本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其是一種五蓮楊組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：五蓮楊(populuswulianensis)屬于楊柳科(salicaceae)，楊屬(populus)白楊派，為難生根樹種。其又名昆崳楊，為山東特有珍稀樹種，主要分布于山東日照(五蓮山)和煙臺(昆崳山、招虎山)等地，生于海拔300～500m山溝雜木林中，散生或形成片林。形態(tài)上介于山楊(polulusdavidianadode.)與響葉楊(polulusadenopudamaxim.)之間，是良好的用材樹種，具有優(yōu)良的耐水淹能力，對洪災(zāi)和風浪有很強的抵御能力，適應(yīng)風力強勁的生長環(huán)境。利用組織培養(yǎng)方法繁殖楊屬植物良種資源，不受季節(jié)和生長時間的限制，可以在短時間內(nèi)以較快的速度獲得大量苗木。在常規(guī)的楊屬植物組織培養(yǎng)過程中，尤其白楊派植物的組織培養(yǎng)中，極易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。玻璃化現(xiàn)象是植物組織培養(yǎng)中特有的一種生理失調(diào)或生理病變，表現(xiàn)為試管苗呈半透明狀、失綠、葉片皺縮卷曲、易碎。五蓮楊在初代培養(yǎng)過程中玻璃化發(fā)生率為50％～80％。降低組培過程中的玻璃化發(fā)生率，成為楊屬植物組織培養(yǎng)的重點研究問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在提供一種五蓮楊組織培養(yǎng)方法，解決五蓮楊組培過程中玻璃化發(fā)生率高、成活率低、無法推廣五蓮楊規(guī)?；绲膯栴}。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的，步驟如下：(1)初代培養(yǎng)：將外植體接種到初代培養(yǎng)基中進行啟動培養(yǎng)，得到初代苗；(2)去玻璃化培養(yǎng)：將上一步得到的初代苗，接種于去玻璃化培養(yǎng)基中進行去玻璃化培養(yǎng)，得到去玻璃化苗；(3)增殖培養(yǎng)：將去玻璃化苗接種于增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，得到繼代苗；(4)生根培養(yǎng)：將繼代苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，得到生根苗；所述初代培養(yǎng)基為，添加25g/l蔗糖+5.5g/l瓊脂粉的ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)ph值至5.8；所述去玻璃化培養(yǎng)基為，添加0.05mg/lnaa+0.4mg/l6-ba+30g/l蔗糖+6.5g/l瓊脂粉的1/2(n)ms培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)ph值至5.8；所述增殖培養(yǎng)基為，添加0.03mg/lnaa+0.4～0.5mg/l6-ba+30g/l蔗糖+6.5g/l瓊脂粉的ms培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)ph值至5.8；所述生根培養(yǎng)基為，添加0.05mg/lnaa+15g/l蔗糖+6.5g/l瓊脂粉的1/2ms培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)ph值至5.8。作為一種優(yōu)選的實施方案，所述外植體選用1.5～2.0cm的帶莖芽段。作為一種優(yōu)選的實施方案，所述帶莖芽段是春季3月中旬采集的新抽生頂部帶芽莖段。作為一種優(yōu)選的實施方案，所述初代培養(yǎng)之前還包括外植體消毒過程，所述外植體消毒過程：用洗衣粉清洗外植體表面，用細流水過夜沖洗外植體，將沖洗干凈的外植體，置于超凈工作臺上進行滅菌，采用75％酒精處理35s，用5％次氯酸鈉處理9min進行消毒處理，消毒后帶莖芽段切成0.8～1.5cm芽莖段，置于初代培養(yǎng)基中培養(yǎng)。作為一種優(yōu)選的實施方案，所述組織培養(yǎng)快繁方法的培養(yǎng)條件是：白天溫度為25±2℃，夜間18±2℃，光照時間為16h，光照強度為3000～5000lx。作為一種優(yōu)選的實施方案，所述初代培養(yǎng)的時間是25d，所述去玻璃化培養(yǎng)的時間是35d，所述增殖培養(yǎng)的時間是35d。作為一種優(yōu)選的實施方案，所述組織培養(yǎng)方法還包括煉苗，所述煉苗：將生根苗移栽于溫室中封口煉苗，5d后，去除無菌蓋，繼續(xù)煉苗3～4d。