本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種三葉青組培苗的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

三葉青，別名金線吊葫蘆、三葉扁藤、石老鼠、小扁藤、石猴子、三葉對(duì)，為葡萄科崖爬藤屬植物。三葉青是一味民間的中草藥，極為珍稀，在浙江民間，采用三葉青治療腫瘤的歷史較為久遠(yuǎn)。三葉青藥用功效神奇，具有提高免疫力、抗病毒、增強(qiáng)肝功能等功效，被中醫(yī)藥界譽(yù)為極品中草藥，尤其對(duì)癌癥、腫瘤、乙肝、小兒高熱驚厥、支氣管炎、肺炎、病毒性腦膜炎等具有獨(dú)特的療效作用。

三葉青在藥理和臨床等方面具抗腫瘤、抗病毒、退高熱等特有的顯著療效，現(xiàn)在備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。隨著三葉青在民間的廣泛應(yīng)用，以及現(xiàn)代先進(jìn)科研技術(shù)在其研究中的運(yùn)用，其藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)和利用將有著廣闊的前景。然而，現(xiàn)有的野生三葉青瀕臨滅絕，根本無(wú)法滿足當(dāng)今社會(huì)的需求。因此，三葉青的人工繁殖將是一個(gè)非常重要的研究領(lǐng)域。

組培采用的植物材料完全是在人為提供的培養(yǎng)基和小氣候環(huán)境條件下進(jìn)行生長(zhǎng)，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災(zāi)害性氣候的不利影響，便于穩(wěn)定地進(jìn)行周年培養(yǎng)生產(chǎn)，且植物材料能按幾何級(jí)數(shù)繁殖生產(chǎn)。因此，組培是一種快速、低成本、且能提供規(guī)格一致優(yōu)質(zhì)種苗的新技術(shù)。

三葉青新品種“中澤1號(hào)”是浙江大學(xué)和浙江省中藥研究所合作選育的產(chǎn)量與藥效兼顧的三葉青優(yōu)良品種，塊根卵圓形，毛根不明顯，特定設(shè)施基質(zhì)栽培條件下，節(jié)莖較短，植株矮生，塊根結(jié)果較集中，塊根木質(zhì)纖維極少，淀粉積累較高，鮮食麻感輕微，口感好，產(chǎn)量高。

目前，已有關(guān)于三葉青的組培快速繁殖的相關(guān)報(bào)道，例如：

申請(qǐng)公布號(hào)為cn101103700a的發(fā)明專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種三葉青的組培快速繁殖方法，該方法包括外植體的選取與處理，誘導(dǎo)培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)，生根培養(yǎng)，移栽等步驟。該發(fā)明以ms培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入了輔助劑：活性炭、聚乙烯吡咯烷酮、6-芐基腺嘌呤、激動(dòng)素、玉米素、萘乙酸、吲哚丁酸等，用于三葉青叢生芽誘導(dǎo)、壯苗及生根三個(gè)關(guān)鍵階段的組織培養(yǎng)。該本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為：(1)三葉青的生產(chǎn)可以在人為控制條件下進(jìn)行，不受季節(jié)、氣候條件與土壤等因素的制約，可排除病蟲(chóng)害的侵染和農(nóng)藥殘留的影響，嚴(yán)格控制三葉青藥材的質(zhì)量；(2)增殖速度快，生產(chǎn)周期短，設(shè)備簡(jiǎn)單，占地面積少，能節(jié)省人力、物力等，便于工廠化生產(chǎn)；(3)可以保存三葉青的種質(zhì)資源，同時(shí)有利于保護(hù)野生資源，減少對(duì)自然資源的破壞。

杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究所的錢(qián)麗華也公開(kāi)了藥用植物“三葉青”的組培快繁技術(shù)研究報(bào)道，其以藥用植物"三葉青"的腋芽為供試材料，通過(guò)開(kāi)展腋芽外植體誘導(dǎo)技術(shù)、不定芽繼代增殖技術(shù)及試管苗生根技術(shù)研究，形成一套完整的"三葉青"組培快繁技術(shù)。試驗(yàn)結(jié)果表明：1/2ms+ba0.03～0.5mg/l可作為"三葉青"腋芽外植體誘導(dǎo)配，25d腋芽平均萌發(fā)率最高達(dá)92％；在此誘導(dǎo)配方上，23μmol·m^-2·s^-1的光照強(qiáng)度有利于腋芽的萌發(fā)，較8μmol·m^-2·s^-1下最高萌發(fā)率高出15.38％；ms基本培養(yǎng)基+ba2mg/l+naa0.2mg/l或ba2mg/l為不定芽繼代增殖配方，不定芽平均增殖系數(shù)達(dá)5.455和4.135，繼代周期縮短到35～40d；1/2ms+20g/l蔗糖+naa0.2mg/l為三葉青不定芽生根培養(yǎng)基配方，10～15d不定芽生根率達(dá)到98％以上。

上述方法均能有效培植三葉青，但是，針對(duì)不同品種的三葉青，組培快繁技術(shù)仍存在較大差異；并且本領(lǐng)域研究人員對(duì)于組培苗的栽培技術(shù)的研究還有待進(jìn)一步深入研究。因此，有必要針對(duì)特定三葉青品種“中澤1號(hào)”研究一套特有的組培和配套栽培技術(shù)，以確保其產(chǎn)量和品質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種三葉青組培苗的生產(chǎn)方法，該方法獲得的三葉青組培苗木質(zhì)化程度高，苗粗根壯，煉苗所需時(shí)間短，移栽成活率高。

一種三葉青組培苗的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：

(1)選取外植體：取三葉青品種“中澤1號(hào)”的當(dāng)年生嫩枝，消毒后，切成含腋芽的小段；

(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)：將所述小段接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到愈傷組織；誘導(dǎo)培養(yǎng)基以ms培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加0.3～0.4mg/l的芐氨基腺嘌呤和0.02～0.04mg/l的萘乙酸；

(3)增殖培養(yǎng)：將所述愈傷組織轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行增殖培養(yǎng)；增殖培養(yǎng)基以ms培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加2.0～3.0mg/l的芐氨基腺嘌呤和0.1～0.2mg/l的萘乙酸；

(4)生根培養(yǎng)：將所述增殖培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)；生根培養(yǎng)基以1/2ms培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加1.0～2.0mg/l吲哚丁酸；

(5)煉苗和移植栽培：生根培養(yǎng)后進(jìn)行煉苗，再移栽至土壤基質(zhì)中進(jìn)行栽培；

(6)出圃；

所述ms培養(yǎng)基中采用水稻淀粉作為凝固劑，以ms培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，水稻淀粉的含量為50g/l，蔗糖含量為20g/l。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在采用水稻淀粉作為凝固劑的ms培養(yǎng)基中水稻淀粉的含量為50g/l，蔗糖含量為20g/l時(shí)，能夠

作為優(yōu)選，步驟(1)中，所述消毒的過(guò)程為：將所述嫩枝先放入體積分?jǐn)?shù)70％的乙醇溶液中浸泡10s后，用無(wú)菌水洗凈，再放入體積分?jǐn)?shù)為2％的次氯酸鈉溶液中消毒10～15min，再無(wú)菌水沖洗3～4次。

作為優(yōu)選，步驟(1)中，所述小段的長(zhǎng)度為0.8～1.0cm。

作為優(yōu)選，步驟(2)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：在光照強(qiáng)度3000～4000lx、溫度25℃±2℃的條件下，光照培養(yǎng)10～12h/d。

作為優(yōu)選，所述水稻淀粉來(lái)源于水稻品種“浙大脂稻1號(hào)”，其特性如下：淀粉的膠稠度＞65mm，熱漿粘度＞2500cp，冷膠粘度＞3000cp，直鏈淀粉含量介于28～30％之間。

作為優(yōu)選，步驟(3)中，所述增殖培養(yǎng)的條件為：在光照強(qiáng)度3000～4000lx、溫度25℃±2℃的條件下，光照培養(yǎng)10～12h/d。

作為優(yōu)選，步驟(4)中，所述生根培養(yǎng)的條件為：在光照強(qiáng)度3000～4000lx、溫度25℃±2℃的條件下，光照培養(yǎng)10～12h/d。

作為優(yōu)選，步驟(5)中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，所述土壤基質(zhì)為60％的泥炭土和40％的珍珠巖，ph值為5.0～6.0。

