本發(fā)明通過(guò)不同方式處理雷公藤外植體，獲得雷公藤毛狀根快速誘導(dǎo)的方法，包括雷公藤外植體的處理、發(fā)根農(nóng)桿菌accc10060的菌液活化培養(yǎng)、accc10060對(duì)雷公藤外植體的毛狀根誘導(dǎo)等。本發(fā)明的誘導(dǎo)方法簡(jiǎn)單，明顯縮短了雷公藤毛狀根的誘導(dǎo)時(shí)間并提高了雷公藤毛狀根的誘導(dǎo)率。本發(fā)明屬于生物工程。

背景技術(shù)：

1、中藥雷公藤為衛(wèi)矛科植物雷公藤的干燥根，主要分布在我國(guó)長(zhǎng)江以南，主產(chǎn)于福建、浙江、安徽、湖南等地，具有清熱解毒、活血化瘀、殺蟲止血、消腫散結(jié)等功效。近年來(lái)，人們對(duì)藥用植物雷公藤重要活性成分的需求日益增加，造成野生雷公藤資源的過(guò)度開(kāi)發(fā)，使其資源面臨枯竭。此外，由于雷公藤具有大毒，不適合大面積種植，加之環(huán)境因素限制，提取量十分有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無(wú)法滿足人們現(xiàn)階段對(duì)其的需求。毛狀根具有生長(zhǎng)周期短且不受自然環(huán)境的影響、次生代謝產(chǎn)物含量高且穩(wěn)定、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，因此毛狀根培養(yǎng)技術(shù)成為一條可靠的生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物的有效途徑，有望成為雷公藤活性成分的重要來(lái)源。

2、white和nester的研究發(fā)現(xiàn)發(fā)根農(nóng)桿菌通過(guò)將其ri質(zhì)粒上的t-dna轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中，進(jìn)而誘導(dǎo)植物產(chǎn)生毛狀根(white?f?f,nester?e?w.hair?root:plasmidencodes?virulence?traits?in?agrobacterium?rhizogenes[j].journal?ofbacteriology,1980,141(3):1134-1141.)，這極大地促進(jìn)了毛狀根誘導(dǎo)的研究，為今后優(yōu)化毛狀根誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系奠定了基礎(chǔ)。迄今為止已有近200種植物成功誘導(dǎo)出毛狀根，轉(zhuǎn)化成功的植物大部分為十字花科、菊科、茄科、豆科等，主要是雙子葉植物，且多為草本植物(劉連旺,張永清,李先恩.藥用植物毛狀根研究進(jìn)展[j].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2015,39(03):288-291.)。陳新玲等構(gòu)建了蜆殼花椒毛狀根的誘導(dǎo)及其培養(yǎng)技術(shù)體系，比較了3種發(fā)根農(nóng)桿菌菌株的毛狀根誘導(dǎo)率，并對(duì)外植體類型、侵染時(shí)間和培養(yǎng)基類型進(jìn)行優(yōu)化(陳新玲,王媛,孫吉康,等.蜆殼花椒毛狀根的誘導(dǎo)及其培養(yǎng)技術(shù)體系構(gòu)建[j].植物生理學(xué)報(bào),2023,59(11):2117-2125.)。王雨晴等人比較了不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌株的毛狀根誘導(dǎo)能力及不同培養(yǎng)基、不同轉(zhuǎn)速下毛狀根的生長(zhǎng)能力，最終建立了高產(chǎn)總皂苷的絞股藍(lán)毛狀根誘導(dǎo)體系(王雨晴,楊謹(jǐn),黃嫻,等.發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)絞股藍(lán)毛狀根及其總皂苷含量測(cè)定[j].中藥材,2022,45(08):1818-1821.)。然而關(guān)于雷公藤毛狀根誘導(dǎo)的研究較少，封磊等人通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)雷公藤的嫩莖與葉片外植體進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)根，約30天后在外植體的創(chuàng)傷部位可見(jiàn)有毛狀根長(zhǎng)出，其中葉片的誘導(dǎo)率為31.4％(封磊.一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生雷公藤毛狀根的方法.cn102321664b[p].2013.04.17)；霍彥波對(duì)雷公藤葉片進(jìn)行毛狀根誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)除菌繼代28天～42天后，葉片才開(kāi)始長(zhǎng)出毛狀根(霍彥波.殺蟲化合物雷公藤內(nèi)酯醇生物合成關(guān)鍵基因twtps27a/b的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究[d].西北農(nóng)林科技大學(xué),2021.)。

