本發(fā)明涉及組織細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種造血干細胞細胞凍存劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

造血干細胞是血液系統(tǒng)中的成體干細胞，是一個異質(zhì)性的群體，具有長期自我更新的能力和分化成各類成熟血細胞的潛能。它是研究歷史最長且最為深入的一類成體干細胞，對研究各類干細胞，包括腫瘤干細胞，具有重要指導(dǎo)意義。

近幾年來.自體造血干細胞移植在惡性血液病和多種實體腫瘤的治療上得到了廣泛的應(yīng)用。如何高質(zhì)量地保存采集的自體造血干細胞是ahsct治療成功的關(guān)鍵之一。ahsc的保存分為非冷凍保存和冷凍保存兩種，前者雖無冷凍損傷。但保存時間短，限制了臨床應(yīng)用.后者將造血干細胞置于0℃以下，可以長時間保存以供實驗研究與臨床應(yīng)用，但凍存過程中會造成部分細胞的損傷和丟失，因此如何最大限度地使造血細胞在凍存過程中免受損傷是最需要解決的課題。

為了防止細胞在冷凍過程中因細胞內(nèi)液冰晶形成、滲透壓改變、細胞結(jié)構(gòu)紊亂等導(dǎo)致細胞損傷，加人冷凍保護劑是必要的。選擇不同的冷凍保護劑及其濃度對hsl的保護是有影響的。二甲基亞礬能夠快速穿透細胞膜進人細胞中，降低冰點、延緩冷凍過程，使細胞有充足時間適應(yīng)降溫變化，同時提高胞內(nèi)離子濃度，減少胞內(nèi)冰晶形成從而減少細胞損傷。但臨床回輸用dmso凍存的hsc時出現(xiàn)高血壓、心律失常、胸悶、腹部不適等毒副作用.其發(fā)生率與dmsd的輸人量有關(guān)。于是人們開始尋找有效且毒副作用更小的冷凍保護劑?，F(xiàn)有技術(shù)用細胞內(nèi)冷凍保護劑5％dmso與細胞外冷序凍保護劑6％羥乙基淀粉hes冷凍保存外周血單個核細胞獲得了很好的回收率，顯示dmso/hes聯(lián)合應(yīng)用優(yōu)于dmso單用，但加果hes濃度過高會使細胞過度脫水、皺縮而造成損傷。在冷凍保護液中加人自體血漿或人血清白蛋白等對提高hsc的保存質(zhì)量很重要，但它們的作用機制還不十分明確，可能與維持細胞在凍融過程中的活力有關(guān)。最近有人研究在冷凍液中加人細胞因子如:gh4-csf,il-3.il-1等，對提高冷凍保存hsc的增殖潛力有一定作用。據(jù)報告在冷凍前用造血生長因子刺激千細胞、能有效提高凍存的hsc的增殖潛力，部分受冷凍損傷的hsc在一定條件下可恢復(fù)其增殖能力。

目前，干細胞凍存使用的凍存液有含血清和無血清的兩類，由于血清具有成分復(fù)雜、質(zhì)量不穩(wěn)定、價格昂貴等缺點，無血清凍存和復(fù)蘇技術(shù)成為發(fā)展趨勢。低溫保存干細胞主要依靠抗凍液二甲基亞砜(dmso)和血清的保護。常用到的細胞保護劑還有羥乙基淀粉、聚乙二醇(peg)等。但是，dmso會對細胞產(chǎn)生毒性作用，對凍存的干細胞造成不可逆的損傷。為獲得來源方便的造血干細胞，開展有效的造血干細胞凍存方法是本領(lǐng)域迫切的需求，建立一種長期低溫保存造血干細胞的方法對于促進造血干細胞的研宄和應(yīng)用具有重大意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種造血干細胞細胞凍存劑以及相應(yīng)的制備方法及使用方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種造血干細胞細胞凍存劑，其特征在于由如下各組分組成：谷氨酰胺20mg，表皮細胞生長因子300μg，0.2％w/v蔗糖，0.5％w/v低密度脂蛋白，0.5％w/v的海藻糖，0.5％w/v卵磷脂，多肽100ppmw/v，bfgf0.6％w/v，維生素e0.5％w/v，甘油2％v/v最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肽的序列如seqidno：1-3任一所示。所述多肽由申請人通過特異性針對造血干細胞進行的前期的大量的基因庫篩選得到，所述多肽具有保護造血干細胞免受損傷的功能。其名稱分別為

hscs-1：ftqnrcsyqqgssqgatlhpewiawir；

hscs-2：vweqylrrkrwrqcyekdhlsrhprhd；

hscs-3：tatinpyprsakwwkrwwspmwrycls。

在本發(fā)明的細胞的凍存液中，甘油和海藻糖以及維生素e和多肽具有明確的抵御外來傷害對細胞的損傷，特別是多肽，還具有保護細胞免受凍存時冰結(jié)晶對細胞的損傷，其余集中組分對于維持特異性的造血干細胞的生存是必須的。

