本發(fā)明屬于林木組培
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種檉柳的工業(yè)化組培快繁技術(shù)，尤其是涉及可用于多種檉柳的規(guī)模化育苗生產(chǎn)技術(shù)。
背景技術(shù)：
：經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展給自然環(huán)境造成了嚴(yán)重的影響，全世界范圍內(nèi)的鹽漬土壤超過8億多公頃(munnsandtester,2008)，約占世界總面積的6.5％。在我國(guó)鹽堿土總面積約為3.6×107hm2，占全國(guó)可利用土地面積的4.88％，是我國(guó)農(nóng)業(yè)、城市綠化和生態(tài)建設(shè)的主要限制因子之一。檉柳屬(tamarixl.)植物為石竹目(caryophyllales)檉柳科(tamaricaceae)灌木或小喬木，檉柳屬植物在全世界分布廣泛,主要生長(zhǎng)在溫帶和亞熱帶的干旱、半干旱、草原及鹽堿地帶。黃河入?？冢脖簧鷳B(tài)系統(tǒng)脆弱，土壤含鹽高，而檉柳在土壤含鹽量0.5％-1.0％的地段上能正常生長(zhǎng)，被稱為鹽堿地造林綠化的先鋒植物，從選樹適地原則，檉柳是黃河三角洲鹽堿地造林綠化和生態(tài)建設(shè)的首選樹種。檉柳屬樹種常用的繁殖方法有播種育苗、扦插育苗、組織培養(yǎng)育苗等。相較而言，植物組織培養(yǎng)不僅可以快速大量地進(jìn)行個(gè)體繁殖，又能較好地保持植物本身的遺傳特性，而且不受氣候等環(huán)境因素影響，有利于實(shí)現(xiàn)檉柳工廠化育苗、加快其推廣應(yīng)用?，F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)報(bào)道了多項(xiàng)檉柳的組培研究。如程磊(2001)首先建立了中國(guó)檉柳(tamarixchinensislour)一步成苗的組培技術(shù)，在激素kt的誘導(dǎo)下得到了完整植株，但未進(jìn)行移栽實(shí)驗(yàn)(程磊和周根余,2001)。喬夢(mèng)吉等(2007)將短穗檉柳扦插盆栽苗當(dāng)年抽出的新嫩枝條作為外植體材料獲得無菌苗后進(jìn)行檉柳組培擴(kuò)繁實(shí)驗(yàn)，待生根組培苗長(zhǎng)到4-5cm高時(shí)，煉苗2-3d，移栽入營(yíng)養(yǎng)土中，覆膜培養(yǎng)15天后煉苗成活率為75％(喬夢(mèng)吉等,2007)。韋小敏等(2006,2007)分別以檉柳(tamarixchinensislour)叢生芽產(chǎn)生的組培苗和嫩莖產(chǎn)生的組培苗進(jìn)行煉苗移栽，由叢生芽產(chǎn)生的組培苗移栽成活率較低，僅為50％，嫩莖產(chǎn)生的組培苗移栽成活率為80％(韋小敏等,2006；韋小敏等,2007)。韓琳娜等(2009,2010)以來自黃河三角洲的檉柳(tamarixchinensislour)的嫩芽作為外植體進(jìn)行組培擴(kuò)繁，發(fā)現(xiàn)取材部位和時(shí)間對(duì)外植體的分化誘導(dǎo)率具有明顯的影響，后來又進(jìn)行了一步成苗最佳培養(yǎng)基的篩選，最佳培養(yǎng)基為ms+1.00mg/l6-ba+0.05mg/lnaa，煉苗成活率可達(dá)82.7％(韓琳娜等,2009；韓琳娜和周鳳琴,2010)。楊立文等(2013)以短枝檉柳幼嫩莖段為外植體獲得的組培苗煉苗后的移栽成活率為83％(楊立文等,2013)。劉振林等(2013)以白花檉柳的莖段為外植體材料，進(jìn)行了由愈傷組織誘導(dǎo)到叢生芽的誘導(dǎo)和直接進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)兩條途徑的快繁實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)直接誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽的效果最好，出芽率達(dá)98.68％，生根率為93％，煉苗后的移栽成活率為80％(劉振林等,2013)。專利文獻(xiàn)cn104542294a公開了一種檉柳組培苗生根的方法，通過添加活性炭?jī)?yōu)化培養(yǎng)基，減少檉柳外植體褐化現(xiàn)象縮短培養(yǎng)周期。專利文獻(xiàn)cn105052738a公開了一種檉柳組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，利用中國(guó)檉柳外植體通過次氯酸消毒、新型的繼代培養(yǎng)及和生根培養(yǎng)基培養(yǎng)，煉苗移栽成活率達(dá)96％以上。