3、綜上所述，雷公藤毛狀根的誘導(dǎo)率較低且周期較長(zhǎng)，有必要建立和優(yōu)化雷公藤毛狀根的誘導(dǎo)體系，不僅可以用于藥用植物的品種改良，以此獲得高產(chǎn)活性成分的再生植株，緩解雷公藤野生資源緊張的問(wèn)題，還可以為今后基于雷公藤毛狀根體系的遺傳與代謝工程的科學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的，在于提供一種促進(jìn)雷公藤毛狀根誘導(dǎo)的方法，所述方法能夠簡(jiǎn)單有效，毛狀根誘導(dǎo)速度快，誘導(dǎo)率高。

2、具體地，本發(fā)明所述促進(jìn)雷公藤毛狀根誘導(dǎo)的方法包括：

3、雷公藤外植體的預(yù)培養(yǎng)，包括：處理雷公藤外植體，于無(wú)菌環(huán)境中，將預(yù)處理的雷公藤外植體置于ms+2,4-二氯苯氧乙酸+激動(dòng)素的固體培養(yǎng)基中，25-30℃恒溫培養(yǎng)2～4d；

4、菌液的活化：包括，將農(nóng)桿菌接種到y(tǒng)eb液體培養(yǎng)基中，25-30℃恒溫培養(yǎng)至其od600約為0.2-1.0，離心收集菌體，將菌體用ms液體培養(yǎng)基繼續(xù)重懸，得到活化的菌液；

5、侵染與共培養(yǎng)：將預(yù)培養(yǎng)處理的雷公藤外植體至重懸的活化菌液中，25-30℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中振蕩培養(yǎng)10-20min，除去雷公藤外植體表面殘留菌液，轉(zhuǎn)移到ms+2,4-二氯苯氧乙酸+激動(dòng)素+乙酰丁香酮的固體培養(yǎng)基中繼續(xù)與25-30℃下恒溫培養(yǎng)1-5d；

6、除菌繼代：共培養(yǎng)后的雷公藤外植體經(jīng)清洗處理后，轉(zhuǎn)移至含有特美汀的ms固體培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)，獲得雷公藤外植體經(jīng)誘導(dǎo)后的毛狀根。

7、本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述雷公藤外植體為雷公藤幼苗的葉片或幼莖，所述葉片剪成1cm2左右的方形小片，所述幼莖剪成1cm左右的莖段，在所述方形小葉片上，優(yōu)選地可以是在葉片表面扎出一定數(shù)量的傷口，如3個(gè)、5個(gè)、8個(gè)、10個(gè)、12個(gè)、或5個(gè)左右的傷口。

8、本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述yeb液體培養(yǎng)基的組成包括：5g/l蛋白胨、5g/l蔗糖、5g/l牛肉膏、1g/l?yeast?extract、4g/l?mgso4.7h2o，其中固體培養(yǎng)基加15g/l瓊脂粉，液體培養(yǎng)基不加，ph為7.4，在121℃條件下高溫滅菌20min。

9、本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述ms液體培養(yǎng)基的組成包括：4.43g/l?ms、30g/l蔗糖，其中固體培養(yǎng)基加15g/l瓊脂粉，液體培養(yǎng)基不加，ph為5.8，在121℃條件下高溫滅菌20min。

