本發(fā)明一般地涉及從雙孢蘑菇(agaricus?bisporus)株中排除攻擊性不相容(aggressive?incompatibility)性狀(也稱為ai性狀)的方法。還公開了與該方法相關的多種新菌株和株系。

背景技術：

1、本發(fā)明在如美國專利no.10,440,930中所公開的，由sylvan?america,inc.開發(fā)的命名為j15987(nrrl保藏號67646)的較早的白色雜交蘑菇株的發(fā)布之后，該專利的公開內(nèi)容作為參考并入本文。株j15987比目前主要的白色栽培品種具有更高的產(chǎn)量并且生產(chǎn)更高質(zhì)量的蘑菇，這意味著這些蘑菇與從商業(yè)可接受的命名為a-15的株所獲得的標準商品化白色蘑菇相比，具有更厚的菌蓋肉質(zhì)，并且具有更少的紅色。在株j15987的早期測試中，消費者對產(chǎn)量和質(zhì)量的強大組合非常滿意，這使得這些蘑菇和該株最初在商業(yè)上非常受歡迎。然而，出現(xiàn)了一個問題。據(jù)發(fā)現(xiàn)株j15987包含一種前所未有的表型或性狀，其被稱為“攻擊性不相容性”，當這些農(nóng)場也使用株a-15或類似株時，這會導致在蘑菇農(nóng)場層面出現(xiàn)問題。因此，需要一種將從類似于j15987的白色蘑菇株中排除“攻擊性不相容性”(如以下所定義的)的表型或性狀的方法，并且開發(fā)保留或另外提供株j15987的良好性狀(如高產(chǎn)量和/或高質(zhì)量)，同時排除攻擊性不相容性(ai)性狀的這些類似的白色蘑菇株。

2、食用蘑菇，雙孢蘑菇(lange)imbach雙孢品種(agaricus?bisporus(lange)imbachvar.bisporus)是擔子菌類真菌，在全世界種植。在歐洲和美洲，它是最廣泛種植的蘑菇物種。2020-21年，美國每年的作物價值為約10億美元(國家農(nóng)業(yè)統(tǒng)計局/usda數(shù)據(jù))。

3、以與其它微生物類似的方式在無菌培養(yǎng)基上制備、維持、繁殖和儲存?zhèn)憔鷮?agaricus)培養(yǎng)物。在無菌區(qū)內(nèi)使用無菌工具和無菌技術來操作用于多種目的的純培養(yǎng)物，包括孢子萌發(fā)、制備新的雜交體和制備接種物。商品化培養(yǎng)基是“菌種體”，其可以具有一些不同配方，最常見的是無菌小米或黑麥。菌種體的生產(chǎn)通常是大規(guī)模的。例如，1升純傘菌屬接種物可用于14,0000升滅菌的菌種體。最終用戶，即蘑菇農(nóng)場接受位于無菌包裝內(nèi)的純菌種體培養(yǎng)物。

4、在蘑菇農(nóng)場專門建造的構(gòu)造內(nèi)商業(yè)種植蘑菇。盡管在方法上有多種變化，但以下描述了典型的方法。堆肥是從廢棄的木質(zhì)纖維素材料，如小麥秸稈制備的，添加了含氮材料，完成并轉(zhuǎn)移至特定條件下(有氧，溫度在40和50℃之間)進行巴氏殺菌，借此產(chǎn)生有利于傘菌屬定殖的基質(zhì)。加入蘑菇菌種體，并在受控溫度下在基質(zhì)中定殖11至17天。一旦定殖或“菌種體運行(菌種體擴散，spawn?run)”完成，則在堆肥表面施加無營養(yǎng)的飽和泥炭層(用甜菜石灰將ph調(diào)節(jié)至8至8.5之間)至約5cm的層。另外，可以將覆蓋菌種體(casing?spawn)添加至泥炭或覆蓋層中以加速菌絲體生長。一旦發(fā)生定殖，在稱為“出菇潮”的過程中調(diào)節(jié)環(huán)境條件，其中空氣溫度降至約18-19℃，并且co2降至約1300ppm。在施加覆土(覆蓋土壤)后的第13至18天，菇房內(nèi)將出菇。在3至4天的時間段內(nèi)收獲蘑菇。在移除和替換蘑菇農(nóng)場上的堆肥之前，生產(chǎn)和收獲額外的生產(chǎn)出菇潮(flush)或爆發(fā)(break)。

5、在美國，2020-21年總收獲量的72％是白色傘菌屬，其余是棕色傘菌屬品種。同期，美國蘑菇作物的總價值超過10億美元。在其它地區(qū)，人們對白色蘑菇有更強烈的偏好。在美國和其它地方，對于白色蘑菇，市場對于表型性狀，如大小、形狀、白度、硬度以及相關性狀，如延長的貨架期的要求是狹窄且精確的。因此，新的白色傘菌屬菌株應符合一套特定的市場要求。可以基于一些性狀來分離菌株，例如，菌蓋形狀(例如，菌蓋圓度、菌肉厚度、菌柄粗度)、顏色(白度)、密度/硬度(牢固度，firmness)和單重(piece?weight)。新的白色蘑菇株的商品化目標的一些實例是提高的作物產(chǎn)量、改變的整個生產(chǎn)出菇潮中的產(chǎn)量分布、抗病性、抗蟲性、改善的貨架期、減少的壓傷、易于管理、對機械收獲的適用性、對應激源(例如，溫度或基質(zhì)變化)的差異反應、季節(jié)影響、農(nóng)場實踐和菌株不相容性。還可以使用dna標志物技術，如單核苷酸多態(tài)性(snp)，將菌株彼此區(qū)分和分離。菌株可以具有不同的祖先，這將直接反映基因型和表型。

6、大約在1980年，荷蘭霍斯特(horst)的一個實驗室培育出了最早兩個真正的雙孢蘑菇(a.bisporus)雜交株。這兩個被稱為u1和u3的“horst”菌株是由兩組已有的白色菌株，即預雜交的光滑白色株(phsw)和預雜交的灰白色株(phow)交配所產(chǎn)生的密切相關的雜交體，如m.imbernon等人,mycologia,88(5),749-761(1996)中所述，該文獻作為參考并入本文。隨著時間的推移，雜交株u1成為市場上主要的白色基因型。

7、通過使培養(yǎng)物去異核化來回收株u1的親代同核體。phsw親代是h39，而phow親代是h97。a.sonnenberg將h97以保藏號10389保藏在美國堪薩斯州的真菌遺傳學保藏中心(fungal?genetics?stock?center)，并且還以保藏號mya-4626保藏在美國模式培養(yǎng)物保藏所。聯(lián)合基因組計劃(california,usa)對h97基因組進行了測序并將其置于公共領域，并且該基因組已被證明作為單核苷酸多態(tài)性(snp)檢測的參考而非常有價值(參見下文)。