雖然檉柳的組織培養(yǎng)取得了一定的進(jìn)展，但大多仍處在實(shí)驗(yàn)室階段，并且現(xiàn)有研究均只是針對(duì)檉柳屬的一種進(jìn)行各項(xiàng)條件的優(yōu)化并組培體系的建立，無法實(shí)現(xiàn)多種檉柳的統(tǒng)一的工廠化育苗，難以大規(guī)模推廣應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)及存在的問題，本發(fā)明針對(duì)多種檉柳進(jìn)行組培研究，以期發(fā)現(xiàn)規(guī)律，建立適宜用于多種檉柳的規(guī)模化育苗生產(chǎn)技術(shù)。本發(fā)明的目的在于提供一種用于多種檉柳的組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，簡(jiǎn)化工廠化育苗時(shí)不同種類檉柳的多條件多組培體系選擇、降低生產(chǎn)和選擇成本，并可以同步實(shí)現(xiàn)多種檉柳的統(tǒng)一的工廠化(流水線型)培養(yǎng)育苗。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，具體的，本發(fā)明涉及以下技術(shù)方案：一種用于多種檉柳的組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，所述方法包括如下步驟：(1)外植體：扦插盆栽苗抽出的新嫩枝條為外植體；(2)外植體的消毒：選用75％c2h5oh和0.1％hgcl2，消毒時(shí)間分別為30s、9min；(3)增殖培養(yǎng)：消毒培養(yǎng)后的無菌苗，ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加6-ba和naa進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)45天；(4)壯苗培養(yǎng)：將檉柳增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的叢生苗轉(zhuǎn)入ms培養(yǎng)基進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，培養(yǎng)20天；(5)生根培養(yǎng)：經(jīng)壯苗長(zhǎng)高后的組培苗，剪成小段，采用無激素ms培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)20天；(6)煉苗移栽：煉苗基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)土添加一定比例的沙子(營(yíng)養(yǎng)土：沙子＝10：1)；煉苗時(shí)首先將組培瓶上封口膜松動(dòng)但不打開，在溫度為22±1℃，光強(qiáng)度800±100μmol·m–2·s–1的組培室進(jìn)行煉苗2天，再將組培瓶的封口膜上輕輕打開少許縫隙后煉苗2天，接著將封口膜打開后蓋在組培瓶上煉苗2天后進(jìn)行移栽；移栽的前一天用多菌靈對(duì)移栽基質(zhì)進(jìn)行消毒，移栽時(shí)選擇根長(zhǎng)為1.5-2cm、生根條數(shù)為2-3條、生長(zhǎng)健壯的組培苗進(jìn)行移栽，移栽時(shí)將組培苗從培養(yǎng)基中取出，用清水將根部的培養(yǎng)基清洗干凈，用多菌靈溶液浸泡根部15s，移栽到盛有滅過菌的基質(zhì)中，移栽后覆膜培養(yǎng)，早晚噴水，一周后，覆蓋膜打開少許，繼續(xù)培養(yǎng)一周后，揭膜培養(yǎng)，保持土壤濕潤(rùn)，培養(yǎng)30天移栽到大田。上述方法適用于多種檉柳的組織培養(yǎng)，尤其適用于甘蒙檉柳(tamarixchinensisnakai)、紅花多枝檉柳(tamarixhohenackeribunge)、中國(guó)檉柳(tamarixchinensislour.)的組織培養(yǎng)。本發(fā)明取得了以下有益效果：(1)本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了多種檉柳的統(tǒng)一化組培快繁育苗，實(shí)現(xiàn)了“啟動(dòng)率高、叢生芽多、成活率高和繁殖系數(shù)高”的效果，為檉柳的工業(yè)化育苗提供了極大的便利和技術(shù)支持，可以實(shí)現(xiàn)多種檉柳的快速育苗培育。(2)本發(fā)明在基于統(tǒng)一化組培條件的同時(shí)，針對(duì)組培育苗的幾個(gè)重要節(jié)點(diǎn)進(jìn)行把控，包括啟動(dòng)率、莖段叢生芽的數(shù)量、生根率、生根條數(shù)、生根根長(zhǎng)、煉苗條件及成活率，最終獲得了一致性的較高的煉苗成活率，具體為甘蒙檉柳、中國(guó)檉柳和紅花多枝檉柳的啟動(dòng)率分別為100％、87.5％和87.5％，每個(gè)莖段叢生芽的數(shù)量分別為37.25個(gè)、47.25個(gè)和34.5個(gè)，移栽煉苗取得了最高的成活率，甘蒙檉柳為88.33％，中國(guó)檉柳為91.67％，紅花多枝檉柳為93.33％，非常適于工業(yè)化育苗生產(chǎn)。