作為優(yōu)選，步驟(5)中，移栽4周內(nèi)，控制光照強(qiáng)度為2000～4000lx；移栽4周后，控制光照強(qiáng)度為4000～6000lx；培養(yǎng)溫度均為20～25℃。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明在誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中采用水稻淀粉作為ms培養(yǎng)基中的凝固劑，并配合適宜的蔗糖含量，既顯著降低了三葉青組培苗規(guī)模繁育的培養(yǎng)成本，又提高了三葉青組培苗的木質(zhì)化程度，使組培苗的苗粗根壯，縮短煉苗所需時(shí)間，提高移栽成活率。

(2)本發(fā)明在誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中采用水稻淀粉作為ms培養(yǎng)基中的凝固劑，在支撐組培體的同時(shí)，可以有效提供碳源促進(jìn)愈傷組織的增殖，使幼苗更好地生長(zhǎng)。

(3)與傳統(tǒng)的瓊脂相比，本發(fā)明采用的水稻淀粉成本低，主要體現(xiàn)在兩方面：一方面，淀粉作為凝固劑替代瓊脂，在保證培養(yǎng)基對(duì)組培體起支撐作用的前提下，成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于瓊脂，這使得大規(guī)模生產(chǎn)的成本顯著降低；另一方面，淀粉屬于糖類，可作為碳源為植物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，表現(xiàn)出組培促生長(zhǎng)效益，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中三葉青愈傷組織接種到增殖培養(yǎng)基2周后的培養(yǎng)基質(zhì)的重量。

圖2為實(shí)施例1中三葉青組織增殖培養(yǎng)后的幼苗接種到生根培養(yǎng)基中3周后的苗高、根長(zhǎng)和根數(shù)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡釋。

實(shí)施例1

本實(shí)施例采用的“中澤1號(hào)”是由浙江大學(xué)和浙江省中藥研究所合作選育的產(chǎn)量與藥效兼顧的三葉青優(yōu)良品種，該品種可購(gòu)買(mǎi)于杭州中澤生物科技有限公司或浙江大學(xué)。

采用的淀粉凝固劑來(lái)源于特用的水稻品種“浙大脂稻1號(hào)”，系浙江大學(xué)選育，其特性如下：淀粉的膠稠度＞65mm，熱漿粘度＞2500cp，冷膠粘度＞3000cp，直鏈淀粉含量介于28～30％之間。

針對(duì)上述品種，本發(fā)明提供一種具體地三葉青組培苗的生產(chǎn)方法，具體步驟如下：

(1)外植體的選擇：2014年冬季(12月上旬)，選擇無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)病菌侵染的生長(zhǎng)健壯的10株“中澤1號(hào)”三葉青上的當(dāng)年生嫩枝。

(2)外植體的處理與接種：用洗滌劑水刷洗，經(jīng)自來(lái)水沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)(sw-cj系列)上將外植體嫩枝先放入70％乙醇溶液中，浸泡10s后，用無(wú)菌水洗凈，再放入2％次氯酸鈉溶液中消毒15min后，無(wú)菌水沖洗3次；用無(wú)菌的解剖刀、鑷子將嫩枝切成0.8cm的小段，每段保證含1個(gè)腋芽。

(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟(2)獲得的小段接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(培養(yǎng)皿直徑75mm)中，每瓶10段小段，芽朝上插入培養(yǎng)基中，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到愈傷組織；

誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms培養(yǎng)基添加0.35mg/l芐氨基腺嘌呤和0.03mg/l萘乙酸；其中，ms培養(yǎng)基中采用水稻淀粉作為凝固劑，以培養(yǎng)基的體積計(jì)，淀粉的添加量為50g/l，蔗糖含量為20g/l；

前期進(jìn)行暗培養(yǎng)，待芽萌發(fā)后再進(jìn)行光培養(yǎng)；其中，光照強(qiáng)度為3000lx，光照時(shí)間為10h/d，培養(yǎng)溫度為25℃±2℃；待小苗長(zhǎng)至5cm以上時(shí)，切段進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

(4)增殖培養(yǎng)：將步驟(3)獲得的小段接種于增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行增殖培養(yǎng)；

增殖培養(yǎng)基為ms培養(yǎng)基添加2.5mg/l芐氨基腺嘌呤和0.2mg/l萘乙酸；其中，ms培養(yǎng)基中采用水稻淀粉作為凝固劑，以培養(yǎng)基的體積計(jì)，淀粉的添加量為50g/l，蔗糖含量為20g/l；

