本發(fā)明涉及一種用硝普鈉(snp)與間歇浸沒式生物反應(yīng)器相結(jié)合使重樓種子快速萌發(fā)成苗的方法，屬于珍稀藥用植物繁殖技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

重樓(paris)是百合科重樓屬的多年生草本植物，是一種重要的中藥材，其中滇重樓和七葉一枝花的干燥根莖組織在《中國藥典》(2015版)中被認(rèn)定為常用藥材重樓的藥源?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，重樓的根莖具有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、平喘、止血及抑菌消炎等作用，特別是近年來發(fā)現(xiàn)其在抗腫瘤方面療效顯著。因此，在經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)下，重樓野生資源被不斷的掠奪式采挖，瀕臨滅絕。因此進(jìn)行人工繁殖，不僅能保護(hù)滇重樓的野生資源，并且能滿足不斷增長的市場需求。

當(dāng)前生產(chǎn)上常用的人工繁殖方式以根莖繁殖法為主。根莖切塊繁殖雖然目前最為成功，但依然有缺點(diǎn)與不足之處。第一，根莖是經(jīng)濟(jì)器官，切割后會(huì)增加成本，且用種量大。第二，需大量留種，易發(fā)生腐爛，并遭受鼠害侵襲。第三，繁殖系數(shù)雖高，但周期長，無法滿足生產(chǎn)需要。而利用種子進(jìn)行人工繁育，具有繁殖系數(shù)大、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，還可以避免根狀莖繁殖對藥用部分的消耗，大大提高繁殖系數(shù)，又能降低組織培養(yǎng)引起的遺傳變異風(fēng)險(xiǎn)，是緩解重樓資源短缺的有效途徑。然而，重樓生長繁殖緩慢，自然狀態(tài)下，種子播種需要兩冬一夏才能萌發(fā)，此后還要繼續(xù)生長5-7年才能入藥，這一缺點(diǎn)嚴(yán)重限制了重樓的來源。因此，人工打破種子休眠，提高發(fā)芽率，已成為大規(guī)模人工繁育重樓所要面臨的重要課題。

目前變溫層積促進(jìn)重樓種子萌發(fā)是采用較多的方法，即將種子進(jìn)行高溫和低溫交替處理，從而促進(jìn)種子提早萌發(fā)，但是該過程的處理時(shí)間也較長，一般需要120-200天。此外，利用植物激素如ga3、ctk和化學(xué)藥劑peg等對重樓種子進(jìn)行處理，也能在不同程度上促進(jìn)種子的萌發(fā)。雖然這些種子繁育技術(shù)均能一定程度上促進(jìn)種子的萌發(fā)，但是在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，層積和激素處理所耗費(fèi)的時(shí)間仍然較長。并且由于重樓種子萌發(fā)周期較長，在促萌過程中也常常需要進(jìn)行人工補(bǔ)水、換氣等工作，因此常常會(huì)出現(xiàn)水分和通氣狀況掌握不當(dāng)而導(dǎo)致種子腐爛和發(fā)霉，所以有必要研究出更加高效快速的方法來促進(jìn)種子萌發(fā)，從而在根本上解決重樓稀缺的現(xiàn)狀。

一氧化氮是一種氣體信號分子，它具有解除植物種子休眠的作用。硝普鈉(snp)是一氧化氮的供體，其水溶液能夠促進(jìn)種子的萌發(fā)，本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中發(fā)現(xiàn)，利用適當(dāng)濃度的硝普鈉水溶液浸泡處理重樓種子，能夠快速促進(jìn)種子萌發(fā)。然而硝普鈉溶液在提供一氧化氮的同時(shí)，還會(huì)釋放出有毒的氰化物，因此長時(shí)間浸泡處理會(huì)對種子產(chǎn)生毒害作用。相反，若浸泡時(shí)間過短則不能起到有效促進(jìn)萌發(fā)的效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有的重樓種子萌發(fā)技術(shù)中種子處理操作麻煩且萌發(fā)時(shí)間長的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種用硝普鈉與間歇浸沒式生物反應(yīng)器相結(jié)合的方法使重樓種子快速萌發(fā)的方法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為：

