本發(fā)明涉及植物生物領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種抑制羅漢果cas基因表達(dá)的方法。

背景技術(shù)：

羅漢果甜苷v萃取于廣西特產(chǎn)經(jīng)濟(jì)植物——羅漢果，其甜度為蔗糖的300倍，其熱量為零，具有清熱潤肺鎮(zhèn)咳、潤腸通便之功效，對肥胖、便秘、糖尿病等具有防治作用，目前市場對羅漢果甜苷v的需求量較大，因此需要提高種植效率來提高羅漢果甜苷v的產(chǎn)量以滿足市場的需要。羅漢果甜苷v屬于葫蘆烷型四環(huán)三萜類物質(zhì)，本課題組前期根據(jù)羅漢果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，已推導(dǎo)出甜苷v可能的生物合成途徑。羅漢果甜苷v生物合成的前體物質(zhì)是異戊烯二磷酸(ipp)和3,3-二甲基烯內(nèi)基焦磷酸(dmapp)，二者是通過甲羥戊酸(mva)和甲基赤蘚糖醇磷酸化(mep)兩條途徑形成，mva途徑發(fā)生在胞質(zhì)中，mep途徑發(fā)生在質(zhì)體中。來源于上述兩途徑的ipp或dmapp經(jīng)牻牛兒基焦磷酸合酶(gps)催化形成牻牛兒基焦磷酸(gpp)，ipp與gpp在法呢基焦磷酸合酶(fps)的催化作用下進(jìn)而形成法呢基焦磷酸(fpp)，然后經(jīng)角鯊烯合酶(ss)、角鯊烯環(huán)氧化酶(se)的催化形成2,3-氧化角鯊烯，2,3-氧化角鯊烯經(jīng)葫蘆二烯醇合酶(cs)進(jìn)一步催化形成葫蘆二烯醇，最后在cyp450酶和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，形成羅漢果甜苷v。2,3-氧化角鯊烯還可以經(jīng)環(huán)阿喬醇合酶(cas)形成環(huán)阿喬醇，這是形成不同甾醇的前體物質(zhì)。

異戊二烯類物質(zhì)的產(chǎn)生受到限速酶活性的嚴(yán)格調(diào)控，一直被認(rèn)為在其生物合成途徑中起著重要的調(diào)控作用。cas競爭cs的底物(2,3-氧化角鯊烯)，爭奪其碳骨架，朝著植物甾醇的方向發(fā)展，間接影響了羅漢果甜苷v的合成。抑制cas基因的表達(dá)，可以間接促進(jìn)羅漢果甜苷v的積累；相反，如果過表達(dá)cas基因，將促進(jìn)植物甾醇的積累，而降低羅漢果甜苷v的產(chǎn)量?，F(xiàn)有技術(shù)中未見有抑制羅漢果cas基因表達(dá)的報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是解決傳統(tǒng)種植的羅漢果甜苷v的產(chǎn)量不高的問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種抑制羅漢果cas基因表達(dá)的方法，將羅漢果組培苗接種在茉莉酸甲酯濃度為325-400μmol/l的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)28-30d。

優(yōu)選的是，上述步驟中用體積分?jǐn)?shù)為2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯配制成茉莉酸甲酯母液，并用微孔濾膜滅菌，滅菌后冷卻至24-26℃，再將冷卻后的茉莉酸甲酯母液添加到固體培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯最終濃度為325-400μmol/l，得到誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

優(yōu)選的是，所述固體培養(yǎng)基組分為：ms+6-ba1.5mg/l+吲哚丁酸0.3mg/l+瓊脂3.5g/l+蔗糖30g/l+活性炭1.0g/l。

優(yōu)選的是，將羅漢果組培苗置于濕度60-66％、光照強(qiáng)度1400lux，光照時間8h/d，溫度23±2℃條件下培養(yǎng)。

優(yōu)選的是，用體積分?jǐn)?shù)為2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，將茉莉酸甲酯配成325-400μmol/l的茉莉酸甲酯溶液，噴灑于授粉后20-30d的羅漢果表面，每次噴灑至羅漢果表面滴水為止，每天噴灑三次，每隔4-6h噴灑一次，連續(xù)噴施4-6d。