附圖說明圖1甘蒙檉柳組培快繁體系結(jié)果，a甘蒙檉柳在ms培養(yǎng)基壯苗培養(yǎng)15后的甘蒙檉柳；b甘蒙檉柳試管苗移栽后生長(zhǎng)情況；c甘蒙檉柳組培苗的生根情況(從左往右依次為iba、kt和ms)圖2甘蒙檉柳試管苗移栽后成活率，sand表示沙子，nutrientsoil為營(yíng)養(yǎng)土+1/10沙子。圖3紅花多枝檉柳組培快繁體系結(jié)果，a紅花多枝檉柳在ms培養(yǎng)基壯苗培養(yǎng)15后的生長(zhǎng)情況；b紅花多枝檉柳試管苗移栽后生長(zhǎng)情況；c紅花多枝檉柳組培苗的生根情況(從左往右依次為iba、kt和ms)。圖4中國(guó)檉柳組培快繁體系結(jié)果圖，a中國(guó)檉柳在ms培養(yǎng)基壯苗培養(yǎng)15后的生長(zhǎng)情況；b中國(guó)檉柳試管苗移栽后生長(zhǎng)情況；c中國(guó)檉柳組培苗的生根情況(從左往右依次為iba、kt和ms)。圖5三種檉柳工業(yè)化育苗結(jié)果。具體實(shí)施方式應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是示例性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。需要注意的是，這里所使用的術(shù)語(yǔ)僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語(yǔ)“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作和/或它們的組合。甘蒙檉柳(tamarixchinensisnakai)隸屬于石竹目(caryophyllales)檉柳科(tamarcaceae)檉柳屬(tamarix)，灌木或喬木，樹干和老枝栗紅色，枝直立，葉灰藍(lán)綠色；綠色嫩枝上的葉長(zhǎng)圓形或長(zhǎng)圓狀披針形，漸尖，基部亦向外鼓脹。甘蒙檉柳是我國(guó)北方沿海城市及內(nèi)地鹽漬化地區(qū)的城市綠化和鹽堿地合理開發(fā)利用優(yōu)良樹種紅花多枝檉柳(tamarixhohenackeribunge)為泌鹽鹽生植物，將土壤中的鹽分吸收到體內(nèi)后通過鹽腺排出體外，從而避免鹽害，該樹種為落葉小喬木或灌木，耐修剪，具有很高的觀賞價(jià)值，該樹種壽命長(zhǎng)，萌芽力強(qiáng)、生長(zhǎng)量大，基部平茬后具有很強(qiáng)的萌芽力。紅花多枝檉柳的花色為紅色，花開艷麗，枝繁葉茂，植物體內(nèi)富含單寧，具有抗蟲能力，非常適合在鹽堿地園林綠化中應(yīng)用。中國(guó)檉柳(tamarixchinensislour.)原產(chǎn)于中國(guó)，其拉丁文的意思是在中國(guó)分布。為落葉小喬木或灌木，在我國(guó)廣泛分布，原產(chǎn)于山東、遼寧、河北、河南、江蘇(北部)等省，主要生長(zhǎng)在河流沖積的平原、潮濕鹽堿地、海濱、沙荒地和灘頭，其枝、葉、花具有極高的觀賞價(jià)值，耐鹽堿、干旱和水濕，適應(yīng)性極強(qiáng)，其花色為粉紅、粉白或淡白，花期較長(zhǎng)。誠(chéng)如
背景技術(shù)：
中所述，檉柳的組培快繁技術(shù)大多仍處在實(shí)驗(yàn)室階段，實(shí)現(xiàn)移栽的成活率并不高；并且現(xiàn)有研究均只是針對(duì)檉柳屬的一種進(jìn)行各項(xiàng)條件的優(yōu)化并組培體系的建立，在實(shí)際工業(yè)化育苗過程中面臨著諸多問題(如培養(yǎng)條件的不統(tǒng)一，在面臨多種檉柳培育時(shí)組培條件極難協(xié)調(diào)、煉苗條件不具體難以掌握、成活率低等)，導(dǎo)致實(shí)際應(yīng)用中無法實(shí)現(xiàn)多種檉柳的統(tǒng)一的規(guī)?；S育苗。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于多種檉柳的組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，所述方法包括如下步驟：(1)外植體：扦插盆栽苗抽出的新嫩枝條為外植體；(2)外植體的消毒：選用75％c2h5oh和0.1％hgcl2，消毒時(shí)間分別為30s、9min；(3)增殖培養(yǎng)：消毒培養(yǎng)后的無菌苗，ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加6-ba和naa進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)40-50天；(4)壯苗培養(yǎng)：將檉柳增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的叢生苗轉(zhuǎn)入ms培養(yǎng)基進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，培養(yǎng)15-25天；(5)生根培養(yǎng)：經(jīng)壯苗長(zhǎng)高后的組培苗，剪成小段，采用無激素ms培