一種促使重樓種子快速萌發(fā)成苗的方法，包括以下步驟：(1)對采摘的重樓種子進(jìn)行預(yù)處理：將采摘的成熟的重樓種子除去外種皮，沖洗干凈后將種子放在室內(nèi)陰干，然后放置于0～4℃下備用；

(2)檢查間歇浸沒式生物反應(yīng)器的密閉性，然后對間歇浸沒式生物反應(yīng)器進(jìn)行滅菌處理；

(3)取步驟(1)中的重樓種子，先用水浸泡過夜，使種子充分吸脹變得圓潤飽滿，然后在無菌條件下為種子滅菌，并確認(rèn)滅菌徹底，無染菌現(xiàn)象；

(4)培養(yǎng)萌發(fā)：將上步驟中滅菌完全的種子置于間歇浸沒式生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在間歇浸沒式生物反應(yīng)器中加入滅菌蒸餾水，每升滅菌蒸餾水中含有50～150μmol的snp，每個(gè)間歇浸沒式生物反應(yīng)器中接種350～500粒重樓種子，間歇浸沒式生物反應(yīng)器中重樓種子的浸沒頻率為3～5分鐘/6h，在陰暗環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中記錄種子胚根突破的最初時(shí)間，并定期統(tǒng)計(jì)種子的萌發(fā)率，以及種子的胚根長度≥3cm的百分率。

步驟(1)中去除重樓外種皮的過程中，不能使種子表面破損，并且外種皮去除后，將重樓種子用清水沖洗2～5道，徹底去除外種皮殘留物；同時(shí)種子沖洗干凈后切忌暴曬和烘干，以免影響種子的萌發(fā)率。

步驟(2)中檢查密閉性的方法如下：在間歇浸沒式生物反應(yīng)器內(nèi)裝入1l清水，觀察它的密閉性并將加入清水的間歇浸沒式生物反應(yīng)器接到泵上，觀察過濾嘴是否倒流。

步驟(2)中滅菌的方法如下：將清洗干凈的間歇浸沒式生物反應(yīng)器放入到高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌，等其冷卻后用紙張包起來，進(jìn)行再次滅菌，紙張包裹反應(yīng)器的時(shí)候先包住上層，用棉線鎖緊，再包底座，用第二條棉線繼續(xù)鎖緊，將尖銳的部分用透明膠粘住，底座需全部用膠帶粘上，防止滅菌后尖銳物體戳破底座。

步驟(3)中為種子滅菌的方法如下：在超凈工作臺內(nèi)，用無菌水清洗種子3～5次，然后使用體積濃度75％的酒精消毒30～45s，消毒后立即用無菌水清洗3～5次，再使用為質(zhì)量濃度0.1～0.2％的升汞浸泡10～15分鐘，再用無菌水清洗5次；

將培養(yǎng)皿進(jìn)行滅菌處理，滅菌后在培養(yǎng)皿底部鋪2層濾紙，并在培養(yǎng)皿中滴加無菌水至剛好濕潤濾紙；將滅菌后的種子分裝入培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，先小份單獨(dú)培養(yǎng)5天，觀察種子是否滅菌徹底，隨后將未出現(xiàn)染菌的種子移入間歇浸沒式生物反應(yīng)器。

步驟(4)中，將滅菌徹底的種子移入間歇浸沒式生物反應(yīng)器中時(shí)，需在超凈工作臺操作，并且用酒精燈將間歇浸沒式生物反應(yīng)器的蓋子四周滅菌后，方可打開反應(yīng)器蓋子。