優(yōu)選的是，配制脫落酸和氯化鈣的混合溶液，其中脫落酸的濃度為10-20mg/l，氯化鈣的濃度為350-540mg/l，將脫落酸和氯化鈣的混合溶液進(jìn)行磁化處理，磁場強(qiáng)度為150-200mt，磁化處理時間為8-12min，將培養(yǎng)好的組培苗的根部放于磁化處理后的脫落酸和氯化鈣的混合溶液中進(jìn)行浸泡培養(yǎng)，浸泡時間為8-12h；在羅漢果幼苗定植后的第20天，再用磁化處理后的脫落酸和氯化鈣的混合溶液滴施于羅漢果幼苗根部，每次滴施量為300-500ml/株，每隔3天滴施一次，共滴施5次。

優(yōu)選的是，在羅漢果授粉期，每天用波長為400-420nm的ne-he激光對羅漢果花蕊進(jìn)行照射，每次照射時間為2-4min，每天照射一次，連續(xù)照射三天；從授粉開始，第一天用濃度為0.02-0.04mm的硼酸鈉噴施羅漢果植株，噴施50-100ml，第二天用濃度為0.02-0.05mm的鉬酸銨噴施羅漢果植株，噴施50-100ml，第三天用質(zhì)量濃度為0.01-0.02％的甜菜堿噴施羅漢果植株，噴施50-100ml，每5天重復(fù)循環(huán)噴施一次該三種溶液，共循環(huán)噴施6次。

優(yōu)選的是，在羅漢果果實(shí)的中后期用牛皮紙袋將羅漢果果實(shí)包裹住，并向袋中通入濃度為2-3％的二氧化碳?xì)怏w，其余為氮?dú)?，每次套?-5h，共套袋5-6次。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

(1)在羅漢果組培苗的培養(yǎng)基中添加茉莉酸甲脂，這樣在羅漢果組培苗生長過程中，茉莉酸甲脂一直作用于組培苗，從而抑制羅漢果組培苗中cas基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)羅漢果甜苷v的合成，且本申請人經(jīng)過大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯濃度為325-400μmol/l最適宜抑制羅漢果組培苗中的cas基因表達(dá)；(2)在授粉后20-30d的羅漢果表面噴施茉莉酸甲脂溶液，在羅漢果果實(shí)膨大期用茉莉酸甲脂去刺激羅漢果進(jìn)而抑制羅漢果cas基因的表達(dá)，提高羅漢果甜苷v的含量；

(2)對脫落酸和氯化鈣的混合溶液進(jìn)行磁化處理，磁化處理后，有助于該混合溶液在生物體內(nèi)有序運(yùn)動，提高其作用效果，用磁化處理后的脫落酸和氯化鈣的混合溶液噴施羅漢果幼苗植株和滴施羅漢果的根部，使得羅漢果幼苗充分吸收脫落酸和氯化鈣，脫落酸和氯化鈣的工作于羅漢果幼苗，能夠協(xié)調(diào)羅漢果植株內(nèi)的代謝，促進(jìn)代謝平衡，且能調(diào)控植物甾醇的合成量，從而抑制cas基因的表達(dá)，促進(jìn)羅漢果甜苷v的合成；

(3)在花期對羅漢果進(jìn)行激光處理，授粉后的羅漢果植株吸收了光子，分子內(nèi)發(fā)生能級躍遷，進(jìn)而影響dna分子的總量，對羅漢果cas基因的表達(dá)起抑制作用，再在一個較長的時間內(nèi)對羅漢果分別噴施硼酸鈉、鉬酸銨和甜菜堿，這三者共同作用對羅漢果有氧呼吸和能量代謝過程有良好的保護(hù)作用，同時能維持細(xì)胞滲透平衡，調(diào)控限速酶的活性，限制植物甾醇的產(chǎn)生，抑制羅漢果cas基因的表達(dá)，提高羅漢果甜苷v的含量；將硼酸鈉、鉬酸銨和甜菜堿分開每天噴施，這樣可以讓羅漢果能更好地吸收所噴施的物質(zhì)，并逐漸發(fā)揮作用；

