面有光澤，增殖系數(shù)3.0；在芽生根培養(yǎng)中，培養(yǎng)35d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第38d長出根點(diǎn)，第60d根系長0.5~1.0cm，平均生根率29.5%；培養(yǎng)40d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第35d長出根點(diǎn)，第65d根系長0.5~1.0cm，平均生根率32.8%；培養(yǎng)50d的繼代增殖芽在生根培養(yǎng)的第32d長出根點(diǎn)，第46d根系長0.5~1.0cm，平均生根率55.2%，移栽后的平均成活率為46.8%。由以上實(shí)施例和對(duì)比例看出，芽繼代增殖培養(yǎng)40d的組培苗各項(xiàng)生理指標(biāo)最優(yōu)，實(shí)際生產(chǎn)也采用芽繼代增殖培養(yǎng)40d的工藝，以下就實(shí)施例和對(duì)比例的芽繼代增殖培養(yǎng)40d得到的技術(shù)效果進(jìn)行比較，如圖4、圖5和表1所示：表1實(shí)施例與對(duì)比例芽繼代增殖培養(yǎng)40d的技術(shù)效果對(duì)比芽繼代增殖培養(yǎng)40d芽生根培養(yǎng)至根系長0.5-1cm移栽成活率實(shí)施例1繼代增殖芽高3～6cm，翠綠，莖干木質(zhì)化，葉片2/3展開，帶革質(zhì)，葉面光亮，增殖系數(shù)13第15d長出根點(diǎn)，第24d根系長0.5~1.0cm，平均生根率98.3%99.4%對(duì)比例1繼代增殖芽高2.5～4cm，綠棕色，莖干較脆，葉片1/3展開，增殖系數(shù)3.0第30d長出根點(diǎn)，第50d根系長0.5~1.0cm，平均生根率38.5%51.7%實(shí)施例2繼代增殖芽高3～4cm，翠綠，莖干剛木質(zhì)化，葉片2/3展開，帶革質(zhì)，葉面光亮，增殖系數(shù)11第17d長出根點(diǎn)，第26d根系長0.5~1.0cm，平均生根率94.8%98.9%對(duì)比例2繼代增殖芽高2.5～4cm，綠棕色，莖干較脆，葉片1/3展開，增殖系數(shù)3.0第30d長出根點(diǎn)，第50d根系長0.5~1.0cm，平均生根率33.6%52.4%實(shí)施例3繼代增殖芽高3～4cm，翠綠，莖干剛木質(zhì)化，葉片2/3展開，帶革質(zhì)，葉面光亮，增殖系數(shù)9第20d長出根點(diǎn)，第30d根系長0.5~1.0cm，平均生根率91.3%96.7%對(duì)比例3繼代增殖芽高2.5～4cm，綠棕色，莖干較脆，葉片1/3展開，增殖系數(shù)2.8第30d長出根點(diǎn)，第50d根系長0.5~1.0cm，平均生根率35.8%51.3%實(shí)施例4繼代增殖芽高3.5～6cm，翠綠，莖干半木質(zhì)化，葉片2/3展開，帶革質(zhì)，葉面光亮，增殖系數(shù)10第18d長出根點(diǎn)，第30d根系長0.5~1.0cm，平均生根率92.6%94.1%對(duì)比例4繼代增殖芽高2.5～4cm，綠棕色，莖干較脆，葉片1/3展開，增殖系數(shù)2.8第35d長出根點(diǎn)，第65d根系長0.5~1.0cm，平均生根率32.8%46.8%圖4、圖5和表1所示，本發(fā)明一種太陽光條件下金花茶種胚培育組培苗的方法比白熾燈條件下培育組培苗的方法優(yōu)：繼代芽培養(yǎng)周期短，芽增殖系數(shù)高，生長健壯；芽始根時(shí)間短，生根率高，苗木移栽成活率高。因此，本發(fā)明的方法比白熾燈下培育組培苗的方法高效，更適合于規(guī)模化生產(chǎn)（圖6）。當(dāng)前第1頁12