本發(fā)明涉及一種丹參組織培養(yǎng)過程中叢芽壯苗的培養(yǎng)工藝。
背景技術(shù)：
丹參(salviamiltiorrhizabunge)，唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，為我國(guó)傳統(tǒng)藥材，又名大紅袍，血參根，紫丹參等。春、秋二季采挖，全國(guó)大部分地區(qū)都有分布。具有活血祛瘀，消炎止痛、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、改善心肌缺血狀況、降低血壓、安神靜心、降血糖和抗菌等功效；對(duì)月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)閉痛經(jīng)，癥瘕積聚，胸腹刺痛，熱痹疼痛，瘡瘍腫痛，心煩不眠，肝脾腫大，心絞痛等病癥有一定的療效。其活性成分主要有兩大類：脂溶性二萜類化合物和二為水溶性的多聚酚酸類成分。
近年來丹參的市場(chǎng)需求量日益增加，而傳統(tǒng)的種子繁殖和分根繁殖繁殖方式來種植丹參，丹參產(chǎn)量較低，品質(zhì)退化。因此現(xiàn)有的丹參繁殖方式已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們的要求。而近年來興起的植物組織培養(yǎng)技術(shù)，不僅可以批量培育丹參苗，且可以保持母株的優(yōu)良性狀。丹參植物組織培養(yǎng)技術(shù)是指從丹參植物體分離出符合需要的組織、器官、細(xì)胞、原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在人工控制條件下誘導(dǎo)出愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整植株。
隨著丹參組培技術(shù)的深入研究，為達(dá)到最好的成苗效果，優(yōu)化丹參組織培養(yǎng)過程中叢芽壯苗培養(yǎng)條件具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述存在的問題，本發(fā)明旨在提供丹參組織培養(yǎng)過程中叢芽壯苗的培養(yǎng)工藝，該工藝主要對(duì)丹參叢生苗培養(yǎng)過程中的培養(yǎng)基進(jìn)成分進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，不僅可使丹參叢芽長(zhǎng)成粗壯的丹參苗，長(zhǎng)勢(shì)良好，生長(zhǎng)速度快，而且通常與其他激素配用，才會(huì)有利于形成壯苗。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
丹參組織培養(yǎng)過程中叢芽壯苗的培養(yǎng)工藝，包括以下步驟：
1)培養(yǎng)基的配制
a、激素母液配制：稱取6-ba0.1g，用5ml1mnaoh引溶，再用純水定容至100ml，即為濃度為1.0mg/ml的6-ba母液；稱取ga30.1g，用5ml1mnaoh引溶，再用純水定容至100ml，即為濃度為1.0mg/ml的ga3母液；
b、激素抽濾滅菌：將濾膜放進(jìn)抽濾頭，高壓滅菌，帶進(jìn)超凈臺(tái)，將6-ba、ga3抽濾滅菌，備用；
c、配制培養(yǎng)基基本成分：ms+30g/l蔗糖+5.26g/l瓊脂，ph5.8；高壓滅菌；帶入超凈臺(tái)備用；
d、添加激素：在超凈臺(tái)上用無菌的移液搶吸取6-ba加入到基本培養(yǎng)基里，使其濃度為1.0mg/l，換取槍頭繼續(xù)吸取ga3入到基本培養(yǎng)基里，使其濃度為0.2mg/l，混勻；
e、分裝：將添加好激素的培養(yǎng)基分裝到無菌的組培瓶中，每瓶30～40ml，成分為：ms+1.0mg/l6-ba+0.2mg/lga3+30g/l蔗糖+5.26g/l瓊脂，ph5.8；
2)叢生芽的選擇；
3)叢生芽的處理：采用無菌處理法進(jìn)行處理；
4)叢生芽的接種；
5)叢生芽的培養(yǎng)：接種后的叢芽放置于組培室的組培架上進(jìn)行叢芽的誘導(dǎo)，培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度27±0.5℃，光照時(shí)間12h，光強(qiáng)3000lx，t5植物培養(yǎng)燈管。
作為優(yōu)選，所述步驟(2)“叢生芽的選擇”是指愈傷置于繼代培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽1個(gè)月后，選擇無污染，生長(zhǎng)良好的的叢生芽帶入超凈臺(tái)備用，并用75％酒精棉球擦拭瓶口處。
作為優(yōu)選，所述步驟(3)“叢生芽的處理”是用無菌的鑷子將生長(zhǎng)良好的叢生芽鑷起，置于無菌的接種盤上，用無菌的剪刀減去底部黑色或褐色的部分，用剪刀和鑷子將叢芽分開，備用。
作為優(yōu)選，所述步驟(4)“叢生芽的接種”用無菌的鑷子將叢芽鑷起，插入到所述e步驟的固體培養(yǎng)基上。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明添加在一定含量6-ba的基礎(chǔ)上，添加少量的ga3，可使丹參叢芽長(zhǎng)成粗壯的丹參苗，長(zhǎng)勢(shì)良好，生長(zhǎng)速度快。ga3作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑，通常與其他激素配用，才會(huì)有利于形成壯苗，而單用或者用量過大會(huì)產(chǎn)生植株細(xì)長(zhǎng)、瘦弱等副作用。