作為一種優(yōu)選的實施方案，所述組織培養(yǎng)方法還包括移栽，所述移栽：清水沖洗成活的幼苗，將其移栽至經(jīng)過0.5％高錳酸鉀消毒的輕基質(zhì)，所述輕基質(zhì)包括草炭與蛭石，所述輕基質(zhì)中草炭與蛭石的比例是1:1。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的組織培養(yǎng)方法增加了去玻璃化步驟，將經(jīng)過初代培養(yǎng)后得到的無菌苗接種于去玻璃化培養(yǎng)基上，通過去玻璃化步驟降低五蓮楊組培玻璃化發(fā)生率，去玻璃化培養(yǎng)基配比簡單，同時為了更好解決技術(shù)問題，本發(fā)明選用的外植體優(yōu)先選用春季3月中旬采集的新抽生頂部帶芽莖段，剪成1.5～2.0cm長度，進行組織培養(yǎng)，通過芽的增殖進行快速繁殖，保證了遺傳的穩(wěn)定性，取材容易；同時，本發(fā)明提供的組織培養(yǎng)方法降低了組織繁育成本，提高五蓮楊組培育苗效率。附圖說明圖1為滅菌成活的外植體的照片圖；圖2為五蓮楊未玻璃化苗的照片圖；圖3為去玻璃化組培苗的照片圖；圖4為增殖繼代培養(yǎng)的照片圖；圖5為生根培養(yǎng)階段的照片圖；圖6為煉苗移栽成活后植株照片圖。具體實施方式下面將結(jié)合本發(fā)明的具體實施例與附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。實施例一一種五蓮楊組織培養(yǎng)方法，步驟如下：(1)外植體消毒培養(yǎng)用枝剪快速剪下1.5～2.0cm的帶莖芽段，作為外植體，用洗衣粉清洗表面，用細流水過夜沖洗，將沖洗干凈的帶芽莖段置于超凈工作臺上，采用75％酒精處理35s，用5％次氯酸鈉處理9min進行滅菌，用手術(shù)刀將脫毒后帶莖芽段切成0.8～1.5cm，置于ms空白培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間是25d，培養(yǎng)結(jié)果參照圖1。(2)去玻璃化培養(yǎng)：從上一步得到的無菌苗中，選取未玻璃化、莖高1.5～2.0cm的叢生苗莖段，接種于去玻璃化培養(yǎng)基中進行去玻璃化培養(yǎng)35d，得到去玻璃化苗。未玻璃化苗參照圖2。試驗所用去玻璃化培養(yǎng)基，是選取ms或1/2(n)ms作為母液，選擇性添加naa、6-ba兩種細胞生長素及活性炭(ac)，培養(yǎng)基ph值調(diào)為5.8，添加結(jié)果見表1。表1去玻璃化培養(yǎng)基的選擇試驗方法：將選取的未玻璃化、莖高1.5～2.0cm的莖段分成11組，每組48個莖段，將試驗對象接種于表1所列出的不同培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，統(tǒng)一光照培養(yǎng)條件：白天溫度為25±2℃，夜間18±2℃，光照時間為16h，光照強度為3000～5000lx，培養(yǎng)天數(shù)是35d，得到各組玻璃化發(fā)生率數(shù)據(jù)，試驗結(jié)果見表2。表2不同培養(yǎng)基的玻璃化發(fā)生率數(shù)據(jù)由表2可見，ms母液中n含量減半可緩減玻璃化，提高增殖系數(shù)。加入ac后，玻璃化程度并未得到緩解，此處可得出，加入ac并未對五蓮楊玻璃化起到良性效果。根據(jù)綜合數(shù)據(jù)分析，1/2(n)ms+0.05mg/lnaa+0.4mg/l6-ba培養(yǎng)基玻璃化發(fā)生率為10.1％，增值系數(shù)達7.37，平均莖高為3.33cm；1/2(n)ms+0.05mg/lnaa+0.5mg/l6-ba培養(yǎng)基玻璃化發(fā)生率降為14％，增值系數(shù)達7.35，平均莖高為3.51cm，上述兩種培養(yǎng)基均具有顯著的去玻璃化效果。在上述基礎(chǔ)上進行了第二次試驗：選取未玻璃化、莖高1.5～2.0cm的莖段，分成8組，每組48個，在1/2(n)ms+0.05mg/lnaa+0.4mg/l6-ba培養(yǎng)基和1/2(n)ms+0.05mg/lnaa+0.5mg/l6-ba培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別添加不同濃度的蔗糖與瓊脂粉，培養(yǎng)基ph值調(diào)為5.8，進一步進行去玻璃化試驗。表3添加蔗糖和瓊脂的去玻璃化培養(yǎng)基處理母液naa(mg/l)6-ba(mg/l)蔗糖(g/l)瓊脂粉(g/l)11/2(n)ms0.050.425621/2(n)ms0.050.4256.531/2(n)ms0.050.430641/2(n)ms0.050.4306.551/2(n)ms0.050.525661/2(n)ms0.050.5256.571/2(n)ms0.050.530681/2(n)ms0.050.5306.5試管苗莖段接種到培養(yǎng)基中后，光照培養(yǎng)條件為：白天溫度為25±2℃，夜間18±2℃，光照時間為16h，光照強度為3000～5000lx。