本發(fā)明涉及一種黃芩的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，屬于生物繁殖
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：黃芩具有清熱解毒，鎮(zhèn)痛消炎等藥理作用，近年來研究表明，黃芩還具有較強的抗癌抗氧化、抗病毒抗hiv的作用，且生物安全性高等特點，使得黃芩的應(yīng)用和開發(fā)受到醫(yī)學界的關(guān)注，市場需求量逐年上升，野生資源遭到掠奪性破壞，雖有栽培，但是市場仍然供不應(yīng)求，加上黃芩種子出芽率低，繁殖速度慢，近年來，黃芩作為宿根花卉也逐漸用于園林綠化方面，如何快速有效繁殖黃芩成為目前制約其發(fā)展的重要因素之一。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了解決黃芩種子出芽率低，繁殖速度慢的問題，提供了一種黃芩的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，通過組織培養(yǎng)的方法，縮短黃芩的培養(yǎng)時間，使黃芩能夠快速、大規(guī)模繁殖緩解了市場上供不應(yīng)求的困境。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種黃芩的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，包括如下步驟：(1)無菌外植體的獲得：將野外采集健壯新鮮的黃芩的莖，經(jīng)多次漂洗后置于超凈工作臺紫外燈下照射處理10-25min，得到無菌外植體；(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)：將無菌外植體取莖段切除葉片，將莖節(jié)段切成1-2cm節(jié)段，保留一個節(jié)，每個莖段上帶有腋芽；將切好的莖節(jié)段接種到不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；首先暗培養(yǎng)3-5天，然后在20-25℃溫度下光培養(yǎng)25-30天；(3)增殖培養(yǎng)：將長出的叢生不定芽切下，切成小的叢生芽，接種到增殖培養(yǎng)基中，6-7天后，叢生芽基部長出新的叢生芽，25-30天轉(zhuǎn)接一次，將新的叢生芽接種到增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖培養(yǎng)；(4)生根培養(yǎng)：選取生長健壯，高度為3-5cm的叢生苗切成單株接種到生根培養(yǎng)基中，然后置于4-5℃環(huán)境暗期培養(yǎng)1-2天，然后置正常環(huán)境培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為白天20-25℃，夜間10-15℃，保持溫差5-10℃，光照為2000-3000lx，光照時間為10-12h，待無菌苗下部長出根；(5)煉苗與移栽：將步驟(4)中健壯的，葉片較多，根系壯的，根系長度大于2cm的無菌苗進行煉苗；在組培室擰松瓶蓋2-3天后打開瓶蓋3-4天，使其逐漸適應(yīng)環(huán)境，并用注射器澆灌；6-7天后清洗干凈根部的培養(yǎng)基，移栽入營養(yǎng)缽，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7天，光強為2000-3000lx，照射10-12h，溫度為15-25℃；然后將其移至大棚內(nèi)，遮陰。進一步的，所述步驟(1)中漂洗前用自來水沖洗2-3h；在滅菌燒杯中用70-75％的乙醇漂洗15-45s、無菌水漂洗4-6次、0.1％氯化汞消毒4-8min、再用無菌水漂洗4-6次后，將消毒并漂洗多次后的黃芩莖全部浸泡在無菌水中，用無菌濾紙吸干多余水分。進一步的，所述步驟(2)中的光培養(yǎng)條件為：光照強度為2000-3000lx，光照時間為10-12h。進一步的，所述步驟(2)中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+1-3mg/lba+0.1-0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph為5.8。進一步的，所述步驟(3)中的增殖培養(yǎng)基為ms+0-0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph為5.8。進一步的，所述步驟(4)中的生根培養(yǎng)基為1/2ms+0.5-1mg/liaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph為5.8。進一步的，所述步驟(3)中增殖培養(yǎng)條件為：白天20-25℃，夜間10-15℃，保持溫差5-10℃，光照為2000-3000lx，光照時間為10-12h。步驟(1)中無菌外植體的獲得時采用紫外線照射處理誘導(dǎo)的不定芽明顯粗壯，且腋芽數(shù)量多；經(jīng)過紫外照射處理的平均誘導(dǎo)率為62.37％，而不經(jīng)紫外照射處理的平均誘導(dǎo)率僅為39.5％；步驟(2)中經(jīng)過暗培養(yǎng)的處理明顯高了黃芩不定芽的誘導(dǎo)率，且不定芽芽點明顯是不進行暗培養(yǎng)對照組的1.5倍以上；步驟(3)中切成叢生不定芽接種增殖效果比切單株培養(yǎng)的增殖效果提高了1.5倍以上，其原因是小的叢生芽基部能完好的保留未完全分化或已分化的小的芽原基，而切成單株破壞了基部還未完全分化的芽原基；步驟(3)中適度的溫差促進有機物質(zhì)的積累，促進植物的生長；步驟(5)中適當?shù)臄Q松瓶蓋2-3天后打開瓶蓋3-4天，使得植物與外界環(huán)境逐漸適應(yīng)，起到過渡期的作用，有效的提高了黃芩小苗移栽的成活率，最高能達到98.5％。