(4)在羅漢果中后期進(jìn)行套袋處理，可以提高羅漢果甜苷v積累量。

本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。

需要說明的是，下述實(shí)施方案中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1：

一種抑制羅漢果cas基因表達(dá)的方法，將羅漢果組培苗接種在茉莉酸甲酯濃度為325μmol/l的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于濕度60％、光照強(qiáng)度1200lux，光照時間8h/d，溫度23±2℃條件下培養(yǎng)30d。其中固體培養(yǎng)基組分為：ms+6-ba1.5mg/l+吲哚丁酸0.3mg/l+瓊脂3.5g/l+蔗糖30g/l+活性炭1.0g/l；加入茉莉酸甲酯的方法為：用體積分?jǐn)?shù)為2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯配制成茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，滅菌后冷卻至24-26℃，再將冷卻后的茉莉酸甲酯母液添加到上述固體培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯最終濃度為325μmol/l，得到誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

實(shí)施例2：

一種抑制羅漢果cas基因表達(dá)的方法，將羅漢果組培苗接種在茉莉酸甲酯濃度為375μmol/l的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于濕度65％、光照強(qiáng)度1400lux，光照時間8h/d，溫度23±2℃條件下培養(yǎng)30d。其中固體培養(yǎng)基組分為：ms+6-ba1.5mg/l+吲哚丁酸0.3mg/l+瓊脂3.5g/l+蔗糖30g/l+活性炭1.0g/l；加入茉莉酸甲酯的方法為：用體積分?jǐn)?shù)為2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯配制成茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，滅菌后冷卻至24-26℃，再將冷卻后的茉莉酸甲酯母液添加到上述固體培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯最終濃度為375μmol/l，得到誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

實(shí)施例3：

一種抑制羅漢果cas基因表達(dá)的方法，將羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯濃度為400μmol/l的固體培養(yǎng)基中，置于濕度66％、光照強(qiáng)度1400lux，光照時間8h/d，溫度23±2℃條件下培養(yǎng)30d。其中固體培養(yǎng)基組分為：ms+6-ba1.5mg/l+吲哚丁酸0.3mg/l+瓊脂3.5g/l+蔗糖30g/l+活性炭1.0g/l；加入茉莉酸甲酯的方法為：用體積分?jǐn)?shù)為2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯配制成茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，滅菌后冷卻至24-26℃，再將冷卻后的茉莉酸甲酯母液添加到上述固體培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯最終濃度為400μmol/l，得到誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

實(shí)施例4：

在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，用體積分?jǐn)?shù)為2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，將茉莉酸甲酯配成濃度為365μmol/l的茉莉酸甲酯溶液，噴灑于授粉后30d的羅漢果表面，每次噴灑至羅漢果表面滴水為止，每天噴灑三次，每隔4h噴灑一次，連續(xù)噴施6d。

實(shí)施例5：

在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，用體積分?jǐn)?shù)為2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，將茉莉酸甲酯配成濃度為325μmol/l的茉莉酸甲酯溶液，噴灑于授粉后25d的羅漢果表面，每次噴灑至羅漢果表面滴水為止，每天噴灑三次，每隔6h噴灑一次，連續(xù)噴施5d。

實(shí)施例6：

在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，用體積分?jǐn)?shù)為2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，將茉莉酸甲酯配成濃度為400μmol/l的茉莉酸甲酯溶液，噴灑于授粉后20d的羅漢果表面，每次噴灑至羅漢果表面滴水為止，每天噴灑三次，每隔5h噴灑一次，連續(xù)噴施4d。

實(shí)施例7：

在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，配制脫落酸和氯化鈣的混合溶液，其中脫落酸的濃度為10mg/l，氯化鈣的濃度為350mg/l，將脫落酸和氯化鈣的混合溶液進(jìn)行磁化處理，磁場強(qiáng)度為150mt，磁化處理時間為12min，將培養(yǎng)好的組培苗的根部放于磁化處理后的脫落酸和氯化鈣的混合溶液中進(jìn)行浸泡培養(yǎng)，浸泡時間為12h；在羅漢果幼苗定植后的第20天，再用磁化處理后的脫落酸和氯化鈣的混合溶液滴施于羅漢果幼苗根部，每次滴施量為500ml/株，每隔3天滴施一次，共滴施5次。