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)15-25天；(6)煉苗移栽：煉苗基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)土添加一定比例的沙子(營(yíng)養(yǎng)土：沙子＝10：1)；煉苗時(shí)首先將組培瓶上封口膜松動(dòng)但不打開，在溫度為22±1℃，光強(qiáng)度800±100μmol·m–2·s–1的組培室進(jìn)行煉苗2天，再將組培瓶的封口膜上輕輕打開少許縫隙后煉苗2天，接著將封口膜打開后蓋在組培瓶上煉苗2天后進(jìn)行移栽；移栽的前一天用多菌靈對(duì)移栽基質(zhì)進(jìn)行消毒，移栽時(shí)選擇根長(zhǎng)為1.5-2cm、生根條數(shù)為2-3條、生長(zhǎng)健壯的組培苗進(jìn)行移栽，移栽時(shí)將組培苗從培養(yǎng)基中取出，用清水將根部的培養(yǎng)基清洗干凈，用多菌靈溶液浸泡根部15s，移栽到盛有滅過菌的基質(zhì)中，移栽后覆膜培養(yǎng)，早晚噴水，一周后，覆蓋膜打開少許，繼續(xù)培養(yǎng)一周后，揭膜培養(yǎng)，保持土壤濕潤(rùn)，培養(yǎng)30天移栽到大田。本發(fā)明所述步驟(3)-(5)中，組培苗培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度白天25±1℃，夜晚18±1℃，光照強(qiáng)度為200±100μmol·m–2·s–1，光照12-14h，黑暗10-12h。上述方法適用于多種檉柳的組織培養(yǎng)，尤其適用于甘蒙檉柳(tamarixchinensisnakai)、紅花多枝檉柳(tamarixhohenackeribunge)、中國(guó)檉柳(tamarixchinensislour.)的組織培養(yǎng)。上述方法步驟(1)中，外植體需選用扦插盆栽苗抽出的新嫩枝條，老枝條的外植體組培過程中生長(zhǎng)較慢、并且褐化現(xiàn)象較為嚴(yán)重，對(duì)啟動(dòng)率較低、叢生芽數(shù)較少。上述方法步驟(2)中，本發(fā)明選用75％c2h5oh30s和0.1％hgcl29min，的消毒方式，在消毒的選擇過程中除考慮外植體的污染率和存活率外，還著重考察了消毒方式對(duì)于后續(xù)生根率的影響。本發(fā)明減少消毒次數(shù)、相應(yīng)延長(zhǎng)消毒時(shí)間，保證了消毒效果，并減少了對(duì)后續(xù)生根率的影響。具體的實(shí)施方式中，消毒過程中，以ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，首先對(duì)剪取的檉柳嫩枝條進(jìn)行清洗，加洗潔凈，從下往上用棉花清洗，清洗干凈后用流動(dòng)的自來水沖洗，再把檉柳嫩枝條每段剪成3-4cm，用流動(dòng)的水沖洗30min后拿到超凈工作臺(tái)。在超凈工作臺(tái)，先用無菌水沖洗三遍，然后用75％的酒精浸泡30s，再用0.1％升汞浸泡9min，接著用無菌水沖洗4-5次。把外植體放到含有4-5張濾紙的培養(yǎng)皿中，吸干外植體表面的水。剪去莖段上下各5mm的部分(防止酒精、氯化汞的毒害)，下端剪成斜面，插到ms培養(yǎng)基中。上述方法步驟(3)中，本發(fā)明增殖培養(yǎng)最終選用6-ba和naa。雖然現(xiàn)有報(bào)道的可用于檉柳組培的激素有多種(包括naa、6-ba、kt、ga、iaa、iba等)，但發(fā)明人前期通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，6-ba和naa的組合的通用性最優(yōu)，兩者組合可以滿足多種檉柳外植體有效啟動(dòng)和產(chǎn)生叢生芽的需求(適用于不同檉柳時(shí)，僅需通過簡(jiǎn)單調(diào)節(jié)即可實(shí)現(xiàn))；但針對(duì)不同檉柳，最優(yōu)的啟動(dòng)率和誘導(dǎo)叢生芽的具體濃度有所不同，針對(duì)不同檉柳，6-ba和naa的最優(yōu)濃度通過交互實(shí)驗(yàn)可以獲得。如針對(duì)甘蒙檉柳的最適增殖培養(yǎng)基為ms+6-ba2.0mg/l+naa0.5mg/l，啟動(dòng)率為100％，每個(gè)莖段叢生芽的數(shù)量分別為37.25個(gè)；針對(duì)中國(guó)檉柳的最適增殖培養(yǎng)基分別為ms+6-ba1.5mg/l+naa0.7mg/l，啟動(dòng)率為87.5％，每個(gè)莖段叢生芽的數(shù)量分別為47.25個(gè)；針對(duì)紅花多枝檉柳的最適增殖培養(yǎng)基為ms+6-ba1.5mg/l+naa0.7mg/l，啟動(dòng)率為87.5％，每個(gè)莖段叢生芽的數(shù)量為34.5個(gè)。優(yōu)選的實(shí)施方式中，增殖培養(yǎng)45天。