8、株u1是目前在北美洲和歐洲培養(yǎng)的所有白色菌株的祖代。多種蘑菇株，如a-15和s-130符合u1的實質(zhì)衍生品種(edv)標準，它們是從原始(即初始)菌株的孢子或組織發(fā)育而來的。通過體細胞選擇或孢子培養(yǎng)，或如以下所討論的“實質(zhì)衍生”的相關方法，從單一祖代所開發(fā)的菌株組群被稱為衍生譜系組。除了相對較小的遺傳差異外，從u1衍生譜系組內(nèi)所開發(fā)的所有白色菌株與原始菌株u1共有單一的復合n+n異核基因型。除了中國明顯不同之外，現(xiàn)代白色蘑菇栽培是單一栽培(monoculture)。

9、雙孢蘑菇具有被稱為同宗異宗配合(amphithallism)的生殖綜合征，其中兩個不同生命周期同時進行。與其它真菌中一樣，生殖繁殖體是孢子。傘菌屬在被稱為擔子的厚孢子囊(meiosporangium)上通過減數(shù)分裂產(chǎn)生孢子。在第一個生命周期中，雙孢蘑菇孢子分別接受單個單倍體減數(shù)分裂后的核；這些孢子能夠交配，但不能產(chǎn)生蘑菇。這些單倍體孢子萌發(fā)產(chǎn)生同核子代或系，其可與其它相容(親和)的同核體交配以產(chǎn)生有能力產(chǎn)生蘑菇的新型雜交異核體。異核體通常顯示出比同核體差得多的交配能力。這種生命周期被稱為異宗配合(heteromixis)，其類似于遠交。該生命周期起作用，但通常在雙孢蘑菇雙孢品種(agaricus?bisporus?var.bisporus)菌株中不占優(yōu)勢。

10、第二生命周期被稱為內(nèi)源雜交(intramixis)，其類似于近親繁殖的形式，在大多數(shù)雙孢蘑菇雙孢品種菌株中占優(yōu)勢。大多數(shù)孢子接受兩個減數(shù)分裂后的核，并且大多數(shù)這些核對由非姊妹核對(nsnp)組成，其在包括mat基因座的大多數(shù)或所有著絲粒連鎖基因座處具有異等位基因基因型。mat基因型決定了這些后代由此而來的異核表型，這些子代具有繁殖能力并且可以生產(chǎn)蘑菇作物。不尋常地，在真核生物中，在雙孢蘑菇的減數(shù)分裂后的子代中觀察到發(fā)生了相對較少的染色體交叉(chromosomal?crossing-over)；根據(jù)經(jīng)驗，在異核菌株的異核內(nèi)源雜交(intramictic)子代中，很少有異等位性(類似于雜合性)丟失。

11、在這兩個生命周期中，孢子是作為蘑菇的一部分的細胞；該細胞是始終作為其單一親代具有蘑菇和產(chǎn)生蘑菇的培養(yǎng)物的繁殖體。

12、就孢子而言，活孢子是處于休眠狀態(tài)的異核體或同核體。孢子是蘑菇生物(有機體)培養(yǎng)物的一部分；它們只摻入產(chǎn)生它們的單一培養(yǎng)物(為方便起見，通常稱為“親代”)的基因材料(遺傳物質(zhì))。培養(yǎng)物的其它部分包括菌蓋、菌柄、菌褶、細胞(定義為摻入核、線粒體、細胞質(zhì)、原生質(zhì)體、rna、dna、蛋白質(zhì)、細胞膜和細胞壁(包括交叉壁)的菌絲室(菌絲區(qū)室，hyphal?compartment))、菌絲和菌絲體?？梢栽跓o菌材料上無菌收集孢子，以多種稀釋度在無菌水中混懸，并鋪板到無菌瓊脂生長培養(yǎng)基上，以產(chǎn)生萌發(fā)的孢子和摻入孢子內(nèi)的培養(yǎng)物。優(yōu)選的技術將在封閉的培養(yǎng)皿內(nèi)具有活的傘菌屬培養(yǎng)物，其可以通過揮發(fā)性信息素的擴散刺激孢子萌發(fā)。萌發(fā)的孢子可以在顯微鏡下使用無菌顯微工具，如鋼針分離到新鮮的營養(yǎng)瓊脂平板上。使用該方法，可以獲得包含孢子的菌株的異核和同核子代，以及摻入到所述菌株的孢子內(nèi)的培養(yǎng)物。

13、通過異宗配合的新型雜交品種的開發(fā)包括兩個相容(親和)的培養(yǎng)物的受控物理結(jié)合和交配以獲得新型異核體培養(yǎng)物。同核體(＝“系”)是用于進行交配的優(yōu)選起始培養(yǎng)物，因為它們具有與其它培養(yǎng)物接合并實現(xiàn)胞質(zhì)融合的最大能力。異核體也可以置于物理接觸，但導致成功形成新型異核體的交配概率不合理地低。相容性(親和性)由mat基因座處的基因型決定；具有相同mat等位基因的兩個同核體在接合后不能建立異核體，因此同核體相容性代表遺傳相異性。在確定的交配程序中，獲得同核系，并以預定的成對組合相結(jié)合。在一種方法中，可以將同核體對緊密靠近地放置在培養(yǎng)皿中的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的表面上并使其生長在一起(處于物理結(jié)合)，此時兩種培養(yǎng)物之間發(fā)生點接合(point?anastomoses)。成功的結(jié)果是提供異核體的交配。通過從培養(yǎng)皿的融合區(qū)轉(zhuǎn)移菌絲體，可以獲得新型雜交異核體。

14、出于兩種原因，相對于u1衍生的譜系群，顯然需要商業(yè)上可接受的具有不同基因型的白色雙孢蘑菇株。首先，已知與u1衍生的譜系群的菌株營養(yǎng)不相容的菌株延緩病毒病在菌株之間的傳播，并且已知這些疾病是商品化蘑菇產(chǎn)業(yè)中作物損失的主要原因。其次，眾所周知，當農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)廣泛依賴于具有單一遺傳譜系的作物時(如世界上大多數(shù)地方的白色雙孢蘑菇)，在整個設施或整個產(chǎn)業(yè)范圍內(nèi)發(fā)生災難性作物歉收的風險就會增加。因此，從糧食安全和風險管理的角度來看，非常期望同時提供基因多樣化和商業(yè)上可接受的性能和作物特征兩者。

