本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種植株再生體系建立方法，具體涉及一種前胡植株再生體系建立方法。

背景技術(shù)：

前胡始載于《名醫(yī)別錄》，至今有1500多年的悠久用藥歷史。安徽寧國(guó)以盛產(chǎn)道地藥材前胡而著稱且該地所產(chǎn)前胡以個(gè)大皮黑、條長(zhǎng)肉黃、質(zhì)地柔軟、氣味濃郁等特點(diǎn)著稱，在中藥界享有“寧前胡”之美譽(yù)。由于連年采挖，野生資源逐漸枯竭，上世紀(jì)90年代末由寧國(guó)醫(yī)藥局牽頭開(kāi)展了野生前胡改家種試驗(yàn)并取得成功。目前人工栽培的前胡根部分叉現(xiàn)象嚴(yán)重，伴有變異發(fā)生導(dǎo)致前胡種性退化，品質(zhì)下降。前胡生產(chǎn)上多采用種子繁殖和分根繁殖，分根繁殖系數(shù)低，用種量大，長(zhǎng)期分根無(wú)性繁殖易導(dǎo)致種性退化，而種子繁殖萌發(fā)率低，出苗不整齊，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)。另外，前胡栽培品一般次年就出現(xiàn)抽薹現(xiàn)象，這些問(wèn)題嚴(yán)重制約了前胡的可持續(xù)發(fā)展，既難滿足市場(chǎng)需求，又不易獲得經(jīng)濟(jì)效益。

因此，如何提高前胡繁殖效率成為前胡資源保護(hù)和市場(chǎng)供需需要解決的關(guān)鍵技術(shù)。利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以遺傳母本優(yōu)良性狀，避免種性退化和遺傳變異，高繁殖率為前胡工廠化育苗提供可能；目前前胡組織培養(yǎng)的相關(guān)報(bào)道并不多見(jiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種前胡植株再生體系建立方法，該方法外植體滅菌效果好、成活率高，愈傷組織誘導(dǎo)率高、體積大、生長(zhǎng)狀態(tài)好，叢生芽增殖系數(shù)高，組培苗生根率高，移栽成活率高。

本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：

一種前胡植株再生體系建立方法，包括以下步驟：

1)外植體滅菌：以長(zhǎng)勢(shì)良好的前胡植株的根、莖、葉為外植體材料，首先對(duì)外植體材料分別用70％～75％乙醇消毒后，用無(wú)菌水沖洗；然后分別用0.1％hgcl2消毒，無(wú)菌水沖洗；再用無(wú)菌濾紙吸干外植體材料表面的水分后，無(wú)菌手術(shù)刀將根切成約0.5cm³方塊狀，莖切成約1.0cm小段狀，葉切成約0.25cm²方塊狀；

2)愈傷組織誘導(dǎo)：將1)得到的根、莖、葉外植體接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在黑暗或者弱光條件下培養(yǎng)4～5周，誘導(dǎo)出愈傷組織；

3)分化培養(yǎng)：將2)形成的愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上，在植物組織培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)4～6周，培養(yǎng)出前胡叢生芽；

4)生根培養(yǎng)：選取生長(zhǎng)健壯、株高為3～4cm的前胡叢生芽，將其切成單芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，在植物組織培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)8～10周，得到生根的前胡無(wú)菌組培苗；

5)組培苗馴化移栽：當(dāng)前胡無(wú)菌組培苗的苗高4cm以上、根系長(zhǎng)度3cm以上時(shí)選取生長(zhǎng)健壯、根系良好、株高一致的前胡組培苗，移到自然光下煉苗3～5天，然后打開(kāi)封口膜開(kāi)口煉苗1～2天；最后適時(shí)移栽至合適的移栽基質(zhì)中，幼苗管理直至成苗，即完成前胡植株再生體系的建立。

進(jìn)一步，所述1)中用乙醇滅菌的時(shí)間控制在1min內(nèi)，用0.1％hgcl2對(duì)根、莖、葉的消毒時(shí)間分別為：12～15min、12～15min和10～12min。

進(jìn)一步，所述愈傷組織培養(yǎng)基具體為：根愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：naa0.5mg/l+6-ba2.0mg/l或者2，4-d2.0mg/l+kt0.5mg/l；莖愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：naa0.5mg/l+6-ba2.0mg/l；葉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：naa0.5mg/l+tdz0.05mg/l。