上述方法步驟(4)中，本發(fā)明采用ms培養(yǎng)基進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，壯苗培養(yǎng)過程中，將整個(gè)叢生苗(一簇)放在ms上進(jìn)行壯苗；若不進(jìn)行壯苗，叢生芽容易分散，并且叢生芽特別脆弱，含水量較高，剪成小段進(jìn)行生根培養(yǎng)時(shí)，極易黃化死掉。進(jìn)行壯苗培養(yǎng)是本發(fā)明檉柳的組織培養(yǎng)快速繁殖體系的重要關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。此外，本發(fā)明中采用ms培養(yǎng)基進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其與1/2ms相比，養(yǎng)分的數(shù)量更高，不僅抑制了過度叢生現(xiàn)象、使其長(zhǎng)高，而且極為有效的增強(qiáng)了叢生芽的強(qiáng)度，保證了生根和煉苗移栽的成功率。發(fā)明人甚至發(fā)現(xiàn)，在ms培養(yǎng)基壯苗培養(yǎng)過程中，紅花多枝檉柳出現(xiàn)部分木質(zhì)化現(xiàn)象。上述方法步驟(5)中，所述無激素培養(yǎng)基優(yōu)選為ms培養(yǎng)基或1/2ms；更為優(yōu)選的是ms培養(yǎng)基。本發(fā)明過程中，延續(xù)步驟(4)中使用相同的培養(yǎng)基，不僅不影響壯苗后叢生苗的生根率，而且生根條數(shù)和根長(zhǎng)都有顯著提升，發(fā)明人分析認(rèn)為1/2ms使用一般情況下更有利于生根(生根率高，但差異不顯著)，但對(duì)于生根的質(zhì)量(生根條數(shù)和根長(zhǎng))則不如ms培養(yǎng)基。優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(4)(5)中各培養(yǎng)20天。上述方法步驟(6)中，煉苗條件是本發(fā)明控制多種檉柳高煉苗成活率的又一關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本發(fā)明所述煉苗基質(zhì)選用營(yíng)養(yǎng)土添加1/10的沙子。相較其他基質(zhì)而言，本發(fā)明選用營(yíng)養(yǎng)土作為主要煉苗基質(zhì)，不僅具有良好的保肥性、持水性和透氣性以及適合根系生長(zhǎng)的ph值，而且養(yǎng)分均衡、充足，更適宜生根苗的恢復(fù)生長(zhǎng)。此外，本發(fā)明煉苗過程中，除考慮溫度、濕度的調(diào)節(jié)外，還對(duì)光照射條件進(jìn)行了分析，由于本發(fā)明所述方法步驟(1)-(5)的執(zhí)行，組培苗具有極好的生理狀況，可以接受較高光強(qiáng)度(光強(qiáng)度800±100μmol·m–2·s–1)的照射，并且促進(jìn)組培苗的快速生長(zhǎng)，相較于遮光煉苗條件，煉苗后苗木的根系、移栽大田前苗木圍徑都明顯提高，相應(yīng)的成活率提高。營(yíng)養(yǎng)土：又稱有機(jī)育苗基質(zhì)，有機(jī)質(zhì)含量為45％，ph為中性，富含微量元素，具體本發(fā)明實(shí)施例中示例性的采用濟(jì)南佰倍增生物科技有限公司銷售的營(yíng)養(yǎng)土。實(shí)施例1檉柳外植體消毒體系實(shí)驗(yàn)材料：三種檉柳中國(guó)檉柳(tamarixchinensislour.)、甘蒙檉柳(tamarixaustromongolicanakai)、紅花多枝檉柳(tamarixgallicabunge)插穗于2016年5月份采自東營(yíng)。檉柳扦插盆栽苗抽出的新嫩枝條為外植體。針對(duì)中國(guó)檉柳，選用75％c2h5oh(s)和0.1％hgcl2(min)，采用雙因素三水平正交l9(32)(如表1所示)，以ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，首先對(duì)剪取的檉柳嫩枝條進(jìn)行清洗，加洗潔凈，從下往上用棉花清洗，清洗干凈后用流動(dòng)的自來水沖洗，再把檉柳嫩枝條每段剪成3-4cm，用流動(dòng)的水沖洗30min后拿到超凈工作臺(tái)。在超凈工作臺(tái)，先用無菌水沖洗三遍，然后用75％的酒精浸泡一定時(shí)間，再用0.1％升汞浸泡一定時(shí)間，接著用無菌水沖洗4-5次。把外植體放到含有4-5張濾紙的培養(yǎng)皿中，吸干外植體表面的水。剪去莖段上下各5mm的部分(防止酒精、氯化汞的毒害)，下端剪成斜面，插到ms培養(yǎng)基中。用75％酒精與0.1％升汞采用不同處理組合對(duì)外植體滅菌。