15、如以上所提及的，本發(fā)明是雜交株j15987(nrrl保藏號67646)的商業(yè)發(fā)布的直接結(jié)果，該雜交株是白色雜交株(美國專利no.10,440,930)。商品化前測試表明，與來自株a-15的其它白色栽培種相比，株j15987具有更厚的菌蓋肉質(zhì)和更粗的菌柄。另外，使用minolta色度計對j15987進行的顏色分析表明收獲后蘑菇蓋上的紅色較少。商品化潛力被認為是重要的，并且該菌株在專利申請后直接在美國種植。它成功符合了所有原始作物的生產(chǎn)標準。然而，出現(xiàn)了一個顯著的問題。據(jù)觀察，在一些蘑姑種植“屋”(或房間)中，特別是在生產(chǎn)來自株a-15的蘑菇的地方，在堆肥和覆蓋層兩者內(nèi)，都有大面積沒有蘑菇生長的堆肥。很明顯，這種觀察現(xiàn)象是不正常且不尋常的。

16、將培養(yǎng)物返回到測試設施，在此更詳細地研究了株j15987和其它白色栽培種之間的可疑拮抗相互作用。株-株相互作用的遺傳學是由自身/非自身識別系統(tǒng)控制的，這也被稱為營養(yǎng)不相容性(vegetative?incompatibility)，或者稱為異核體不相容性。據(jù)發(fā)現(xiàn)株j15987在與其它u1家族實質(zhì)衍生品種(edv)，如a-15接觸時具有非常具攻擊性的(強烈的，aggressive)、不尋常的拮抗反應。當菌種體以低至99％?a-15比1％j15987的比例混合時，傘菌屬菌絲體迅速死亡，并且a-15基因型最終被j15987取代。這種相互作用被稱為“攻擊性不相容性(aggressive?incompatibility)”，并將這種相互作用縮寫為“ai”，所述表型被定義為“ai”性狀。需要明確的是，包括雙孢蘑菇的不相關的擔子菌株通常表現(xiàn)出不相容性反應，這已被用于病毒控制，但ai性狀是更常見現(xiàn)象的更具攻擊性、更極端且更有問題的表現(xiàn)。據(jù)推測，這種性狀受遺傳控制，正如通常對擔子菌中的營養(yǎng)不相容性所理解的情況一樣。

17、蘑菇農(nóng)場上的常規(guī)混合設備傾向于以使得不同菌株的接種基質(zhì)之間可以發(fā)生一定程度混合的方式運行。這些事件通常較小，且具有適度的負面影響。因為這些區(qū)域很小，它們對總產(chǎn)量的影響最低，并且傳統(tǒng)上是能容忍的。然而，更大且更極端的ai相互作用的影響過大以至于在商業(yè)上不能容忍，并且消費者(客戶)的評價是在株a-15也在培養(yǎng)的農(nóng)場操作中，無法有利地處理株j15987。因此，需要具有株j15987的積極屬性同時還缺少ai性狀的一種或多種商業(yè)上期望的菌株。

技術實現(xiàn)思路

1、為了理解和克服(排除)導致株j15987中ai性狀表現(xiàn)的潛在遺傳基礎，開發(fā)了一系列交配并分析了所產(chǎn)生的雜交體。在以下方案i中描述了交配方案。本質(zhì)上，野生變異系(即b18287-s82，nrrl保藏號68168)與株j15987的同核親代之一(即wbl-s290，nrrl保藏號68167)組合以產(chǎn)生新的f1雜交株(即j19109，nrrl保藏號68163)。然后，將來自該雜交株的同核體(例如，系j19109-s40，nrrl保藏號68165)與株j15987的另一同核親代(即j11500-s80，nrrl保藏號68164)交配以提供新的f2雜交株(例如，j20176，nrrl保藏號68166)。與f2雜交株對抗(confrontation)以證實ai性狀的存在或不存在?；谶@些對抗，很明顯交配方案是成功的，并且大多數(shù)新的雜交(體)都沒有ai性狀。遺傳模式允許進一步開發(fā)ai性狀的遺傳控制/排除模型。

2、方案1

3、

4、首先揭示了：從由兩個同核體(即，w01-s1和so76-s12b)交配所產(chǎn)生的雜交株獲得的同核體(系b18287-s82)是必需的。該同核系b18287-s82是從20世紀90年代由r.kerrigan在北美洲收集的野生株w01和預雜交灰白色株so76所獲得的親代同核體開發(fā)而來的。dna測試表明w01是真正的野生株，而不是逃逸的商業(yè)株。此外，w01與目前的白色和棕色菌株具有非常類似的生長要求。

5、因此，本發(fā)明的一個方面一般地涉及命名為b18287-s82的雙孢蘑菇的新的獨特的同核系，以及使用命名為b18287-s82的株系的方法。在至少一個實施方式中，提供了包含雙孢蘑菇系b18278-s82的至少一組染色體的培養(yǎng)物，其中所述至少一組(set)染色體包含下表i中列出的序列表征的標志物基因座處的系b18278-s82的所有等位基因。如本文所公開的，雙孢蘑菇系b18287-s82的培養(yǎng)物的保藏已由農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心(nrrl)(1815north?university?street,peoria,illinois?61604usa)做出并接受。保藏日期為2022年6月10日。所保藏的培養(yǎng)物取自由sylvan,inc.,kittanning,pennsylvania,usa(登記受讓人)在本發(fā)明申請?zhí)峤蝗掌谥氨４娴南嗤囵B(yǎng)物。對保藏的所有限制都已取消，并且保藏旨在滿足美國專利和商標局的所有保藏要求，包括37c.f.r.sec.1.801-1.809，以及布達佩斯條約規(guī)定的所有保藏要求。nrrl保藏號為68168。保藏將在保藏所保存30年，或在最后一次請求后保存5年，或在專利有效期內(nèi)保存，以時間較長者為準，并將在此期間根據(jù)需要進行更換。以適用的專利法要求的為準，在提交專利申請或頒發(fā)專利后，培養(yǎng)物將不可撤銷地且無限制地或無條件地向公眾發(fā)布。

6、在一個實施方式中，可以提供系b18287-s82的實質(zhì)衍生品種(基本衍生品種，essentially?derived?variety)(edv)。該edv可以包括衍生自初始培養(yǎng)物的培養(yǎng)物，其中所述初始培養(yǎng)物是系b18287-s82的培養(yǎng)物，從而使得其基因組或基因型的至少75％存在于系b18287-s82的初始培養(yǎng)物的基因組或基因型中。在其它實施方式中，其基因組或基因型的至少90％或95％或98％或99％存在于系b18287-s82的初始培養(yǎng)物的基因組或基因型中。在其它實施方式中，該edv可以包括直接或僅僅衍生自初始培養(yǎng)物的培養(yǎng)物，從而使得其基因組或基因型全部存在于系b18287-s82的初始培養(yǎng)物的基因組或基因型中。