實(shí)施例8：

在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，配制脫落酸和氯化鈣的混合溶液，其中脫落酸的濃度為20mg/l，氯化鈣的濃度為435mg/l，將脫落酸和氯化鈣的混合溶液進(jìn)行磁化處理，磁場強(qiáng)度為200mt，磁化處理時間為8min，將培養(yǎng)好的組培苗的根部放于磁化處理后的脫落酸和氯化鈣的混合溶液中進(jìn)行浸泡培養(yǎng)，浸泡時間為10h；在羅漢果幼苗定植后的第20天，再用磁化處理后的脫落酸和氯化鈣的混合溶液滴施于羅漢果幼苗根部，每次滴施量為300ml/株，每隔3天滴施一次，共滴施5次。

實(shí)施例9：

在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，配制脫落酸和氯化鈣的混合溶液，其中脫落酸的濃度為15mg/l，氯化鈣的濃度為540mg/l，將脫落酸和氯化鈣的混合溶液進(jìn)行磁化處理，磁場強(qiáng)度為180mt，磁化處理時間為10min，將培養(yǎng)好的組培苗的根部放于磁化處理后的脫落酸和氯化鈣的混合溶液中進(jìn)行浸泡培養(yǎng)，浸泡時間為8h；在羅漢果幼苗定植后的第20天，再用磁化處理后的脫落酸和氯化鈣的混合溶液滴施于羅漢果幼苗根部，每次滴施量為410ml/株，每隔3天滴施一次，共滴施5次。

實(shí)施例10：

在實(shí)施例9的基礎(chǔ)上，在羅漢果授粉期，每天用波長為400nm的ne-he激光對羅漢果花蕊進(jìn)行照射，每次照射時間為2min，每天照射一次，連續(xù)照射三天；從授粉開始，第一天用濃度為0.02mm的硼酸鈉噴施羅漢果植株，噴施100ml，第二天用濃度為0.05mm的鉬酸銨噴施羅漢果植株，噴施50ml，第三天用質(zhì)量濃度為0.02％的甜菜堿噴施羅漢果植株，噴施50ml，每5天重復(fù)循環(huán)噴施一次該三種溶液，共循環(huán)噴施6次。在羅漢果果實(shí)的中后期用牛皮紙袋將羅漢果果實(shí)包裹住，并向袋中通入濃度為3％的二氧化碳?xì)怏w，其余為氮?dú)?，每次套?h，共套袋5次。

實(shí)施例11：

在實(shí)施例9的基礎(chǔ)上，在羅漢果授粉期，每天用波長為420nm的ne-he激光對羅漢果花蕊進(jìn)行照射，每次照射時間為4min，每天照射一次，連續(xù)照射三天；從授粉開始，第一天用濃度為0.04mm的硼酸鈉噴施羅漢果植株，噴施50ml，第二天用濃度為0.02mm的鉬酸銨噴施羅漢果植株，噴施100ml，第三天用質(zhì)量濃度為0.01％的甜菜堿噴施羅漢果植株，噴施100ml，每5天重復(fù)循環(huán)噴施一次該三種溶液，共循環(huán)噴施6次。在羅漢果果實(shí)的中后期用牛皮紙袋將羅漢果果實(shí)包裹住，并向袋中通入濃度為2％的二氧化碳?xì)怏w，其余為氮?dú)?，每次套?h，共套袋6次。

實(shí)施例12：

在實(shí)施例9的基礎(chǔ)上，在羅漢果授粉期，每天用波長為420nm的ne-he激光對羅漢果花蕊進(jìn)行照射，每次照射時間為3min，每天照射一次，連續(xù)照射三天；從授粉開始，第一天用濃度為0.03mm的硼酸鈉噴施羅漢果植株，噴施70ml，第二天用濃度為0.04mm的鉬酸銨噴施羅漢果植株，噴施60ml，第三天用質(zhì)量濃度為0.02％的甜菜堿噴施羅漢果植株，噴施80ml，每5天重復(fù)循環(huán)噴施一次該三種溶液，共循環(huán)噴施6次。在羅漢果果實(shí)的中后期用牛皮紙袋將羅漢果果實(shí)包裹住，并向袋中通入濃度為3％的二氧化碳?xì)怏w，其余為氮?dú)?，每次套?h，共套袋6次。