進(jìn)一步，所述分化培養(yǎng)基為：6-ba1.0mg/l+naa0.5mg/l。

進(jìn)一步，所述生根培養(yǎng)基為：1/2ms+naa0.5mg/l+6-ba0.2mg/l。

進(jìn)一步，所述移栽基質(zhì)為：體積比為1:1的腐質(zhì)土和蛭石。

進(jìn)一步，所述3)和4)中植物組織培養(yǎng)室的溫度控制在25±3℃，空氣相對(duì)濕度保持在40％～60％，光照時(shí)長(zhǎng)為12h/d，光照強(qiáng)度為1500～2000lx。

進(jìn)一步，所述培養(yǎng)基為ms固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中瓊脂為8.0g/l，蔗糖濃度為30g/l，ph為5.8～6.0。

本發(fā)明有以下技術(shù)效果：

1)將新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑tdz(噻苯隆)首次應(yīng)用到傘形科前胡屬中藥材前胡組織培養(yǎng)中，并發(fā)現(xiàn)對(duì)前胡葉片愈傷的形成具有良好效果。

2)前胡葉片誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織體積大，生長(zhǎng)狀態(tài)好，可用于次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)和細(xì)胞工程。

3)利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)前胡優(yōu)良性狀進(jìn)行保留并世代傳遞，避免種性退化和遺傳變異；利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)前胡進(jìn)行再生體系構(gòu)建，培養(yǎng)條件不受外界天氣變化和病蟲(chóng)害的影響；該方法成本低廉、愈傷組織誘導(dǎo)率高、重復(fù)性好、生產(chǎn)和生長(zhǎng)周期短。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)中的根愈傷組織圖；

圖2為本發(fā)明愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)中的莖愈傷組織圖；

圖3為本發(fā)明愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)中的葉愈傷組織圖；

圖4為本發(fā)明分化培養(yǎng)基中長(zhǎng)成的叢生芽圖；

圖5為本發(fā)明生根培養(yǎng)基長(zhǎng)成的寧前胡無(wú)菌組培苗圖；

圖6為本發(fā)明生根培養(yǎng)基長(zhǎng)成的寧前胡組培苗的生根圖；

圖7為本發(fā)明生根組培苗長(zhǎng)成的寧前胡再生植株圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。

本發(fā)明的詳細(xì)實(shí)施過(guò)程及內(nèi)容如下：

(1)外植體滅菌：以長(zhǎng)勢(shì)良好的寧前胡植株的根、莖、葉為外植體材料，分別用75％乙醇消毒30s，無(wú)菌水沖洗3～5次；然后用0.1％hgcl2分別對(duì)根、莖、葉消毒15、12和10min，無(wú)菌水沖洗3～5次后，用無(wú)菌濾紙吸干根、莖、葉表面的水分，無(wú)菌手術(shù)刀將根切成0.5cm³的方塊，莖切成長(zhǎng)度為1.0cm的小段，葉切成0.25cm²的方塊。

本實(shí)施例中用75％乙醇+0.1％hgcl2對(duì)寧前胡根、莖、葉進(jìn)行消毒，是通過(guò)消毒劑篩選實(shí)驗(yàn)，得到根、莖、葉消毒的結(jié)果而確定的；結(jié)果見(jiàn)表1。

表1消毒劑對(duì)消毒效果的影響

由表1可知，本實(shí)施例的75％乙醇+0.1％hgcl2對(duì)寧前胡根、莖、葉3種外植體消毒效果好、成活率高。

確定消毒劑組合后，對(duì)消毒時(shí)間范圍進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)，其中根的消毒時(shí)間為8、10、12、15、20min，莖和葉的消毒時(shí)間為5、8、10、12、15min，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2消毒時(shí)間對(duì)滅菌效果的影響

由表2可知，本實(shí)施例的根采用75％乙醇30s+0.1％hgcl215min的消毒效果最佳，莖采用75％乙醇30s+0.1％hgcl212min的消毒效果最佳，葉采用75％乙醇30s+0.1％hgcl210min的消毒結(jié)果最佳。

(2)愈傷組織誘導(dǎo)：將(1)得到的根、莖、葉外植體接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，黑暗或者弱光條件下培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)條件的篩選見(jiàn)表5、6)，根、莖、葉的具體培養(yǎng)時(shí)間為：4～5周；其中，通過(guò)不同激素組合對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)影響的實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表3及表7，確定根愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ms+naa0.5mg/l+6-ba2.0mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂8g/l或者ms+2，4-d2.0mg/l+kt0.5mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂8g/l，最高誘導(dǎo)率達(dá)78.89％；莖愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ms+naa0.5mg/l+6-ba2.0mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂8g/l，最高誘導(dǎo)率達(dá)80.00％；葉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ms+naa0.5mg/l+tdz0.05mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂8g/l，最高誘導(dǎo)率達(dá)95.56％；ph為5.8～6.0；根、莖、葉誘導(dǎo)愈傷組織的形態(tài)特征，見(jiàn)表4；