7、將b18287-s82同核體與wbl-s290交配。應注意，該系是目前存在于株j15987中的親代同核體之一(另一個是j11500-s80，其也用于本發(fā)明)。將所得的f1異核體株命名為j19109。

8、因此，本發(fā)明的另一個方面一般地涉及命名為wbl-s290的雙孢蘑菇的新的獨特的同核系，以及使用命名為wbl-s290的系的方法。在至少一個實施方式中，提供了包含雙孢蘑菇系wbl-s290的至少一組染色體的培養(yǎng)物，其中所述至少一組染色體包含下表i中列出的序列表征的標志物基因座處的系wbl-s290的所有等位基因。如本文所公開的，雙孢蘑菇系wbl-s290的培養(yǎng)物的保藏已由農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心(nrrl)(1815northuniversity?street,peoria,illinois?61604usa)做出并接受。保藏日期為2022年6月10日。所保藏的培養(yǎng)物取自由sylvan,inc.,kittanning,pennsylvania,usa(登記受讓人)在本發(fā)明申請?zhí)峤蝗掌谥氨４娴南嗤囵B(yǎng)物。對保藏的所有限制都已取消，并且保藏旨在滿足美國專利和商標局的所有保藏要求，包括37c.f.r.sec.1.801-1.809，以及布達佩斯條約規(guī)定的所有保藏要求。nrrl保藏號為68167。保藏將在保藏所保存30年，或在最后一次請求后保存5年，或在專利有效期內(nèi)保存，以時間較長者為準，并將在此期間根據(jù)需要進行更換。以適用的專利法要求的為準，在提交專利申請或頒發(fā)專利后，培養(yǎng)物將不可撤銷地且無限制地或無條件地向公眾發(fā)布。

9、在一個實施方式中，可以提供系wbl-s290的實質(zhì)衍生品種(edv)。該edv可以包括衍生自初始培養(yǎng)物的培養(yǎng)物，其中所述初始培養(yǎng)物是系wbl-s290的培養(yǎng)物，從而使得其基因組或基因型的至少75％存在于系wbl-s290的初始培養(yǎng)物的基因組或基因型中。在其它實施方式中，其基因組或基因型的至少90％或95％或98％或99％存在于系wbl-s290的初始培養(yǎng)物的基因組或基因型中。在其它實施方式中，該edv可以包括直接或僅僅衍生自初始培養(yǎng)物的培養(yǎng)物，從而使得其基因組或基因型全部存在于系wbl-s290的初始培養(yǎng)物的基因組或基因型中。

10、本發(fā)明的另一個方面一般地涉及命名為j19109的新的獨特的雙孢蘑菇株培養(yǎng)物；它是經(jīng)由兩個同核培養(yǎng)物b18287-s82和wbl-s290的直接交配所獲得的雜交株。株j19109的培養(yǎng)物的保藏已由農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心(nrrl)(1815north?university?street,peoria,illinois?61604usa)做出并接受。保藏日期為2022年6月10日。所保藏的培養(yǎng)物取自由sylvan,inc.,kittanning,pennsylvania,usa(登記受讓人)在本發(fā)明申請?zhí)峤蝗掌谥氨４娴南嗤囵B(yǎng)物。對保藏的所有限制都已取消，并且保藏旨在滿足美國專利和商標局的所有保藏要求，包括37c.f.r.sec.1.801-1.809，以及布達佩斯條約規(guī)定的所有保藏要求。nrrl保藏號為68163。保藏將在保藏所保存30年，或在最后一次請求后保存5年，或在專利有效期內(nèi)保存，以時間較長者為準，并將在此期間根據(jù)需要進行更換。根據(jù)專利法，在提交優(yōu)先權(quán)申請或頒發(fā)該株的專利后，培養(yǎng)物將不可撤銷地且無限制地或無條件地向公眾發(fā)布。

11、在一個實施方式中，可以提供株j19109的實質(zhì)衍生品種(edv)。該edv可以包括衍生自初始培養(yǎng)物的雙孢蘑菇的培養(yǎng)物，其中所述初始培養(yǎng)物是株j19109的培養(yǎng)物，從而使得其基因組或基因型的至少75％存在于株j19109的初始培養(yǎng)物的基因組或基因型中。作為另外一種選擇，其它edv可以包括直接衍生自株j19109的初始培養(yǎng)物的培養(yǎng)物，從而使得其全部基因組或基因型存在于株j19109的初始培養(yǎng)物的基因組或基因型中。

12、重申一遍，將命名為b18287-s82的雜交蘑菇系的培養(yǎng)物(該系的代表性培養(yǎng)物已以nrrl保藏號68168保藏)與命名為wbl-s290的白色蘑菇系的培養(yǎng)物(該系的代表性培養(yǎng)物已以nrrl保藏號68167保藏)交配以獲得命名為j19109的f1雜交蘑菇株(其代表性培養(yǎng)物已以nrrl保藏號68163保藏)。然后，將命名為j19109的f1株的培養(yǎng)物進行結(jié)實(收獲，fruit)以從其獲得同核孢子，由此獲得同核系。然后，選擇來自f1株j19109的同核系培養(yǎng)物。值得注意地，來自f1株j19109的同核系在染色體4、7和9上的系wbl-s290的著絲粒連鎖基因座處缺少等位基因。

13、在從f1株j19109中選擇同核系培養(yǎng)物后，將該培養(yǎng)物與命名為j11500-s80的蘑菇系的培養(yǎng)物交配，該蘑菇系被指出為目前存在于株j15987中的另一個親代同核體。從該交配獲得了所得的f2雜交蘑菇株，并對所得的f2雜交蘑菇株的培養(yǎng)物進行測試以確定ai性狀的存在或不存在，其中在不存在ai性狀的情況下，已從f2雜交蘑菇株中排除了ai性狀。