培養(yǎng)溫度為25℃±2℃，光照強(qiáng)度為3000lx，光照時(shí)間為10h/d；待小苗長(zhǎng)至2cm以上時(shí)，切斷進(jìn)行生根培養(yǎng)。

(5)生根培養(yǎng)：將步驟(4)獲得的小段接種于生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)；

生根培養(yǎng)基為1/2ms培養(yǎng)基添加1.5mg/l吲哚丁酸；其中，ms培養(yǎng)基中采用水稻淀粉作為凝固劑，以培養(yǎng)基的體積計(jì)，淀粉的添加量為50g/l，蔗糖含量為20g/l；

培養(yǎng)溫度為25℃±2℃，光照強(qiáng)度為4000lx，光照時(shí)間為12h/d；待小苗長(zhǎng)至5cm以上時(shí)，移至溫室煉苗。

(6)組培苗的煉苗和移植：將培養(yǎng)瓶置于25±3℃的溫室中，自然散射光下，封口煉苗3d，再開(kāi)口煉苗3d，然后開(kāi)口煉苗時(shí)可在培養(yǎng)基表面灑一層薄薄的水；煉苗結(jié)束后，打開(kāi)培養(yǎng)瓶蓋，加水將培養(yǎng)基打散倒出，清水洗凈小苗后，移植于穴盤(pán)中；其中，穴盤(pán)中的移植基質(zhì)為質(zhì)量分?jǐn)?shù)60％的泥炭土+質(zhì)量分?jǐn)?shù)40％的珍珠巖。

(7)組培苗移植后的栽培管理：移栽時(shí)澆足水分，以后每3d淋水1次；定植后3周，相對(duì)濕度80％，當(dāng)?shù)谝黄律~完全展開(kāi)后，相對(duì)濕度降至70％；移栽4周內(nèi)，光照強(qiáng)度3000lx，4周后增加光照強(qiáng)度至5000lx，并可噴淋澆水；整個(gè)育苗期，溫度為25℃；移栽第4～8周，每周噴施液肥1次，液肥中n：p：k＝20：10：20，稀釋1500倍液使用；及時(shí)防治苗期病蟲(chóng)害。

(8)出圃：組培苗移栽2個(gè)月左右，新根長(zhǎng)至5條以上，平均根長(zhǎng)超過(guò)3cm，新葉4～5片以上，植株生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害、葉色翠綠即可出圃。

以上述采用水稻淀粉作為凝固劑的ms培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱水稻淀粉組)為處理；原始ms培養(yǎng)基(凝固劑為瓊脂的ms培養(yǎng)基，簡(jiǎn)稱瓊脂組)作為對(duì)照，進(jìn)行組培苗的生產(chǎn)，其他步驟相同。

將三葉青愈傷組織接種到增殖培養(yǎng)基中2周后，對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行稱重。

如圖1所示，瓊脂組鮮重增長(zhǎng)平均僅為0.13g；水稻淀粉組的鮮重增長(zhǎng)平均高達(dá)0.24g，增加近1倍，水稻淀粉的加入明顯促進(jìn)了增殖效應(yīng)。

將三葉青組織增殖培養(yǎng)后的幼苗接種到生根培養(yǎng)基中3周后，調(diào)查苗高、根長(zhǎng)與根數(shù)。

如圖2所示，瓊脂組的苗高平均為23.5厘米，根長(zhǎng)7.3厘米，根數(shù)9.5；水稻淀粉組的苗高平均為27.8厘米，根長(zhǎng)13.7厘米，根數(shù)17.2，表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)效應(yīng)，顯示淀粉基質(zhì)在支撐組培體的同時(shí)，可以有效提供碳源、促進(jìn)三葉青組培苗的生產(chǎn)效應(yīng)。

對(duì)比瓊脂組和水稻淀粉組移栽苗的折干率，瓊脂組為9.8％，水稻淀粉組為12.3％；對(duì)比煉苗時(shí)間瓊脂組平均為45天，水稻淀粉組平均時(shí)間為15天；對(duì)比煉苗20天移栽成活率瓊脂組86.4％，水稻淀粉組97.1％。