培養(yǎng)35d，培養(yǎng)結(jié)果見表4。表4添加蔗糖和瓊脂的去玻璃化試驗結(jié)果由表4可見，增大蔗糖及瓊脂粉的添加，有利于降低玻璃化發(fā)生率，添加30g/l蔗糖+6.5g/l瓊脂粉時，出現(xiàn)玻璃化發(fā)生率最低值；從綜合數(shù)據(jù)分析可知，1/2(n)ms+0.05mg/lnaa+0.4mg/l6-ba+30g/l蔗糖+6.5g/l瓊脂粉的培養(yǎng)基玻璃化發(fā)生率最低值為0，增殖系數(shù)為7.65，平均莖高是3.75cm。從表4的平均玻璃化程度水平數(shù)據(jù)結(jié)果得出，高濃度蔗糖及瓊脂的添加利于五蓮楊試管苗的玻璃化去除。因此選用的去玻璃化培養(yǎng)基為，添加0.05mg/lnaa+0.4mg/l6-ba+30g/l蔗糖+6.5g/l瓊脂粉的1/2(n)ms培養(yǎng)基，培養(yǎng)結(jié)果參照圖3。(4)增殖培養(yǎng)：將去玻璃化苗接種于增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)35d，得到繼代苗，試驗所用的增殖培養(yǎng)基以ms培養(yǎng)基為母液，添加不同濃度的naa和6-ba，添加情況見表5。表5五蓮楊增殖培養(yǎng)基試驗處理naa(mg/l)6-ba(mg/l)10.030.420.040.430.050.440.030.550.040.560.050.570.030.680.040.690.050.6試驗方法：將健壯試管叢生苗莖段分成9組，每組48個莖段，分別在ms+30g/l蔗糖+6.5g/l瓊脂粉中附加不同濃度的naa和6-ba的增殖培養(yǎng)基中進行正交試驗，培養(yǎng)基ph值調(diào)為5.8。培養(yǎng)條件為：白天溫度為25±2℃，夜間18±2℃，光照時間為16h，光照強度為3000～5000lx。培養(yǎng)35d，各組增殖效果見表6。表6五蓮楊增殖培養(yǎng)結(jié)果由表6可知，處理1和處理4的增殖系數(shù)較突出，有效苗及莖高均有較高值，處理1玻璃化發(fā)生率有最小值為0；處理4玻璃化發(fā)生率為1.4％。與表5相比較，先進行去玻璃化培養(yǎng)，微調(diào)節(jié)激素濃度，有利于組培苗增殖系數(shù)的擴增及莖的伸長，并促進了有效苗的增加。從玻璃化發(fā)生率最低出發(fā)，利于五蓮楊增殖的培養(yǎng)基選用添加0.03mg/lnaa+0.4mg/l6-ba+30g/l蔗糖+6.5g/l瓊脂粉的ms培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上得到的培養(yǎng)結(jié)果，參照圖4。(5)生根培養(yǎng)：將繼代苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)35d，得到生根苗。所用的生根培養(yǎng)基選用1/2ms+6.5g/l瓊脂粉中附加不同濃度蔗糖、naa或iba的生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)基選取結(jié)果見表7。表7生根培養(yǎng)基試驗處理naa(mg/l)iba(mg/l)蔗糖(g/l)10.013020.023030.033040.043050.053060.051570.043080.083090.1230100.1630110.230120.215試驗方法：將健壯試管叢生苗莖段分成12組，每組48個莖段，分別在1/2ms+6.5g/l瓊脂粉并附加不同濃度蔗糖、naa或iba的生根培養(yǎng)基中進行濃度梯度試驗，培養(yǎng)基ph值調(diào)為5.8。統(tǒng)一培養(yǎng)條件為：白天溫度為25±2℃，夜間18±2℃，光照時間為16h，光照強度為3000～5000lx，培養(yǎng)天數(shù)是35d。各培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果見表8.表8不同生根培養(yǎng)基試驗結(jié)果由表8可知，整體達到最高峰值均出現(xiàn)在處理6，其生根率達91.7％，平均莖高為4.58cm，玻璃化發(fā)生率為0。從添加單一因素分析，激素naa作用效果強于iba；蔗糖減半后，利于五蓮楊組培苗生根。因此利于五蓮楊生根培養(yǎng)基，選用添加0.05mg/lnaa+15g/l蔗糖+6.5g/l瓊脂粉1/2ms培養(yǎng)基，在此生根培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結(jié)果參照圖5。