為了說明本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明的申請人針對不同方法或?qū)嵤├玫降牧_漢果果實(shí)，針對cas基因表達(dá)量以及甜苷v含量進(jìn)行測定，具體方法以及結(jié)果如下：

1、cas基因表達(dá)量測定方法：利用abi7500實(shí)時熒光定量pcr儀，采用qrt-pcr檢測cas基因的表達(dá)。

步驟一、樣品前處理：采集羅漢果果實(shí)，挑取果肉，切成2-4mm小塊并分別用錫箔紙包好，立即置于液氮中速凍，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

步驟二、先采用改良trizol法提取羅漢果果實(shí)總rna；

步驟三、將rna反轉(zhuǎn)錄為cdna的反應(yīng)體系為rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反應(yīng)條件為37℃(15min)→85℃(5s)→4℃；

步驟四、所述步驟三采用primerpremier5.0軟件設(shè)計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中，cas引物序列為：

fp：tgctgttgggtggaggat，rp：gcttagttgacatgatggcttg；

內(nèi)參基因用ubq5，序列為：

fp：ataaaagacccagcaccacattc，rp：cccttgccgactacaacatcc；

步驟五、qrt-pcr反應(yīng)體系(20μl)為sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl。反應(yīng)條件為95℃(30s)，接著進(jìn)行40個cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。

2、羅漢果甜苷v含量：采用高效液相色譜法，具體方法參考《廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報》第2007年04期上發(fā)表的“hplc測定羅漢果中羅漢果甜苷v的含量”一文。

用常規(guī)方法、實(shí)施例3、實(shí)施例5、實(shí)施例9以及實(shí)施例12的方法種植羅漢果，常規(guī)方法種植作為對照組，在每種方法種植的不同羅漢果植株上共摘取30枚羅漢果，進(jìn)行試驗(yàn)求平均值得到的cas基因表達(dá)量和羅漢果甜苷v含量如表1所示：

表1

由表1可以看出，實(shí)施例3的羅漢果cas基因表達(dá)量和羅漢果甜苷v含量明顯高于對照組，由此可見在羅漢果組培面的固體培養(yǎng)基中增加茉莉酸甲脂能明顯抑制羅漢果cas基因的表達(dá)，從而顯著提高羅漢果甜苷v的含量。

實(shí)施例5是在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上在授粉后的羅漢果上噴施茉莉酸甲脂溶液，從表1中可以看出，實(shí)施例5的羅漢果cas基因表達(dá)量和羅漢果甜苷v含量明顯低于實(shí)施例3，因此可以說明在授粉后對羅漢果噴施茉莉酸甲脂溶液也能有效地抑制羅漢果cas基因表達(dá)，進(jìn)而提高羅漢果甜苷v含量。

實(shí)施例9是在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，用磁化處理后的脫落酸和氯化鈣對羅漢果幼苗進(jìn)行噴施和滴施，表1可以看出，實(shí)施例9的羅漢果cas基因表達(dá)量低于實(shí)施例3，而羅漢果甜苷v含量明顯高于實(shí)施例3，這說明實(shí)施例9的方法可以抑制羅漢果cas基因的表達(dá)和提高羅漢果甜苷v含量。

實(shí)施例12是在實(shí)施例9的基礎(chǔ)上，對羅漢果進(jìn)行激光照射處理，同時噴施硼酸鈉、鉬酸銨以及甜菜堿，且對羅漢果進(jìn)行了套袋處理，由表1可以看出，實(shí)施例12的羅漢果cas基因表達(dá)量低于實(shí)施例9，而羅漢果甜苷v含量明顯高于實(shí)施例3，這說明實(shí)施例9的方法對抑制羅漢果cas基因的表達(dá)和提高羅漢果甜苷v含量有明顯效果。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的實(shí)施例。