本發(fā)明屬于動(dòng)物模型，具體涉及一種脂多糖誘導(dǎo)的烏鱧腸漏模型的構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、烏鱧(channa?argus)是一種兇猛肉食性魚類，廣泛分布于中國(guó)各大淡水水系，其因豐富的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值受到廣大消費(fèi)者青睞，市場(chǎng)需求逐年增加。然而，在集約化養(yǎng)殖過程中，烏鱧極易發(fā)生各種細(xì)菌性腸道疾病，嚴(yán)重甚至造成死亡。

2、腸道是機(jī)體重要的消化和免疫器官，而腸道屏障是維持腸道環(huán)境平衡、阻礙致病菌和毒素侵入的重要防線。當(dāng)魚類腸道遭受細(xì)菌感染時(shí)，其機(jī)械屏障受到損傷，腸上皮細(xì)胞間的細(xì)胞旁路途徑異常開放，導(dǎo)致腸道通透性升高，就會(huì)引發(fā)腸漏，而腸漏造成的腸道通透性增加進(jìn)一步引發(fā)免疫反應(yīng)，威脅魚類健康。因此，深入理解腸漏的病理機(jī)制，開發(fā)有效的預(yù)防和治療措施是目前的研究重點(diǎn)，構(gòu)建魚類腸漏模型是開展以上研究的重要基礎(chǔ)。

3、脂多糖(lipopolysaccharide,lps)是一種細(xì)菌內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的特有成分，研究發(fā)現(xiàn)暴露于lps能夠造成腸道屏障損傷，引發(fā)炎癥，但目前尚沒有以lps為誘導(dǎo)劑構(gòu)建烏鱧腸漏實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷南嚓P(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種脂多糖誘導(dǎo)的烏鱧腸漏模型的構(gòu)建方法，為后續(xù)魚類腸漏的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

2、本發(fā)明的另一目的在于提供所述脂多糖誘導(dǎo)的烏鱧腸漏模型的構(gòu)建方法在制備治療腸漏疾病動(dòng)物模型或篩選治療腸漏疾病藥物中的應(yīng)用。

3、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

4、本發(fā)明提供一種脂多糖誘導(dǎo)的烏鱧腸漏模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

5、(1)取300-600尾規(guī)格相似的烏鱧隨機(jī)分為若干組，每組3個(gè)重復(fù)；

6、(2)向?yàn)貅k肛灌0.1ml不同濃度梯度的lps或等量pbs進(jìn)行脅迫處理；

7、(3)取脅迫處理后的烏鱧血清樣本進(jìn)行試劑盒測(cè)定，同時(shí)取腸道樣本進(jìn)行病理觀察、透射電鏡觀察和基因測(cè)定；

8、(4)綜合步驟(3)中所得結(jié)果確定lps誘導(dǎo)烏鱧腸漏模型的最適劑量。

9、作為優(yōu)選，步驟(1)中，所述烏鱧在分組前進(jìn)行2周馴化養(yǎng)殖，馴化過程包括：每天(7:30、17:30)給烏鱧喂料2次，每2天換1次水，水溫控制在28℃，ph控制在6.8-7.2之間，溶解氧為6mg/l，氨氮含量小于0.1mg/l，亞硝酸鹽含量小于0.05mg/l。

10、作為優(yōu)選，步驟(1)中，所述烏鱧規(guī)格相似，體重為7.6-8.06g。

11、作為優(yōu)選，步驟(2)中，lps用pbs稀釋到0mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml和8mg/ml的濃度使用，脅迫處理時(shí)間為96h。

12、作為優(yōu)選，步驟(2)中，所述肛灌的操作過程包括：將注射器針頭小心插入烏鱧泄殖孔內(nèi)，在不扎漏腸道的情況下將lps或pbs溶液緩慢推入。

13、作為優(yōu)選，步驟(3)中，采用尾靜脈方式抽取血漿，3000rpm離心10min后取上層血清，在-20℃保存，作為所述血清樣本；

14、在冰上解剖脅迫處理后的烏鱧后取出腸道，并用生理鹽水徹底沖洗，作為所述腸道樣本；其中，用于病理觀察的腸道固定于4％多聚甲醛保存至4℃?zhèn)溆茫糜谶M(jìn)行透射電鏡觀察的腸道固定于2.5％戊二醛保存至4℃?zhèn)溆?，用于基因測(cè)定的腸道快速過液氮后保存至-80℃待測(cè)。

15、作為優(yōu)選，步驟(3)中，所述試劑盒為elisa試劑盒，包括溶菌酶(lzm)、補(bǔ)體c3(c3)、免疫球蛋白m(igm)、d-乳酸(d-la)和二胺氧化酶(dao)。