(6)煉苗，將生根苗移栽于溫室中封口煉苗，5d后，去除無菌蓋，繼續(xù)煉苗3d，用清水洗去根系表面附著的培養(yǎng)基。(7)移栽，選用成活的幼苗，用清水沖洗掉幼苗根部的培養(yǎng)基，將其移栽至經(jīng)0.5％高錳酸鉀消毒的輕基質(zhì)，所述輕基質(zhì)包括草炭與蛭石，所述輕基質(zhì)中草炭與蛭石的比例是1:1，移栽成活情況參照圖6。實施例二與實施例一的區(qū)別在于：選用的增殖培養(yǎng)基為，添加0.03mg/lnaa+0.5mg/l6-ba+30g/l蔗糖+6.5g/l瓊脂粉的ms培養(yǎng)基。將去玻璃化苗接種于增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)35d，得到繼代苗，試驗所用的增殖培養(yǎng)基以ms培養(yǎng)基為母液，添加不同濃度的naa和6-ba，添加情況見表9。表9五蓮楊增殖培養(yǎng)基試驗試驗方法：將健壯試管叢生苗莖段分成9組，每組48個莖段，分別在ms+30g/l蔗糖+6.5g/l瓊脂粉中附加不同濃度的naa和6-ba的增殖培養(yǎng)基中進行正交試驗，培養(yǎng)基ph值調(diào)為5.8。培養(yǎng)條件為：白天溫度為25±2℃，夜間18±2℃，光照時間為16h，光照強度為3000～5000lx。培養(yǎng)35d，各組增殖效果見表10。表10五蓮楊增殖培養(yǎng)結(jié)果由表10可知，處理1和處理4的增殖系數(shù)較突出，有效苗及莖高均有較高值，處理1玻璃化發(fā)生率有最小值為0，有效苗為6.67株，增殖系數(shù)是10.5，平均莖高5.88cm；處理4玻璃化發(fā)生率為1.4％，有效苗為6.67株，增殖系數(shù)為11.58，平均莖高為5.96cm，，處理4的增殖系數(shù)高于處理1，平均莖高高于處理1，綜合比較下，利于五蓮楊增殖的培養(yǎng)基選用添加0.03mg/lnaa+0.5mg/l6-ba+30g/l蔗糖+6.5g/l瓊脂粉的ms培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上得到的培養(yǎng)結(jié)果。實施例三與實施例一的區(qū)別在于：本實施中五蓮楊組織培養(yǎng)步驟依次為：外植體消毒、初代培養(yǎng)、去玻璃化培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗、移栽，去玻璃化培養(yǎng)之前，即外植體消毒之后增加了初代培養(yǎng)步驟。初代培養(yǎng)步驟如下：將經(jīng)過消毒的外植體接種到初代培養(yǎng)基進行啟動培養(yǎng)，培養(yǎng)得到初代無菌苗，初代培養(yǎng)基選用添加25g/l蔗糖+5.5g/l瓊脂粉的ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基，ph值調(diào)節(jié)至5.8，培養(yǎng)條件為：白天溫度為25±2℃，夜間18±2℃，光照時間為16h，光照強度為3000～5000lx，培養(yǎng)時間是25d，將培養(yǎng)后的初代苗接種在去玻璃化培養(yǎng)培養(yǎng)中進行去玻璃化培養(yǎng)。常用的初代培養(yǎng)基為了誘導培養(yǎng)物腋芽萌發(fā)，以獲得愈傷組織誘導的無菌幼葉，通常選用在ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加生長激素、分裂素等。選用8組，每組48個無菌莖段作為實驗對象，選用比較常見的初代培養(yǎng)基，即添加0.5mg/l6-ba+0.05mg/lnaa的ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照組，運用到本實施例中，與選用25g/l蔗糖+5.5g/l瓊脂粉的ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基對比培養(yǎng)結(jié)果，對照組與實驗組培養(yǎng)步驟依次為：外植體消毒、初代培養(yǎng)、去玻璃化培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗、移栽，初代培養(yǎng)選用8組，每組48個無菌莖段，玻璃化率結(jié)果見表11。表11初代培養(yǎng)基試驗結(jié)果由表11中，可以看出，運用本實施例的初代培養(yǎng)基對楊樹莖段進行初代培養(yǎng)，玻璃化率低，組織培養(yǎng)效率高。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12