消毒處理結(jié)果如表2所示表1中國(guó)檉柳外植體消毒體系實(shí)驗(yàn)組表2中國(guó)檉柳酒精和升汞不同消毒時(shí)間對(duì)檉柳生長(zhǎng)的影響75％酒精(s)0.1％升汞(min)污染率(％)生根率(％)存活率(％)20635.42d87.50c64.44a20925.00cde79.86bc71.11cd201221.67abc68.75ab77.78de30633.33de87.50c66.11ab30916.67abc79.86bc83.33e301216.67abc70.80ab81.11e40622.92bcd75.00abc75.00cd40911.67ab72.50ab72.22cd401210.00d62.50a62.78a表中數(shù)據(jù)是3個(gè)重復(fù)的平均值。不同字母表示在p＝0.05水平上差異顯著。經(jīng)試驗(yàn)，中國(guó)檉柳消毒體系選用75％c2h5oh(s)和0.1％hgcl2(min)，消毒時(shí)間分別為30s、9min，消毒效果：存活率為83.33％，污染率為16.67％。甘蒙檉柳和紅花多枝檉柳的外植體消毒體系也采用75％c2h5oh30s和0.1％hgcl29min，的消毒方式，生根率在85％以上，污染率控制在20％以下，存活率均高于80％。實(shí)施例2甘蒙檉柳組培快繁體系2.1實(shí)驗(yàn)方法(1)外植體：采用甘蒙檉柳扦插盆栽苗抽出的新嫩枝條為外植體。(2)消毒體系：選用75％c2h5oh(s)和0.1％hgcl2(min)，消毒時(shí)間分別為30s、9min。(3)增殖培養(yǎng)：消毒培養(yǎng)后的無菌苗，ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，選用激素為6-ba和naa，設(shè)置5×3的交互實(shí)驗(yàn)(如表3)(4)壯苗培養(yǎng)：將三種檉柳增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的叢生苗轉(zhuǎn)入ms培養(yǎng)基進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，培養(yǎng)20天。(5)生根培養(yǎng)：經(jīng)壯苗長(zhǎng)高后的組培苗，剪成約3cm左右的小段，作為生根培養(yǎng)的材料。選用的基本培養(yǎng)基為ms培養(yǎng)基，添加kt與iba的濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7和0.9mg/l，培養(yǎng)20天后統(tǒng)計(jì)其生根率、根長(zhǎng)和生根條數(shù)。組培苗培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度白天25±1℃，夜晚18±1℃，光照強(qiáng)度為200μmol·m-2·s-1，光照14h，黑暗10h。(6)煉苗移栽：煉苗基質(zhì)為沙子、營(yíng)養(yǎng)土添加1/10的沙子。煉苗材料為生根培養(yǎng)后的組培苗。首先將組培瓶上的皮筋打開，在溫度為22℃，光強(qiáng)度800±100μmol·m–2·s–1的組培室進(jìn)行煉苗兩天，再將組培瓶的封口膜上輕輕打開少許縫隙后煉苗兩天，接著將封口膜打開蓋在組培瓶上煉苗兩天后進(jìn)行移栽。移栽的前一天用濃度為0.05g/ml的多菌靈對(duì)移栽基質(zhì)進(jìn)行消毒，為第二天的移栽做準(zhǔn)備。移栽時(shí)選擇根長(zhǎng)為1.5-2cm、生根條數(shù)為2-3條、生長(zhǎng)健壯的組培苗進(jìn)行移栽，輕輕將組培苗從培養(yǎng)基中取出，用清水將根部的培養(yǎng)基清洗干凈，清洗過程中要仔細(xì)、認(rèn)真、順著根生長(zhǎng)的方向清洗，盡量避免對(duì)根造成傷害。組培苗清洗干凈后，用濃度為0.03g/ml的多菌靈溶液浸泡根部30s左右，移栽到盛有滅過菌的基質(zhì)中，移栽后將花盆放到大白盆里，覆膜培養(yǎng)。每天早晚用噴壺各噴一次水，煉苗一周后，在覆蓋膜上開幾個(gè)洞，繼續(xù)培養(yǎng)一周后，揭膜培養(yǎng)，保持土壤濕潤(rùn)，培養(yǎng)30天移栽大田并統(tǒng)計(jì)成活率。表3檉柳增殖培養(yǎng)基的激素組合2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同濃度組合的naa和6-ba對(duì)甘蒙檉柳增殖生長(zhǎng)的影響結(jié)果如表4所示，不同濃度的kt或iba甘蒙檉柳生根的影響結(jié)果如表5所示，甘蒙檉柳組培快繁體系結(jié)果圖如圖1所示，甘蒙檉柳試管苗移栽后成活率如圖2所示。表4不同濃度組合的naa和6-ba對(duì)甘蒙檉柳增殖生長(zhǎng)的影響表中數(shù)據(jù)是3個(gè)重復(fù)的平均值±sd。不同字母表示在p＝0.05水平上差異顯著。表5不同濃度的kt或iba甘蒙檉柳生根的影響表中數(shù)據(jù)是3個(gè)重復(fù)的平均值±sd。不同字母表示在p＝0.05水平上差異顯著。綜上結(jié)果，本發(fā)明所述方法用于甘蒙檉柳組培快繁時(shí)，甘蒙檉柳的最適增殖培養(yǎng)基ms+6-ba2.0mg/l+naa0.5mg/l，啟動(dòng)率為100％，每個(gè)莖段叢生芽的數(shù)量為37.25個(gè)，生根培養(yǎng)基為ms培養(yǎng)基，生根率可達(dá)88.33％，生根條數(shù)為4.00，根長(zhǎng)為3.70。