14、因此，本發(fā)明的另一個方面一般地涉及命名為j11500-s80的雙孢蘑菇的新的獨特的同核系，以及使用命名為j11500-s80的系的方法。在至少一個實施方式中，提供了包含雙孢蘑菇系j11500-s80的至少一組染色體的培養(yǎng)物，其中所述至少一組染色體包含下表i中列出的序列表征的標志物基因座處的系j11500-s80的所有等位基因。如本文所公開的，雙孢蘑菇系j11500-s80的培養(yǎng)物的保藏已由農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心(nrrl)(1815north?university?street,peoria,illinois?61604usa)做出并接受。保藏日期為2022年6月10日。所保藏的培養(yǎng)物取自由sylvan,inc.,kittanning,pennsylvania,usa(登記受讓人)在本發(fā)明申請?zhí)峤蝗掌谥氨４娴南嗤囵B(yǎng)物。對保藏的所有限制都已取消，并且保藏旨在滿足美國專利和商標局的所有保藏要求，包括37c.f.r.sec.1.801-1.809，以及布達佩斯條約規(guī)定的所有保藏要求。nrrl保藏號為68164。保藏將在保藏所保存30年，或在最后一次請求后保存5年，或在專利有效期內(nèi)保存，以時間較長者為準，并將在此期間根據(jù)需要進行更換。以適用的專利法要求的為準，在提交專利申請或頒發(fā)專利后，培養(yǎng)物將不可撤銷地且無限制地或無條件地向公眾發(fā)布。

15、在一個實施方式中，可以提供系j11500-s80的實質(zhì)衍生品種(edv)。該edv可以包括衍生自初始培養(yǎng)物的培養(yǎng)物，其中所述初始培養(yǎng)物是系j11500-s80的培養(yǎng)物，從而使得其基因組或基因型的至少75％存在于系j11500-s80的初始培養(yǎng)物的基因組或基因型中。在其它實施方式中，其基因組或基因型的至少90％或95％或98％或99％存在于系j11500-s80的初始培養(yǎng)物的基因組或基因型中。在其它實施方式中，該edv可以包括直接或僅僅衍生自初始培養(yǎng)物的培養(yǎng)物，從而使得其基因組或基因型全部存在于系j11500-s80的初始培養(yǎng)物的基因組或基因型中。

16、將進一步理解，在一個或多個實施方式中，排除ai性狀的f2雜交株將保留在株j15987中存在的至少兩個有益性狀。這些有益性狀可以選自：與株j15987的菌蓋形狀一樣圓的菌蓋形狀、與株j15987的菌柄一樣粗的菌柄、與株j15987的菌肉一樣厚的菌肉以及在l-a-b色彩測量標度上在株j15987的紅色度(a)值的10％或5％或2.5％或1％或0.5％內(nèi)的紅色度(a)值。將理解術語“與……一樣圓”和“與……一樣粗”(“與……一樣厚”)是指如所測量的，f2雜交株所結(jié)實蘑菇的菌蓋、菌柄和/或菌肉在株j15987所結(jié)實蘑菇的菌蓋、菌柄或菌肉的圓度或粗度(厚度)的統(tǒng)計學顯著性范圍內(nèi)。在替代實施方式中，f2雜交株的蘑菇的菌蓋形狀的圓度可以在株j15987的蘑菇的菌蓋形狀的圓度的20％或15％或10％或5％內(nèi)。在其它替代實施方式中，f2雜交株的蘑菇的菌柄的粗度可以在株j15987的蘑菇的菌柄的粗度的20％或15％或10％或5％內(nèi)。在其它替代實施方式中，f2雜交株的蘑菇的菌肉的厚度可以在株j15987的蘑菇的菌肉的厚度的20％或15％或10％或5％內(nèi)。

17、在一個實施方式中，選自f1株j19109的同核系可以是命名為j19109-s40的同核系。將理解將命名為j19109-s40的系培養(yǎng)物與命名為j11500-s80的蘑菇系交配，其中產(chǎn)生命名為j20176的f2雜交株。已發(fā)現(xiàn)雜交株j20176不具有ai性狀。

18、因此，本發(fā)明的另一個方面一般地涉及命名為j19109-s40的雙孢蘑菇的新的獨特的同核系，以及使用命名為j19109-s40的系的方法。在至少一個實施方式中，提供了包含雙孢蘑菇系j19109-s40的至少一組染色體的培養(yǎng)物，其中所述至少一組染色體包含下表i中列出的序列表征的標志物基因座處的系j19109-s40的所有等位基因。如本文所公開的，雙孢蘑菇系j19109-s40的培養(yǎng)物的保藏已由農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心(nrrl)(1815north?university?street,peoria,illinois?61604usa)做出并接受。保藏日期為2022年6月10日。所保藏的培養(yǎng)物取自由sylvan,inc.,kittanning,pennsylvania,usa(登記受讓人)在本發(fā)明申請?zhí)峤蝗掌谥氨４娴南嗤囵B(yǎng)物。對保藏的所有限制都已取消，并且保藏旨在滿足美國專利和商標局的所有保藏要求，包括37c.f.r.sec.1.801-1.809，以及布達佩斯條約規(guī)定的所有保藏要求。nrrl保藏號為68165。保藏將在保藏所保存30年，或在最后一次請求后保存5年，或在專利有效期內(nèi)保存，以時間較長者為準，并將在此期間根據(jù)需要進行更換。以適用的專利法要求的為準，在提交專利申請或頒發(fā)專利后，培養(yǎng)物將不可撤銷地且無限制地或無條件地向公眾發(fā)布。

19、在一個實施方式中，可以提供系j19109-s40的實質(zhì)衍生品種(edv)。該edv可以包括衍生自初始培養(yǎng)物的培養(yǎng)物，其中所述初始培養(yǎng)物是系j19109-s40的培養(yǎng)物，從而使得其基因組或基因型的至少75％存在于系j19109-s40的初始培養(yǎng)物的基因組或基因型中。在其它實施方式中，其基因組或基因型的至少90％或95％或98％或99％存在于系j19109-s40的初始培養(yǎng)物的基因組或基因型中。在其它實施方式中，該edv可以包括直接或僅僅衍生自初始培養(yǎng)物的培養(yǎng)物，從而使得其基因組或基因型全部存在于系j19109-s40的初始培養(yǎng)物的基因組或基因型中。

20、本發(fā)明的另一個方面一般地涉及命名為j20176的新的獨特的雙孢蘑菇株培養(yǎng)物；它是經(jīng)由兩個同核培養(yǎng)物j11500-s80和j19109-s40的直接交配所獲得的雜交株。株j20176的培養(yǎng)物的保藏已由農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心(nrrl)(1815north?universitystreet,peoria,illinois?61604usa)做出并接受。保藏日期為2022年6月10日。所保藏的培養(yǎng)物取自由sylvan,inc.,kittanning,pennsylvania,usa(登記受讓人)在本發(fā)明申請?zhí)峤蝗掌谥氨４娴南嗤囵B(yǎng)物。對保藏的所有限制都已取消，并且保藏旨在滿足美國專利和商標局的所有保藏要求，包括37c.f.r.sec.1.801-1.809，以及布達佩斯條約規(guī)定的所有保藏要求。nrrl保藏號為68166。保藏將在保藏所保存30年，或在最后一次請求后保存5年，或在專利有效期內(nèi)保存，以時間較長者為準，并將在此期間根據(jù)需要進行更換。根據(jù)專利法，在提交優(yōu)先權(quán)申請或頒發(fā)該株的專利后，培養(yǎng)物將不可撤銷地且無限制地或無條件地向公眾發(fā)布。