步驟(4)中，每個(gè)間歇浸沒式生物反應(yīng)器中加入1l滅菌蒸餾水，且每升滅菌蒸餾水中含有150mg的卡那霉素和50mg的納他霉素。

與現(xiàn)有的重樓的促萌、育苗技術(shù)相比較，本發(fā)明所提供的間歇式浸沒方法，不僅能起到間隔浸沒的目的，同時(shí)還能夠自動(dòng)的通風(fēng)換氣，因此既能夠充分發(fā)揮snp的促萌作用，又不對種子產(chǎn)生毒害作用，同時(shí)在促萌期間不需要人工對種子補(bǔ)充水分、通風(fēng)換氣等工作。該方法操作簡單、節(jié)省人力的同時(shí)更是有效降低了因水分和通氣狀況掌握不當(dāng)而導(dǎo)致種子腐爛和發(fā)霉的幾率。另外，該方法大大縮短了萌發(fā)時(shí)間，提高了萌發(fā)率。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明中在75天就可以達(dá)到萌發(fā)率90％以上，種子萌發(fā)后的壯苗率(萌發(fā)后胚根長≥3cm的種子所占的比例——溫室及田間實(shí)驗(yàn)表明胚根長≥3cm的種子更易于成活)也顯著提高，并且生產(chǎn)成本顯著降低。利用此方法使得重樓種子的萌發(fā)率和壯苗率達(dá)到了最佳的組合狀態(tài)，更加經(jīng)濟(jì)有效。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做詳細(xì)具體的說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

(1)將當(dāng)年采摘的七葉一枝花成熟種子，去除穎殼，然后裝入透氣的紗網(wǎng)袋中，用手搓去紅色外種皮，然后用流動(dòng)的清水將七葉一枝花種子用清水沖洗3～4遍，徹底去除外種皮殘留物。然后放置在報(bào)紙上，于室內(nèi)陰干3～5天，放在4℃冰箱備用。

(2)將新型反應(yīng)器用清水沖洗干凈，然后在反應(yīng)器內(nèi)裝入1l清水，觀察它的密閉性并將加入清水的反應(yīng)器接到泵上，觀察過濾嘴是否倒流。將密閉好的反應(yīng)器放入到高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌，121℃，20分鐘，待反應(yīng)器冷卻后用將其用報(bào)紙包起來，再次進(jìn)行滅菌。

(3)將陰干的七葉一枝花種子，先用清水浸泡24h，使種子充分吸脹變得圓潤飽滿。然后在超凈工作臺內(nèi)，先用無菌水清洗種子3～5次；然后使用75％酒精消毒30s，無菌水洗3～5次；再使用0.1％升汞溶液浸泡10～15分鐘，無菌水洗5次；最后在鋪有2層濾紙的150mm培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)(培養(yǎng)皿預(yù)先滅菌)，滴加無菌水，以剛好濕潤濾紙為宜，用封口膜將培養(yǎng)皿封好。放入人工氣候培養(yǎng)箱25±2℃暗培養(yǎng)，培養(yǎng)5天后進(jìn)行觀察，若發(fā)現(xiàn)濾紙上長有霉菌，則將培養(yǎng)皿內(nèi)發(fā)霉種子與培養(yǎng)皿則清洗掉，滅菌徹底的種子移至反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)。

(4)用酒精燈將反應(yīng)器的蓋子四周滅菌后，打開反應(yīng)器蓋子。然后將含有50～150μmol/lsnp或者500mg/lga3l的滅菌蒸餾水(1l)倒入反應(yīng)器。各個(gè)處理中需加入抗生素(150mg/l卡那霉素和50mg/l納他霉素)。每個(gè)反應(yīng)器中接種400粒重樓種子，接種完畢，擰緊螺絲后在縫隙處封一條封口膜。

(5)反應(yīng)器放置在避光處，反應(yīng)器浸沒頻率為3分鐘/6h，培養(yǎng)條件為溫度25±1℃，相對濕度60％，培養(yǎng)時(shí)間為105d。記錄好種子初見胚根時(shí)間和每隔一段時(shí)間天統(tǒng)計(jì)一次萌發(fā)率，種子萌發(fā)的標(biāo)志以胚根剛剛突破種皮作為標(biāo)準(zhǔn)，壯苗率以胚根長≥3cm的種子所占的比例為標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)施例中以清水和本實(shí)驗(yàn)室前期驗(yàn)證過的最適合濃度的ga3(500mg/l)作為對照，設(shè)置了不同濃度的硝普鈉溶液浸泡種子，發(fā)現(xiàn)使用100μmol/l的硝普鈉溶液效果最好，在35天時(shí)即突破種皮，相比赤霉素和清水分別提前3天和9天。在75天時(shí)，100μmol/l的硝普鈉溶液處理中種子的萌發(fā)率可高達(dá)90％，高于赤霉素處理，且遠(yuǎn)高于其他濃度和清水處理。在第105天時(shí)，壯苗率達(dá)到了73.2％，顯著優(yōu)于對照和500mg/lga3處理，說明使用100μmol/l硝普鈉溶液浸泡種子能明顯促進(jìn)七葉一枝花種子的提早萌發(fā)，并能顯著提高萌發(fā)種子的壯苗率。而且相比赤霉素的價(jià)格，硝普鈉更加經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，在生產(chǎn)上具有更大優(yōu)勢。