本發(fā)明發(fā)方法簡單，步驟易于操作，能夠克服黃芩出芽率低、繁殖速度慢的缺點，通過組織培養(yǎng)的方法，建立黃芩組織培養(yǎng)體系，有效提高繁殖系數(shù)，促進生長，提高黃芩的繁殖力度。具體實施方式下面將結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進一步的說明。實施例一：一種黃芩的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，包括如下步驟：(1)無菌外植體的獲得：將野外采集的健壯新鮮的黃芩的莖，完全浸入水中，用自來水沖洗2h；取出后置于超凈工作臺上，取滅菌過的燒杯將幼苗放入，用75％的乙醇漂洗15s、無菌水漂洗4次、0.1％氯化汞消毒4min、再用無菌水漂洗4次后，用無菌濾紙吸干多余水分后，獲得無菌外植體進行接種；(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)：將處理好的無菌外植體，取莖段，切除葉片，將莖節(jié)段切成1cm節(jié)段，保留一個節(jié)，每個莖段上帶有腋芽；將切好的莖節(jié)段接種到不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ms+1mg/lba+0.1mg/lnaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph5.8，誘導(dǎo)條件為20℃光培養(yǎng)，光照為2000lx，光照時間為12h，培養(yǎng)30天；(3)增殖培養(yǎng)：將長出的叢生不定芽切下，切成小的叢生芽，接種到增殖培養(yǎng)基中，6天后叢生芽基部會長出很多叢生芽，30天轉(zhuǎn)接一次，將新的叢生芽接種到增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖培養(yǎng)；增殖培養(yǎng)基為：ms+1mg/lnaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph5.8；培養(yǎng)條件為20℃光培養(yǎng)，光照為2000lx，光照時間為12h；(4)生根培養(yǎng)：選取生長健壯，高度在3cm的叢生苗切成單株接種到生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基為1/2ms+0.5mg/liba+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph5.8，25d后，無菌苗下部長出根，主根長度4cm。(5)煉苗與移栽：將健壯的，葉片較多，根系壯且根系長度大于2cm的無菌苗進行煉苗；在組培室擰松瓶蓋3天后打開瓶蓋3天，使其逐漸適應(yīng)環(huán)境，期間適當用注射器澆灌少量水；6天后清洗干凈根部的培養(yǎng)基，移栽入營養(yǎng)缽，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天，光強為3000lx，照射10h，溫度為15℃；之后將其移至大棚內(nèi)，適當遮陰。實施例二：一種黃芩的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，包括如下步驟：(1)無菌外植體的獲得：將野外采集的健壯新鮮的黃芩的莖，完全浸入水中，用自來水沖洗3h；取出放入盤子置于超凈工作臺上，取滅菌過的燒杯將幼苗放入，用70％的乙醇漂洗30s、無菌水漂洗5次、0.1％氯化汞消毒6min、再用無菌水漂洗5次后，用無菌濾紙吸干多余水分后，獲得無菌外植體進行接種。(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)：將處理好的無菌外植體，取莖段，切除葉片，將莖節(jié)段切成2cm節(jié)段，保留一個節(jié)，每個莖段上帶有腋芽；將切好的莖節(jié)段接種到不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ms+2mg/lba+0.1mg/lnaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph5.8，誘導(dǎo)條件為25℃光培養(yǎng)，光照為2500lx，光照時間為12h，培養(yǎng)25天。(3)增殖培養(yǎng)：將長出的叢生不定芽切下，切成小的叢生芽，接種到增殖培養(yǎng)基中，一周以后，叢生芽基部會長出很多叢生芽，25天轉(zhuǎn)接一次，將新的叢生芽接種到增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖培養(yǎng)；增殖培養(yǎng)基為：ms+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph5.8；培養(yǎng)條件為25℃光培養(yǎng)，光照為2500lx，光照時間為12h。(4)生根培養(yǎng)：選生長健壯，高度在4cm左右的叢生苗切成單株接種到生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基為1/2ms+0.5mg/liaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph5.8，25天后，無菌苗下部長出根，主根長度5cm。