21、在一個實施方式中，可以提供株j20176的實質(zhì)衍生品種(edv)。該edv可以包括衍生自初始培養(yǎng)物的雙孢蘑菇的培養(yǎng)物，其中所述初始培養(yǎng)物是株j20176的培養(yǎng)物，從而使得其基因組或基因型的至少75％存在于株j20176的初始培養(yǎng)物的基因組或基因型中。作為另外一種選擇，其它edv可以包括直接衍生自株j20176的初始培養(yǎng)物的培養(yǎng)物，從而使得其全部基因組或基因型存在于株j20176的初始培養(yǎng)物的基因組或基因型中。

22、將進一步理解，在一個或多個實施方式中，命名為j20176的f2雜交株排除了ai性狀，并且保留了在株j15987中存在的至少兩個有益性狀。這些有益性狀可以選自：與株j15987的菌蓋形狀一樣圓的菌蓋形狀、與株j15987的菌柄一樣粗的菌柄、與株j15987的菌肉一樣厚的菌肉以及在l-a-b色彩測量標度上在株j15987的紅色度(a)值的10％或5％或2.5％或1％或0.5％內(nèi)的紅色度(a)值。將理解術語“與……一樣圓”和“與……一樣粗”(“與……一樣厚”)是指f2雜交株j20176所結(jié)實蘑菇的菌蓋、菌柄和/或菌肉在株j15987所結(jié)實蘑菇的菌蓋、菌柄或菌肉的圓度或粗度(厚度)的統(tǒng)計學顯著性范圍內(nèi)。在替代實施方式中，f2雜交株j20176的蘑菇的菌蓋形狀的圓度可以在株j15987的蘑菇的菌蓋形狀的圓度的20％或15％或10％或5％內(nèi)。在其它替代實施方式中，f2雜交株j20176的蘑菇的菌柄的粗度(粗細度)可以在株j15987的蘑菇的菌柄的粗度的20％或15％或10％或5％內(nèi)。在其它替代實施方式中，f2雜交株j20176的蘑菇的菌肉的厚度可以在株j15987的蘑菇的菌肉的厚度的20％或15％或10％或5％內(nèi)。

23、可以看出本發(fā)明所述的方法有利地從雙孢蘑菇株(至少包括株j20176)中排除了ai性狀。更具體地，所述方法能夠從源自(系出于)株j10165(也稱為wbl)和株j11500的雙孢蘑菇株排除攻擊性不相容性(ai)性狀(如美國專利no.9,622,428中所公開的)，其中已知將命名為wbl-s290的白色蘑菇系的培養(yǎng)物與命名為j11500-s80的蘑菇系的培養(yǎng)物交配提供了具有ai性狀的命名為j15987的雜交蘑菇株，該株的代表性培養(yǎng)物已以nrrl保藏號67646保藏。

24、相對于從來自f1株j19109的同核孢子獲得同核系培養(yǎng)物，將理解當j19109異核體結(jié)實并收集f2孢子時，最初總計獲得52個同核體，并且在下列表中的幾個表中描述了這些中的16個。將全部52個同核體與j15987的第二親代j11500-s80交配，并對所得菌株的商品化潛力進行廣泛篩選。如下所示的所收集的數(shù)據(jù)表明j15987的有益性狀得到了保持，并且更重要地，大多數(shù)新的j19109×j11500-s80雜交體不具有ai性狀。選擇一個雜交體(株j20176)進行受控測試。該菌株表現(xiàn)穩(wěn)健，并因此是商業(yè)化的有力候選。

25、株j19109的同核系的整個池顯示出與j19109-s40類似的潛力，并且全部被認為是有價值的育種系，其具有生產(chǎn)缺少ai性狀的高質(zhì)量蘑菇雜交體的潛力。

26、j19109衍生的雜交體的用途中的一個用途是生產(chǎn)用于銷售的食用蘑菇作物。因此，從以上所指明的任何株系或菌株的培養(yǎng)物獲得的蘑菇是本發(fā)明的一部分。另一個用途是通過菌株輪換(strain?rotation)和“病毒破壞”效應來改善設施衛(wèi)生。其它用途是將株j19109的基因材料摻入子代和衍生或后代培養(yǎng)物中，包括休眠和萌發(fā)的孢子和原生質(zhì)體。如上所述，還存在其它用途。

27、真菌不尋常的生物學，并且具體地雙孢蘑菇中的內(nèi)源雜交，使得衍生具有基本相同表型的培養(yǎng)物的虛擬拷貝(虛擬復制物，virtual?copy)變得容易和直接。在植物育種中，這些拷貝被稱為實質(zhì)衍生品種或edv。獲得培養(yǎng)物(因此，根據(jù)定義，所述培養(yǎng)物是雙孢蘑菇的單一初始培養(yǎng)物的edv)的方法包括(舉例說明)體細胞選擇、組織培養(yǎng)選擇、單孢子萌發(fā)、多孢子萌發(fā)、自交、重復回交至初始培養(yǎng)物、誘變和轉(zhuǎn)化。以下文獻已報道了雙孢蘑菇的dna-介導的轉(zhuǎn)化：velcko,a.j.jr.,kerrigan,r.w.,macdonald,l.a.,wach,m.p.,schlagnhaufer,c.,and?romaine,c.p.2004,expression?of?novel?genes?in?agaricusbisporus?using?an?agrobacterium-mediated?transformationtechnique.mush.sci.16:591-597，和其中的參考文獻，其作為參考并入本文。轉(zhuǎn)化可以將單個新基因或等位基因引入初始培養(yǎng)物的基因組中。此外，最近關于其它密切相關的真菌的報道提出了通過crispr進行基因編輯的可能性。

28、edv是通過它們的基因型可明確辨別的，它們的基因型主要是或甚至完全是單一初始培養(yǎng)物的亞型(亞群，subset)。存在于雙孢蘑菇edv中的初始基因型的百分比范圍在100％或幾乎100％(在單孢培養(yǎng)和體細胞選擇的情況下)，至99.x％(在通過dna介導的轉(zhuǎn)化修飾的菌株的情況下)，至90-99.x％(在一些單孢子或多孢子選擇或一些誘變的情況下)，至平均至少75-85％(在同胞子代交配(＝自交)和回交到初始培養(yǎng)物的情況下)。多種基因型確定方法，包括以下所描述的方法和本領域熟知的其它方法，可以用于確定存在于另一培養(yǎng)物中的初始培養(yǎng)物的dna的百分比，并用于明確確定兩種培養(yǎng)物之間的關系以及用于操縱或利用初始培養(yǎng)物的任何方法。