煉苗基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)土添加1/10的沙子，移栽煉苗取得了較高的成活率，甘蒙檉柳煉苗成活率為88.33％。運(yùn)用此方法，繁殖速度快，大大降低了育苗成本，可以實(shí)現(xiàn)甘蒙檉柳的工廠化育苗，為鹽堿地綠化和生態(tài)建設(shè)提供優(yōu)質(zhì)苗木。實(shí)施例3紅花多枝檉柳組培快繁體系3.1實(shí)驗(yàn)方法(1)消毒體系的確立：插盆栽苗抽出的新嫩枝條為外植體，選用75％c2h5oh(s)和0.1％hgcl2(min)，消毒時(shí)間分別為30s、9min。(2)增殖培養(yǎng)：消毒培養(yǎng)后的無菌苗，ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，選用激素為6-ba和naa，設(shè)置5×3的交互實(shí)驗(yàn)(如表3)(3)壯苗培養(yǎng)：將三種檉柳增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的叢生苗轉(zhuǎn)入ms培養(yǎng)基進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，培養(yǎng)20天。(4)生根培養(yǎng)：經(jīng)壯苗長(zhǎng)高后的組培苗，剪成約3cm左右的小段，作為生根培養(yǎng)的材料。選用的基本培養(yǎng)基為ms培養(yǎng)基，添加kt與iba的濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7和0.9mg/l。培養(yǎng)20天后統(tǒng)計(jì)其生根率、根長(zhǎng)和生根條數(shù)。組培苗培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度白天25±1℃，夜晚18±1℃，光照強(qiáng)度為200μmol·m–2·s–1，光照14h，黑暗10h。(5)煉苗移栽：煉苗基質(zhì)為沙子和營(yíng)養(yǎng)土添加1/10的沙子。煉苗材料為生根培養(yǎng)后的三種檉柳組培苗，移栽基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)土添加1/10的沙子或沙子。首先將組培瓶上的皮筋打開，在溫度為22℃，光強(qiáng)度為800±100μmol·m–2·s–1的組培室進(jìn)行煉苗兩天，再將組培瓶的封口膜上輕輕打開少許縫隙后煉苗兩天，接著將封口膜打開蓋在組培瓶上煉苗兩天后進(jìn)行移栽。移栽的前一天用濃度為0.05g/ml的多菌靈對(duì)移栽基質(zhì)進(jìn)行消毒，為第二天的移栽做準(zhǔn)備。移栽時(shí)選擇根長(zhǎng)為1.5-2cm、生根條數(shù)為2-3條、生長(zhǎng)健壯的組培苗進(jìn)行移栽，輕輕將組培苗從培養(yǎng)基中取出，用清水將根部的培養(yǎng)基清洗干凈，清洗過程中要仔細(xì)、認(rèn)真、順著根生長(zhǎng)的方向清洗，盡量避免對(duì)根造成傷害。組培苗清洗干凈后，用濃度為0.03g/ml的多菌靈溶液浸泡根部30s左右，移栽到盛有滅過菌的基質(zhì)中，移栽后將花盆放到大白盆里，覆膜培養(yǎng)。每天早晚用噴壺各噴一次水，煉苗一周后，在覆蓋膜上開幾個(gè)洞，繼續(xù)培養(yǎng)一周后，揭膜培養(yǎng)，保持土壤濕潤(rùn)，培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)成活率。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同濃度組合的naa和6-ba對(duì)紅花多枝檉柳增殖生長(zhǎng)的影響結(jié)果如表6所示，不同濃度的kt或iba紅花多枝檉柳生根的影響結(jié)果如表7所示，紅花多枝檉柳組培快繁體系結(jié)果圖如圖3所示。表6不同濃度組合的naa和6-ba對(duì)紅花多枝檉柳增殖生長(zhǎng)的影響表中數(shù)據(jù)是3個(gè)重復(fù)的平均值±sd。不同字母表示在p＝0.05水平上差異顯著。表7不同濃度的kt或iba對(duì)紅花多枝檉柳生根的影響表中數(shù)據(jù)是3個(gè)重復(fù)的平均值±sd。不同字母表示在p＝0.05水平上差異顯著。綜上結(jié)果，本發(fā)明紅花多枝檉柳的組培快繁體系為，紅花多枝檉柳的采用增殖培養(yǎng)基ms+6-ba1.5mg/l+naa0.7mg/l，啟動(dòng)率為87.5％，每個(gè)莖段叢生芽的數(shù)量為34.5個(gè)。在ms培養(yǎng)基中，生根率可達(dá)92.31％，生根條數(shù)為5.33條，根長(zhǎng)為6.40cm。