16、作為優(yōu)選，步驟(3)中，所述病理觀察的步驟包括：修剪組織、脫水浸蠟、石蠟包埋、切片、he染色和封片，最后使用光學(xué)顯微鏡觀察腸道病理情況；

17、和/或所述透射電鏡觀察的步驟包括：后固定、脫水、包埋、聚合、超薄切片、染色，最后使用透射電子顯微鏡觀察腸道緊密連接結(jié)構(gòu)；

18、和/或所述基因測(cè)定的步驟包括：使用trizol法提取腸道總rna，分光光度法檢測(cè)rna的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定rna的完整性，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將rna反轉(zhuǎn)錄為cdna，用高特異性qpcr試劑tbpremix?ex?taqtmii進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr(qpcr)，最后用2-δδct法分析不同基因的表達(dá)水平。

19、作為更優(yōu)選，步驟(3)中，所述基因測(cè)定所需引物的信息包括：

20、β-actin：

21、上游cactgtgcccatctacgag(seq?id?no:1)，

22、下游ccatctcctgctcgaagtc(seq?id?no:2)；

23、occludin：

24、上游caaaccgcagcacttctacaaatgg(seq?id?no:3)，

25、下游tcgccacgcacagcacaatc(seq?id?no:4)；

26、claudin-1：

27、上游gctcatcgggttcctcctctctc(seq?id?no:5)，

28、下游aggttgttctctcattgccactgc(seq?id?no:6)；

29、zo-1：

30、上游gagtttgactgtgccgacacctac(seq?id?no:7)，

31、下游tccctcctctaccaacttcaccttc(seq?id?no:8)；

32、mlck：

33、上游ccgcaagagttcagcacaacac(seq?id?no:9)，

34、下游tcacaggacaggaggcaggag(seq?id?no:10)；

35、tnf-α：

36、上游ccagaagactcaagccaatg(seq?id?no:11)，

37、下游tcacaaggcaaagacacca(seq?id?no:12)；

38、il-1β：

39、上游cacgatgcgattcctattc(seq?id?no:13)，

40、下游ttactggcttgttgtcactc(seq?id?no:14)；

41、nf-κb：

42、上游cagcaaaaccaagagggat(seq?id?no:15)，

43、下游tcggcttcgtagtagccatg(seq?id?no:16)；

44、il-8：

45、上游tctgagcagcctgggagtg(seq?id?no:17)，

46、下游atcgcagtgagggttgggt(seq?id?no:18)。

47、作為優(yōu)選，步驟(4)中，血清dao、d-la含量和腸道m(xù)lck、tnf-α、il-8、il-1β、nf-κb的mrna表達(dá)水平升高，血清igm、lzm、c3含量和腸道occludin、claudin-1、zo-1的mrna表達(dá)水平降低。

48、作為優(yōu)選，步驟(4)中，lps的最適劑量為4-8mg/ml，更優(yōu)選為4mg/ml。

49、本發(fā)明還提供所述脂多糖誘導(dǎo)的烏鱧腸漏模型的構(gòu)建方法在治療腸漏疾病的動(dòng)物模型構(gòu)建或藥物篩選中的應(yīng)用。

50、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

51、(1)lps作為革蘭氏陰性菌的特殊成分發(fā)揮作用，在模擬魚類細(xì)菌引發(fā)的腸漏中更具有代表性，而且lps作為一種誘導(dǎo)劑，其劑量和作用時(shí)間可以精確控制，構(gòu)建脂多糖誘導(dǎo)的烏鱧腸漏模型標(biāo)準(zhǔn)化和重復(fù)性好。

52、(2)烏鱧作為淡水代表魚類，在很多方面與其他魚類具有相似的生理和免疫特征，構(gòu)建烏鱧腸漏模型在一定程度上可以為其他魚類的研究提供理論參考。

53、(3)通過烏鱧腸漏模型的構(gòu)建和應(yīng)用，有助于科研人員在此基礎(chǔ)上深入理解腸漏的病理機(jī)制，開發(fā)有效的腸漏預(yù)防和治療措施。

54、綜上所述，本發(fā)明提出一種脂多糖誘導(dǎo)的烏鱧腸漏模型的構(gòu)建方法，將不同濃度的lps通過肛灌注入烏鱧腸道進(jìn)行脅迫處理，采用he染色、透射電鏡、試劑盒測(cè)定和實(shí)時(shí)熒光定量pcr等表征方法評(píng)價(jià)構(gòu)建的lps誘導(dǎo)烏鱧腸漏模型，為后續(xù)魚類腸漏的深入研究提供理論基礎(chǔ)。