具體實(shí)施方式
為了使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的描述。
實(shí)施例：丹參組織培養(yǎng)過程中叢芽壯苗的培養(yǎng)工藝，包括以下步驟：
1)培養(yǎng)基的配制
a、激素母液配制：稱取6-ba0.1g，用5ml1mnaoh引溶，再用純水定容至100ml，即為濃度為1.0mg/ml的6-ba母液；稱取ga30.1g，用5ml1mnaoh引溶，再用純水定容至100ml，即為濃度為1.0mg/ml的ga3母液；
b、激素抽濾滅菌：將濾膜放進(jìn)抽濾頭，高壓滅菌，帶進(jìn)超凈臺(tái)，將6-ba、ga3抽濾滅菌，備用；
c、配制培養(yǎng)基基本成分：ms+30g/l蔗糖+5.26g/l瓊脂，ph5.8；高壓滅菌；帶入超凈臺(tái)備用；
d、添加激素：在超凈臺(tái)上用無菌的移液搶吸取6-ba加入到基本培養(yǎng)基里，使其濃度為1.0mg/l，換取槍頭繼續(xù)吸取ga3入到基本培養(yǎng)基里，使其濃度為0.2mg/l，混勻；
e、分裝：將添加好激素的培養(yǎng)基分裝到無菌的組培瓶中，每瓶30～40ml，成分為：ms+1.0mg/l6-ba+0.2mg/lga3+30g/l蔗糖+5.26g/l瓊脂，ph5.8；
2)叢生芽的選擇：愈傷置于繼代培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽1個(gè)月后，選擇無污染，生長(zhǎng)良好的的叢生芽帶入超凈臺(tái)備用，并用75％酒精棉球擦拭瓶口處；
3)叢生芽的處理：用無菌的鑷子將生長(zhǎng)良好的叢生芽鑷起，置于無菌的接種盤上，用無菌的剪刀減去底部黑色或褐色的部分。用剪刀和鑷子將叢芽分開，備用；
4)叢生芽的接種：用無菌的鑷子將叢芽鑷起，插入到ms固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基成分為ms+1.0mg/l6-ba+0.2mg/lga3+30g/l蔗糖+5.26g/l瓊脂，ph5.8；
5)叢生芽的培養(yǎng)：接種后的叢芽放置于組培室的組培架上進(jìn)行叢芽的誘導(dǎo)，培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度27±0.5℃，光照時(shí)間12h，光強(qiáng)3000lx，t5植物培養(yǎng)燈管。
6-ba作為一種使用廣泛的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，具有多種生理作用，丹參叢芽壯苗是利用其促分化、打破頂端優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)植物側(cè)芽生長(zhǎng)、促進(jìn)或抑制葉的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)等作用；而ga3具有加速植物莖的伸長(zhǎng)的功能。因此，當(dāng)單用或者過量使用ga3時(shí)，植物側(cè)芽還未長(zhǎng)出時(shí)，莖部已經(jīng)快速長(zhǎng)高，從而產(chǎn)生的植株細(xì)長(zhǎng)、瘦弱。而當(dāng)適當(dāng)濃度的6-ba與ga3配合使用時(shí)，6-ba促分化、打破頂端優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)側(cè)芽生長(zhǎng)的功能可以與ga3加速植物莖部伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的功能相互補(bǔ)，且加入少量的ga3，可以加快植物伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，縮短實(shí)驗(yàn)周期，在短時(shí)間內(nèi)可以達(dá)到叢芽壯苗的效果。
在具體實(shí)驗(yàn)中本發(fā)明以無菌的丹參叢芽為實(shí)驗(yàn)材料，以ms為基本培養(yǎng)基，首先單獨(dú)使用6-ba，30天后比較不同濃度梯度下叢芽生長(zhǎng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度的6-ba叢芽生長(zhǎng)速度慢，且部分叢芽從不能形成完整植株，而濃度過高時(shí)，部分叢芽出現(xiàn)黃褐色褐色，不能形成整株丹參苗。而濃度在1.0mg/l時(shí)，丹參莖部粗壯，葉片為綠色，長(zhǎng)勢(shì)旺盛。
表1：不同濃度6-ba對(duì)丹參叢芽壯苗生長(zhǎng)的影響
為達(dá)到更好的效果，ms培養(yǎng)基添加1.0mg/l6-ba的基礎(chǔ)上，添加了少量的ga3，并通過實(shí)驗(yàn)來確定ga3的最佳使用濃度。結(jié)果表明，低濃度的ga3有利于壯苗，濃度在0.2mg/l時(shí)效果最好，丹參成苗率為100％，且生長(zhǎng)旺盛，莖部粗壯，濃度較高時(shí)，植株長(zhǎng)勢(shì)纖弱，莖部細(xì)長(zhǎng)。
表2：不同濃度激素組合對(duì)丹參叢芽壯苗生長(zhǎng)的影響
表3為本發(fā)明丹參叢芽壯苗培養(yǎng)結(jié)果
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。