(5)煉苗與移栽：取健壯的，葉片較多，根系壯且根系長度大于4cm的無菌苗進行煉苗；在組培室擰松瓶蓋2天后打開瓶蓋4天，使其逐漸適應(yīng)環(huán)境，期間可以適當用注射器澆灌少量水；7天后清洗干凈根部的培養(yǎng)基，移栽入營養(yǎng)缽，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)6天，光強為3000lx，照射12h，溫度為20℃；之后將其移至大棚內(nèi)，適當遮陰。實施例三：一種黃芩的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，包括如下步驟：(1)無菌外植體的獲得：將野外采集的健壯新鮮的黃芩的莖，完全浸入水中，用自來水沖洗2h；取出放入盤子置于超凈工作臺上，取滅菌過的燒杯將幼苗放入，用75％的乙醇漂洗45s、無菌水漂洗6次、0.1％氯化汞消毒8min、再用無菌水漂洗6次后，用無菌濾紙吸干多余水分后，獲得無菌外植體進行接種。(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)：將處理好的無菌外植體，取莖段，切除葉片，將莖節(jié)段切成2cm節(jié)段，保留一個節(jié)，每個莖段上帶有腋芽；將切好的莖節(jié)段接種到不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ms+3mg/lba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph5.8，誘導(dǎo)條件為25℃光培養(yǎng)，光照為3000lx，光照時間為12h，培養(yǎng)30天。(3)增殖培養(yǎng)：將長出的叢生不定芽切下，切成小的叢生芽，接種到增殖培養(yǎng)基中，一周以后，叢生芽基部會長出很多叢生芽，30天轉(zhuǎn)接一次，將新的叢生芽接種到增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖培養(yǎng)；增殖培養(yǎng)基為：ms+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph5.8；培養(yǎng)條件為5℃光培養(yǎng)，光照為3000lx，光照時間為12h。(4)生根培養(yǎng)：選生長健壯，高度在5cm左右的叢生苗切成單株接種到生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基為1/2ms+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph5.8，25天后，無菌苗下部長出根，主根長度4.2cm。(5)煉苗與移栽：選生長健壯的，葉片較多，根系壯且根系長度大于3cm的無菌苗進行煉苗；在組培室擰松瓶蓋3天后打開瓶蓋4天，使其逐漸適應(yīng)環(huán)境，期間可以適當用注射器澆灌少量水；7天后清洗干凈根部的培養(yǎng)基，移栽入營養(yǎng)缽，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，光強為3000lx，照射12h，溫度為25℃；之后將其移至大棚內(nèi)，適當遮陰。不同濃度的誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基對黃芩的組織培養(yǎng)過程中具有不同的影響，具體見表1-表3。表1為誘導(dǎo)培養(yǎng)基對黃芩不定芽的誘導(dǎo)作用由表1可知，當誘導(dǎo)培養(yǎng)基中ba含量為1-3mg/l且naa含量為0.1-0.5mg/l時對黃芩不定芽的誘導(dǎo)作用最佳。表2為不同濃度增殖培養(yǎng)基對黃芩無菌苗增殖的影響處理基本培養(yǎng)基naa(mg/l)生長情況1ms0不定芽生長健壯，基部新鮮2ms0.25不定芽生長健壯，基部有少許老化3ms0.5不定芽生長較為健壯，基部組織較多老化4ms0.75不定芽較為細弱，基部組織較多老化5ms1不定芽生長細弱，基部老化嚴重由表2可知，當naa濃度為0.1-0.5mg/l時，黃芩無菌苗的不定芽生長健壯，當不添加naa或是naa濃度達到0.75mg/l以上時，不定芽生長細弱，基部組織老化現(xiàn)象逐漸嚴重。表3為生根培養(yǎng)基對黃芩無菌苗生根誘導(dǎo)的影響由表3可知，生根培養(yǎng)基為1/2ms+0.5-1mg/liaa時對黃芩無菌苗生根的誘導(dǎo)效果最佳，此時黃芩無菌苗根長，粗壯、岔根少，生長旺盛，地上部分新鮮。表4所示為，增殖培養(yǎng)時采用不同接種類型且培養(yǎng)溫差不同對增殖系數(shù)的影響。表4由表4可知，選用叢生芽為接種對象，且培養(yǎng)溫差為5-10℃的條件下平均增殖系數(shù)最大為9.34，采用單株時同樣溫差情況下，平均增殖系數(shù)僅為5.95。表5為生根培養(yǎng)過程中不同暗期培養(yǎng)和不同晝夜溫差對黃芩生根率的影響，表5由表5可知，生根培養(yǎng)過程中經(jīng)過1-2天的暗期培養(yǎng)后保持溫差為5-10℃能使得黃芩的生根率達到85％以上，當暗期培養(yǎng)1天，溫差為5℃時生根率最高能達到98.9％。表6為煉苗與移栽過程中擰松瓶蓋打開瓶蓋使幼苗適應(yīng)外界環(huán)境對移栽成活率的影響。表6由表6可知，適當?shù)臄Q松瓶蓋3-4d，使得植物與外界環(huán)境逐漸適應(yīng)，起到過渡期的作用，有效的提高了黃芩小苗移栽的成活率，最高能達到98.5％。當前第1頁12