29、重復回交到初始培養(yǎng)物也產(chǎn)生了初始培養(yǎng)物的edv。在一個假設的實例中，在該過程的第一連續(xù)重復中，這一代的所得菌株將具有平均約75％的初始菌株的dna，而約25％的dna將由第二菌株或株系提供(貢獻)；當重復該過程時，初始菌株的dna表示(representation)將增加，在進一步3次連續(xù)重復后平均接近97％。通常，將理解與初始培養(yǎng)物具有75-100％基因型同一性的任何培養(yǎng)物都是初始培養(yǎng)物的edv的指示。還確立edv的edv也是初始株的edv。最后，由于雙孢蘑菇在異核菌株和同核株系之間世代交替，因此實質(zhì)衍生的標準同樣適用于菌株和株系兩者的培養(yǎng)物。

30、基因型指紋是對限定基因座處的基因型的描述，其中記錄了所表征的等位基因的存在。這些指紋為識別克隆和初始菌株的edv的所有類型以及識別遠交譜系中的祖先提供了強大且有效的技術。多種技術對于限定和表征(鑒定)基因型中的基因座和等位基因是可用的。全基因組測序(wgs)提供了最詳細的方法，它允許對整個基因組的dna序列進行直接表征和比較。使用這種方法來產(chǎn)生引入了大量標志物基因座的穩(wěn)健的基因型指紋，有可能在兩個菌株之間建立(確立)關系性質(zhì)，包括經(jīng)過多個世代的系譜后代所關聯(lián)的菌株。申請人已通過其菌株開發(fā)譜系的四至六代跟蹤了遺傳標志物。如果在初始菌株或株系中存在足夠數(shù)目的獨特標志物，則有可能在幾個遠交世代后鑒別來自初始菌株或株系的后代，而無需過度的實驗。在一個假定實例中，在f4雜交體中，在4個遠交世代后，初始單倍體株系的基因組表示的平均期望值為3.1％(50％/24)，這對應于約1mb的雙孢蘑菇的核基因組dna?；谏暾埲说姆治?，來自兩個不相關的雙孢蘑菇菌株中的每一個的dna的量通?？梢院屑s10000至約20000個單核苷酸多態(tài)性(snp)，其中的任一個都可以提供將f4雜交體與初始株系相聯(lián)系的區(qū)別標志物。通過使用多個獨立的標志物，可以以非常高的成功概率和合理的置信度來鑒別菌株的祖先(原種，ancestor)。

31、具有生物學和商業(yè)價值(商業(yè)關注度)的一個性狀是異核體不相容性(heterokaryon?incompatibility)。這些自身/非自身識別系統(tǒng)的遺傳學在擔子菌類真菌，如傘菌屬中尚未很好地闡明，但已知在其它真菌群中涉及多個獨立基因座處的多個等位基因。注意，異核體不相容性發(fā)生在大多數(shù)真菌中，并且與本文所報道的攻擊性不相容性狀有很大不同。“正常的”不相容性通常是菌絲體相互作用的局部區(qū)域，其中兩種基因型之間的生長減弱。據(jù)信該功能將防止病毒在同一物種的不同基因型之間轉(zhuǎn)移。

32、應注意至少有兩種影響蘑菇作物的雙鏈rna病毒，即勒法郎士病(la?francedisease)和蘑菇病毒x。異核體不相容性將阻止兩個或更多個異核體的物理混合物中的成功接合和胞質(zhì)連續(xù)性，借此產(chǎn)生“病毒破壞(virus-break)”。在蘑菇農(nóng)場，通過用摻入與初始菌株不相容的另一不同菌株的接種物和作物材料替換摻入初始菌株的作物材料(堆肥、菌種體、覆蓋接種物)來進行病毒破壞。在病毒破壞方法的最有效的實施中，蘑菇農(nóng)場的初始株的所有生物材料被第二不相容菌株的生物材料替換。菌株不相容性為病毒從設施內(nèi)的生物庫向新作物的移動產(chǎn)生了有效(如果不是絕對)的屏障。具有不同基因型的蘑菇株之間的輪轉(zhuǎn)栽培使用也可以中斷外源害蟲和病原體的感染和侵染循環(huán)。

33、如以上所提及的，雜交蘑菇株生產(chǎn)者一直在尋找能讓種植者成功且能獲利地生產(chǎn)作物的雜交株。在衍生自j19109的新雜交體及其衍生株或后代株的情況下，迄今為止所記錄的積極屬性包括有吸引力的外觀(與市場領先者a-15相比，圓形菌蓋、粗菌柄、良好的抗壓傷性(bruise?resistance)，所有這些都對消費者有吸引力)，以及可以匹配或超過諸如a-15的菌株的總產(chǎn)量。在我們的實例中，蘑菇種植者可以通過使用本文所描述的新雜交體獲得高質(zhì)量蘑菇的高產(chǎn)作物。另外，這些菌株與j15987的高質(zhì)量相匹配，j15987是本發(fā)明申請人所開發(fā)的早期菌株，具有缺少攻擊性不相容性表型的顯著優(yōu)勢。

34、目前可用于蘑菇產(chǎn)業(yè)的菌株使種植者能夠成功生產(chǎn)蘑菇作物，并且通常是有利可圖的。有幾個因素會影響所實現(xiàn)的成功和盈利程度。例如，相對于目前上市和商業(yè)種植的菌株，菌株必須能夠在兩到三批暴發(fā)或兩到三次出菇潮中產(chǎn)生至少相當?shù)淖魑锂a(chǎn)量。此外，所生產(chǎn)的蘑菇的一些物理性質(zhì)，例如，菌蓋顏色類別，以及常規(guī)大小和尺寸，如菌蓋直徑，允許蘑菇以熟悉的產(chǎn)品類別上市。

35、j19109?ssi×j11500-s80雜交體能滿足那些市場需求，并解決了目前市場上無法獲得這種菌株的問題。另外，當與其它現(xiàn)有的白色栽培種相比時，這組新的菌株在基因型上不同(參見下表i和ii)，這解決了與對單一栽培作物的依賴性有關的潛在問題。