表3不同激素組合對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表4不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織的比較

由表4可知，本發(fā)明實(shí)施例的寧前胡植株再生體系中，葉片是最好的愈傷誘導(dǎo)材料選擇，其次依次是莖段和塊根。

表5光照條件對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表5可知，本發(fā)明實(shí)施例的寧前胡植株再生體系中，避光條件下進(jìn)行寧前胡葉片愈傷組織的誘導(dǎo)，有利于愈傷組織形成和提高誘導(dǎo)率。

表6黑暗處理對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表6可知，本發(fā)明實(shí)施例的寧前胡植株再生體系中，黑暗培養(yǎng)周期過(guò)短或者過(guò)長(zhǎng)都影響愈傷形成和生長(zhǎng)；黑暗培養(yǎng)一周后逐漸增加光照強(qiáng)度有利于愈傷組織形成，保持愈傷組織健康生長(zhǎng)。

表7激素對(duì)愈傷組織繼代的影響

由表7可知，本發(fā)明實(shí)施例的寧前胡植株再生體系中，ms+6-ba1.0mg/l+naa0.5mg/l對(duì)寧前胡愈傷組織增殖和分化效果最好，其中分化率高達(dá)66.67％，增殖系數(shù)為4.63，愈傷生長(zhǎng)狀態(tài)較好，體積較大。

(3)分化培養(yǎng)：將(2)形成的愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上，在溫度為25℃，空氣相對(duì)濕度保持在40％～60％，光照時(shí)長(zhǎng)為12h/d，光照強(qiáng)度為1500～2000lx植物組織培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，根、莖、葉的具體培養(yǎng)時(shí)間為：4～5周，培養(yǎng)出株高為3～4cm的寧前胡叢生芽，其中，通過(guò)激素對(duì)不定芽分化影響的實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表8，確定分化培養(yǎng)基為：ms+6-ba1.0mg/l+naa0.5mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂8g/l，ph為5.8～6.0。

表8激素對(duì)不定芽分化的影響

由表8可知，本發(fā)明實(shí)施例的寧前胡植株再生體系中，ms+6-ba1.0mg/l+naa0.5mg/l的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)不定芽的增殖和分化效果最明顯，誘導(dǎo)出的不定芽芽體數(shù)量多且壯實(shí)、長(zhǎng)勢(shì)好、葉色濃綠，在后續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)情況優(yōu)良。

(4)生根培養(yǎng)：選取生長(zhǎng)健壯的寧前胡叢生芽，將其切成單芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，保持植物組織培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)條件不變，培養(yǎng)8～10周，得到生根的寧前胡無(wú)菌組培苗，其中，通過(guò)不同激素組合對(duì)寧前胡生根影響的實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表9，確定生根培養(yǎng)基為：1/2ms+naa0.5mg/l+6-ba0.2mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂8g/l，ph為5.8～6.0。

表9不同激素組合對(duì)寧前胡生根影響

由表9可知，本發(fā)明實(shí)施例的寧前胡植株再生體系中，寧前胡組培苗最佳生根培養(yǎng)基為1/2ms+naa0.5mg/l+6-ba0.2mg/l。

(5)組培苗馴化移栽：當(dāng)寧前胡組培苗苗高達(dá)4cm以上、根系長(zhǎng)度達(dá)3cm以上時(shí)選取生長(zhǎng)健壯、根系良好、株高一致的寧前胡組培苗，移到自然光下煉苗3～5天，然后打開(kāi)封口膜開(kāi)口煉苗1～2天；最后適時(shí)移栽到移栽基質(zhì)(體積比為1:1的腐質(zhì)土和蛭石，移栽基質(zhì)的確定見(jiàn)移栽基質(zhì)對(duì)組培苗移栽影響的實(shí)驗(yàn)，表10)中，幼苗管理直至成苗，即完成寧前胡植株再生體系建立。

表10移栽基質(zhì)對(duì)組培苗移栽的影響

由表10可知，本發(fā)明實(shí)施例的寧前胡植株再生體系中，腐質(zhì)土和蛭石的體積比為1:1的混合基質(zhì)最適宜寧前胡再生植株的生長(zhǎng)。

所述實(shí)施例為本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，但本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式，在不背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠做出的任何顯而易見(jiàn)的改進(jìn)-替換或變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。