本發(fā)明還提供了一種細胞的凍存液的制備方法，即將所述各組分混合搖勻即成。

本發(fā)明還提供了一種造血干細胞凍存方法，包括以下步驟:

a.凍存液制備:制備所述的細胞凍存液，將各組分按照常規(guī)的操作方法將各組分按照相應(yīng)的比例混合即可獲得；

b.細胞懸液制備:培養(yǎng)生長成單層的造血干細胞一瓶，0.25％胰蛋白酶液消化4分鐘，棄胰酶液，加入dmem培養(yǎng)液15ml，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，離心4000轉(zhuǎn)/分，棄上清，加入步驟a凍存液2ml，混均，置入無菌的凍存管內(nèi)；

c.冷凍:先將凍存管在4℃下凍存30min，然后放入-30℃凍存lh，再放入-80℃凍存3h，最后移入液氮中保存；

d.細胞復(fù)蘇:取出凍存管快速置于37℃水浴，震蕩直至細胞懸液完全融化，然后用5倍dmem液稀釋，1000r/min離心5min,離心去除上清液,再重復(fù)3次。所述細胞懸浮濃度為10⁸細胞/ml-10¹⁰細胞/ml。

本發(fā)明的有益效果:

本發(fā)明的細胞凍存液，復(fù)蘇細胞存活率可達98.0％以上，較使用常規(guī)細胞凍存液的復(fù)蘇存活率有了顯著提高，基本上沒有細胞的損耗。

本發(fā)明的造血干細胞凍存液可以長期保存造血干細胞，細胞活性不發(fā)生變化，保證了細胞生物學(xué)活性。

本發(fā)明神經(jīng)細胞凍存方法，操作簡單可行，價格適宜，具有較好的實用價值。

具體實施方式

實施例1

分別加入谷氨酰胺20mg，表皮細胞生長因子300μg，0.2％w/v蔗糖，0.5％w/v低密度脂蛋白，0.5％w/v的海藻糖，0.5％w/v卵磷脂，多肽100ppmw/v，bfgf0.6％w/v，維生素e0.5％w/v，甘油2％v/v最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肽的序列如seqidno：1所示。

實施例2

分別加入谷氨酰胺20mg，表皮細胞生長因子300μg，0.2％w/v蔗糖，0.5％w/v低密度脂蛋白，0.5％w/v的海藻糖，0.5％w/v卵磷脂，多肽100ppmw/v，bfgf0.6％w/v，維生素e0.5％w/v，甘油2％v/v最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肽的序列如seqidno：2所示。

實施例3

分別加入谷氨酰胺20mg，表皮細胞生長因子300μg，0.2％w/v蔗糖，0.5％w/v低密度脂蛋白，0.5％w/v的海藻糖，0.5％w/v卵磷脂，多肽100ppmw/v，bfgf0.6％w/v，維生素e0.5％w/v，甘油2％v/v最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肽的序列如seqidno：3所示。

比較例i

將dmso，1640無菌培養(yǎng)基和血液保存液i三者體積比例:10:5:5混合。

比較例ii

將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。

比較例iii

將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。

實施例3凍存液的效果驗證

以上實施例1-3及比較例i-iii所制備的細胞凍存液，分別按照下述方法進行細胞凍存和復(fù)蘇實驗。

細胞凍存過程:

培養(yǎng)生長成單層的造血干細胞，其細胞密度約6*10⁹個/ml，加入ph7.0的pbs洗細胞表面一次。

將細胞用0.25％胰蛋白酶液消化4分鐘，棄胰酶液，加入dmem培養(yǎng)液15ml，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，離心4000轉(zhuǎn)/分，棄上清，加入實施例1-3和比較例1所制備的凍存液2ml，混均，置入無菌的凍存管內(nèi)；

冷凍:先將凍存管在4℃下凍存30min，然后放入-30℃凍存lh，再放入-80℃凍存3h，最后移入液氮中保存；分別凍存1周，4個月，8個月。每組3個重復(fù)。

細胞復(fù)蘇:取出凍存管快速置于37℃水浴，震蕩直至細胞懸液完全融化，然后用5倍dmem液稀釋，1000r/min離心5min,離心去除上清液,再重復(fù)3次，計算細胞存活率。結(jié)果如下：

取8個月的凍存細胞，進行細胞分化培養(yǎng)，其中所述的造血干細胞能夠正常進行分化，分化效率達到98.5％，而比較例i-iii取出的細胞其分化率只能達到62.3％,60.0％，67.4％，這充分的說明細胞活性收到很大的影響。

實施例4特異性檢測

將實施例1的培養(yǎng)基，分別針對其他幾種干細胞：骨髓間充質(zhì)干細胞，神經(jīng)干細胞，脂肪干細胞進行采用實施例1的培養(yǎng)方式進行冷凍試驗，通過8個月的凍存試驗，發(fā)現(xiàn)，8個月之后的這幾種細胞存活率分別為88.3％，87.5％，80.2％，說明，本發(fā)明的冷凍劑可以特異性的培養(yǎng)造血干細胞。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受實施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

〈110〉陳印平

〈120〉一種造血干細胞細胞凍存劑

〈160〉3

〈210〉1

〈211〉27

〈212〉prt

〈213〉人工序列

〈400〉hscs-1

ftqnrcsyqqgssqgatlhpewiawir；

〈211〉27

〈212〉prt

〈213〉人工序列

〈400〉hscs-2

vweqylrrkrwrqcyekdhlsrhprhd；

〈211〉27

〈212〉prt

〈213〉人工序列

〈400〉hscs-3

tatinpyprsakwwkrwwspmwrycls；