10、本發(fā)明所述方法，在所述除菌繼代培養(yǎng)過(guò)程中，每14d繼代一次，42d統(tǒng)計(jì)毛狀根誘導(dǎo)率。

11、本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在所述除菌繼代過(guò)程中，培養(yǎng)基中進(jìn)一步含有激素，如植物生長(zhǎng)激素，所述激素選自2,4-二氯苯氧乙酸、吲哚-3-丁酸、6-芐氨基嘌呤、激動(dòng)素或赤霉素，優(yōu)選為2,4-二氯苯氧乙酸、吲哚-3-丁酸，更優(yōu)選為吲哚-3-丁酸；所述激素的濃度為0.1-5mg/l，優(yōu)選為1mg/l。

12、本發(fā)明更為優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案中，其中在所述侵染與共培養(yǎng)過(guò)程中，所述固體培養(yǎng)基中還可進(jìn)一步含有濃度為0.1-5mg/l的激素吲哚-3-丁酸，優(yōu)選為1mg/l。

13、本發(fā)明一個(gè)具體的促進(jìn)雷公藤毛狀根誘導(dǎo)的方法包括：

14、雷公藤外植體的預(yù)培養(yǎng)，包括：處理雷公藤外植體，于無(wú)菌環(huán)境中，將預(yù)處理的雷公藤外植體置于ms+1mg/l的2,4-二氯苯氧乙酸+0.1mg/l的激動(dòng)素的固體培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)3d；

15、菌液的活化：包括，將農(nóng)桿菌accc10060接種到y(tǒng)eb液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)至其od600約為0.4-0.6，離心收集菌體，將菌體用ms液體培養(yǎng)基繼續(xù)重懸，得到活化的accc10060農(nóng)桿菌菌液；

16、侵染與共培養(yǎng)：將預(yù)培養(yǎng)處理的雷公藤外植體至重懸活化的農(nóng)桿菌菌液中，28℃恒溫培養(yǎng)振蕩器、120rpm下振蕩培養(yǎng)15min，除去雷公藤外植體表面殘留菌液，轉(zhuǎn)移到ms+1mg/l的2,4-二氯苯氧乙酸+0.1mg/l的激動(dòng)素+100μmol/l的乙酰丁香酮的固體培養(yǎng)基中繼續(xù)于25℃下恒溫培養(yǎng)3d；

17、除菌繼代：共培養(yǎng)后的雷公藤外植體經(jīng)清洗處理后，轉(zhuǎn)移至含有特美汀的ms固體培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)，14d繼代一次，42d統(tǒng)計(jì)獲得的雷公藤毛狀根誘導(dǎo)率；所述固體培養(yǎng)基中含有1mg/l的2,4-二氯苯氧乙酸或吲哚-3-丁酸，優(yōu)選吲哚-3-丁酸。

18、本發(fā)明通過(guò)accc10060發(fā)根農(nóng)桿菌侵染不同外植體(雷公藤葉片、莖段)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷公藤葉片誘導(dǎo)率更好。再通過(guò)不同共培養(yǎng)時(shí)間(1d、3d、5d)、菌液濃度(od600為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0)及除菌繼代階段在固體培養(yǎng)基中加入不同激素(1mg/l?2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸，生長(zhǎng)素類激素調(diào)節(jié)劑)、1mg/l?iba(吲哚-3-丁酸，生長(zhǎng)素的一種)、1mg/l?6-ba(6-芐氨基嘌呤，細(xì)胞分裂素)、1mg/l?kt(激動(dòng)素，細(xì)胞分裂素)、1mg/l?ga(赤霉素，植物激素))處理下，發(fā)現(xiàn)在固體培養(yǎng)基中加入1mg/l的iba時(shí)，毛狀根長(zhǎng)勢(shì)較好且誘導(dǎo)率較高，為80％。進(jìn)一步在共培養(yǎng)階段和除菌繼代階段，在固體培養(yǎng)基中都加入1mg/l的iba時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷公藤毛狀根誘導(dǎo)率為100％，僅在除菌繼代第10天，所有葉片都誘導(dǎo)出了毛狀根，該方法誘導(dǎo)率高且誘導(dǎo)速度快。