實(shí)施例2

選用當(dāng)年采摘的滇重樓種子進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，去除穎殼后，然后人工用手搓去紅色外種皮，并用細(xì)孔篩慢慢篩去外種皮，然后用流動(dòng)的清水將七葉一枝花種子用清水沖洗3-4遍，徹底去除外種皮殘留物。接著放置在報(bào)紙上，于室內(nèi)室內(nèi)陰干3-5天，放在4℃冰箱備用。

將陰干的滇重樓種子，先用清水浸泡24h，使種子充分吸脹變得圓潤飽滿。然后在超凈工作臺內(nèi)，對種子進(jìn)行滅菌，放入人工氣候培養(yǎng)箱20±2℃暗培養(yǎng)，培養(yǎng)5天后進(jìn)行觀察，若發(fā)現(xiàn)濾紙上長有霉菌，則將培養(yǎng)皿內(nèi)發(fā)霉種子與培養(yǎng)皿則清洗掉，滅菌徹底的種子移至反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)。

用酒精燈將反應(yīng)器的蓋子四周滅菌后，打開反應(yīng)器蓋子。然后加入1l含有100μmol/lsnp的滅菌蒸餾水，以1l的滅菌蒸餾水為對照，3次重復(fù)試驗(yàn)，每次100粒種子。結(jié)果：100μmol/lsnp處理中，45天時(shí)有20.33％的種子胚根突破種皮，75天時(shí)滇重樓種子的萌發(fā)率達(dá)到91.01％，第105天時(shí)壯苗率達(dá)到75.4％。

總結(jié)：由以上實(shí)施例能夠看出，本發(fā)明提供的是一種操作簡便、萌發(fā)時(shí)間短且能夠用于大量重樓種子促萌的繁殖技術(shù)。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室萌發(fā)統(tǒng)計(jì)，申請人發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明提供的方法培養(yǎng)的種子在使用100μmol/l的硝普鈉溶液效果最好，在35天時(shí)即突破種皮，相比赤霉素和清水分別提前3天和9天。在75天時(shí)，100μmol/l的硝普鈉溶液處理中種子的萌發(fā)率可高達(dá)90％，高于赤霉素處理，且遠(yuǎn)高于其他濃度和清水處理。說明使用100μmol/l硝普鈉溶液浸泡種子能明顯促進(jìn)重樓種子的提早萌發(fā)，并提高其萌發(fā)率。而且相比赤霉素處理，硝普鈉的效果更好，且其價(jià)格更加經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，在生產(chǎn)上具有更大優(yōu)勢。間歇浸沒式生物反應(yīng)器的容量為高270mm，直徑270mm，下部容積為1.5l；其體積原大于常用的培養(yǎng)皿和燒杯等器具，一次處理的種子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)的方法，能夠真正實(shí)現(xiàn)對重樓種子的大量促萌，同時(shí)在種子促萌過程中不需要人為的補(bǔ)水和換氣等，降低了種子霉?fàn)€和染菌的幾率，操作簡單且節(jié)約了生產(chǎn)成本。該組合方法不僅能夠加快種子的萌發(fā)進(jìn)程，同時(shí)能夠提高種子的壯苗率，在萌發(fā)的105天100μmol/l的硝普鈉溶液處理中，胚根≥3cm的種子百分率達(dá)到了73.2％，遠(yuǎn)高于對照組和赤霉素處理組。