36、本發(fā)明的一個或多個方面可以通過由本發(fā)明所開發(fā)的雙孢蘑菇的雜交蘑菇培養(yǎng)物來實現(xiàn)。因此，本發(fā)明涵蓋了摻入上述株系或菌株的任何培養(yǎng)物的產(chǎn)品。這些產(chǎn)品可以包括菌絲體(mycelium)、菌種體(spawn)、新鮮或加工的蘑菇、蘑菇孢子、蘑菇菌種體、蘑菇制備物(mushroom?preparations)和提取物和級分(fractions)、蘑菇塊(mushroom?pieces)、蘑菇接種物、覆蓋接種物(casing?inoculum)、覆蓋菌種體(casing?spawn)、覆蓋土壤、接種的堆肥、定殖的堆肥、后耕作的堆肥(收割后的堆肥，post-cropped?compost)和松散顆粒物(friable?particulate?matter)。

37、此外，上述任何株系或菌株的培養(yǎng)物的多個部分可能具有價值和商業(yè)應用。因此，設想了選自菌絲、蘑菇、孢子、細胞、核和原生質(zhì)體的部分。更進一步，在一個或多個實施方式中，設想了單細胞微生物。因此，提供了上述株系或菌株的任何培養(yǎng)物的細胞。

38、應注意已保藏了株j20176(已以nrrl保藏號68166保藏了該菌株的代表性培養(yǎng)物)以提供滿足本發(fā)明要求的可能株系的適合實例。因此，株j20176可以包括培養(yǎng)物的多個部分，包括菌絲、孢子以及細胞和細胞部分，包括核、線粒體、細胞質(zhì)、原生質(zhì)體、dna、rna、蛋白質(zhì)、細胞膜和細胞壁，所述部分存在于培養(yǎng)物的營養(yǎng)菌絲體中和通過所述培養(yǎng)物所產(chǎn)生的蘑菇中。所述孢子可以是休眠的或萌發(fā)的孢子，并且可以包括摻入其中的異核體和同核體。

39、可以產(chǎn)生一種或多種摻入了指明為j19109的后代菌株的雙孢蘑菇的雜交蘑菇培養(yǎng)物的產(chǎn)品。這些產(chǎn)品包括菌絲體、菌種體、接種物、覆蓋接種物、新鮮蘑菇、加工蘑菇、蘑菇提取物和級分、蘑菇塊和選自谷物、堆肥和松散顆粒物的定殖基質(zhì)。將理解蘑菇塊是指蘑菇本身的菌柄、菌蓋和其它較大的部分。

40、本發(fā)明的一個或多個其它方面可以通過菌株，如j19109的雜交蘑菇培養(yǎng)物的實質(zhì)衍生品種(edv)來實現(xiàn)。在一個或多個實施方式中，通過實質(zhì)衍生所產(chǎn)生的雙孢蘑菇培養(yǎng)物具有j19109衍生交配體的基本特征中的至少一種。對于本發(fā)明，作為本文所描述的本發(fā)明的直接結(jié)果的優(yōu)良菌株的實例，我們保藏了一個交配體，j19109-s40×j11500-s80，其被稱為j20176。j20176是缺少ai性狀的菌株，并且相對于u1?edv，如a-15，具有j15987的菌蓋圓度、菌肉厚度、產(chǎn)量表現(xiàn)和產(chǎn)量時間等其它特征。

41、本發(fā)明的其它方面可以通過用于產(chǎn)生雙孢蘑菇雜交培養(yǎng)物的方法來實現(xiàn)，該方法包括將同核體，如j19109-s40(以nrrl保藏號68165保藏)與第二同核體交配的步驟。在一個實施方式中，第二同核系j11500-s80，其培養(yǎng)物以nrrl保藏號68164保藏。這種交配提供了蘑菇培養(yǎng)物j20176，其證實對一組基于u1?edv的商品化栽培種，例如a-15的正常拮抗模式。這種拮抗作用證實了株j20176的遺傳獨特性。在一個或多個實施方式中，所述方法進一步包括提供本發(fā)明的蘑菇培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物由菌絲體、菌種體、接種物、覆蓋接種物、新鮮蘑菇、加工蘑菇、蘑菇部分、蘑菇提取物和級分、蘑菇塊和選自谷物、堆肥和松散顆粒物的定殖基質(zhì)組成。在其它實施方式中，所述方法可以包括在衍生培養(yǎng)物中提供蘑菇培養(yǎng)物，所述衍生培養(yǎng)物選自同核體、異核體、非整倍體、體細胞繼代培養(yǎng)物、組織外植體培養(yǎng)物、原生質(zhì)體、休眠孢子、萌發(fā)孢子、近交后代和遠交后代、轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)物、基因編輯培養(yǎng)物和具有單基因座轉(zhuǎn)換的基因組的培養(yǎng)物。

42、本發(fā)明的其它方面可以通過具有基因型指紋的雙孢蘑菇的雜交蘑菇培養(yǎng)物來實現(xiàn)，所述基因型指紋在標志物基因座its、p1n150-g3-2、mfpc-1-elf、an、af和ff處具有特征。在一個或多個實施方式中，所述培養(yǎng)物具有在標志物基因座處具有表ii中所描述的特征的基因型指紋，其中所述指紋的所有特征都存在于基因型指紋中。需要明確的是，減數(shù)分裂和隨機分配(random?assortment)將確保j19109后代的每個同核孢子將具有獨特的標志物模式?；谒z傳的dna標志物，本領域技術人員將直接推斷出j19109同核體育種原種(育種儲庫，breeding?stocks)是后代。

43、本發(fā)明的一個或多個其它方面可以通過由以上方法所產(chǎn)生的培養(yǎng)物、細胞或包括所述細胞的培養(yǎng)物來實現(xiàn)。因此，一個或多個實施方式可以包括進一步包括生長雜交蘑菇培養(yǎng)物以產(chǎn)生雜交蘑菇和蘑菇部分的步驟的方法。其它實施方式可以提供這類方法，其中所產(chǎn)生的雜交蘑菇培養(yǎng)物或細胞包括在標志物基因座its、p1n150-g3-2、mfpc-1-elf、an、af和ff處具有特征的標志物譜，其中所述標志物譜的所有特征也存在于株j20176和j19109的標志物譜中。仍有其它實施方式可以提供這類方法，其中所產(chǎn)生的雜交蘑菇培養(yǎng)物或細胞包括在表i中所描述的標志物基因座處具有特征的標志物譜，其中所述標志物譜的所有特征也存在于株j20176的標志物譜中。

44、本發(fā)明相對于已有的涉及雙孢蘑菇和培養(yǎng)物的現(xiàn)有技術的這些和其它優(yōu)勢將根據(jù)以下描述而變得顯而易見，并通過下文描述和主張的本發(fā)明來實現(xiàn)。