煉苗基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)土+1/10沙子，移栽煉苗取得了較高的成活率，紅花多枝檉柳為93.33％，為工廠化育苗提供了技術(shù)支持。運(yùn)用本發(fā)明所述方法，繁殖速度快，大大降低了育苗成本，推進(jìn)紅花多枝檉柳的生產(chǎn)造林。實(shí)施例4中國(guó)檉柳組培快繁體系4.1實(shí)驗(yàn)方法(1)外植體：中國(guó)檉柳扦插盆栽苗抽出的新嫩枝條為外植體。(2)消毒體系：選用75％c2h5oh(s)和0.1％hgcl2(min)，消毒時(shí)間分別為30s、9min。(3)增殖培養(yǎng)：消毒培養(yǎng)后的無菌苗，ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，選用激素為6-ba和naa，設(shè)置5×3的交互實(shí)驗(yàn)(如表3)(4)壯苗培養(yǎng)：將三種檉柳增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的叢生苗轉(zhuǎn)入ms培養(yǎng)基進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，培養(yǎng)20天。(5)生根培養(yǎng)：經(jīng)壯苗長(zhǎng)高后的組培苗，剪成約3cm左右的小段，作為生根培養(yǎng)的材料。選用的基本培養(yǎng)基為ms培養(yǎng)基，添加kt與iba的濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7和0.9mg/l。培養(yǎng)20天后統(tǒng)計(jì)其生根率、根長(zhǎng)和生根條數(shù)。組培苗培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度白天25±1℃，夜晚18±1℃，光照強(qiáng)度為200μmol·m–2·s–1，光照14h，黑暗10h。(6)煉苗與移栽：煉苗基質(zhì)為沙子和營(yíng)養(yǎng)土添加1/10的沙子。煉苗材料為生根培養(yǎng)后的檉柳組培苗，移栽基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)土添加1/10的沙子或沙子。首先將組培瓶上的皮筋打開，在溫度為22℃，光強(qiáng)度800±100μmol·m–2·s–1的組培室進(jìn)行煉苗兩天，再將組培瓶的封口膜上輕輕打開少許縫隙后煉苗兩天，接著將封口膜打開蓋在組培瓶上煉苗兩天后進(jìn)行移栽。移栽的前一天用濃度為0.05g/ml的多菌靈對(duì)移栽基質(zhì)進(jìn)行消毒，為第二天的移栽做準(zhǔn)備。移栽時(shí)選擇根長(zhǎng)為1.5-2cm、生根條數(shù)為2-3條、生長(zhǎng)健壯的組培苗進(jìn)行移栽，輕輕將組培苗從培養(yǎng)基中取出，用清水將根部的培養(yǎng)基清洗干凈，清洗過程中要仔細(xì)、認(rèn)真、順著根生長(zhǎng)的方向清洗，盡量避免對(duì)根造成傷害。組培苗清洗干凈后，用濃度為0.03g/ml的多菌靈溶液浸泡根部30s左右，移栽到盛有滅過菌的基質(zhì)中，移栽后將花盆放到大白盆里，覆膜培養(yǎng)。每天早晚用噴壺各噴一次水，煉苗一周后，在覆蓋膜上開幾個(gè)洞，繼續(xù)培養(yǎng)一周后，揭膜培養(yǎng)，保持土壤濕潤(rùn)，培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)成活率。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同濃度組合的naa和6-ba對(duì)中國(guó)檉柳增殖生長(zhǎng)的影響結(jié)果如表8所示，不同濃度的kt或iba中國(guó)檉柳生根的影響結(jié)果如表9所示，中國(guó)檉柳組培快繁體系結(jié)果圖如圖4所示。表8不同濃度組合的naa和6-ba對(duì)中國(guó)檉柳增殖生長(zhǎng)的影響表中數(shù)據(jù)是3個(gè)重復(fù)的平均值±sd。不同字母表示在p＝0.05水平上差異顯著。表9不同濃度的kt或iba對(duì)中國(guó)檉柳生根的影響表中數(shù)據(jù)是3個(gè)重復(fù)的平均值±sd。不同字母表示在p＝0.05水平上差異顯著。綜上結(jié)果，本發(fā)明所述組培快繁方法適用于中國(guó)檉柳，中國(guó)檉柳的增殖培養(yǎng)基ms+6-ba1.5mg/l+naa0.7mg/l，啟動(dòng)率為87.5％，每個(gè)莖段叢生芽的數(shù)量為47.25個(gè)；在ms培養(yǎng)基中，生根率可達(dá)97.62％，生根條數(shù)為3.33，根長(zhǎng)為1.80。煉苗基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)土，移栽煉苗取得了較高的成活率，中國(guó)檉柳為91.67％。當(dāng)前第1頁(yè)12