本發(fā)明涉及生物醫(yī)用高分子，尤其涉及一種人發(fā)角蛋白抗菌材料及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、抗生素耐藥性已經(jīng)成為一個(gè)全球性的問題。其產(chǎn)生的一個(gè)重要原因是抗生素抗菌機(jī)制單一，使得細(xì)菌很容易發(fā)生基因突變來(lái)對(duì)抗抗生素。因此，開發(fā)具有多種抗菌機(jī)制的抗菌材料已成為一種頗具潛景的解決這一難題的思路。

2、季銨鹽是一種陽(yáng)離子抗菌劑，其帶正電荷的“頭”能附著在細(xì)菌膜的極性表面上，從而取代了其中的mg2+和ca2+陽(yáng)離子，而其親脂性的“尾巴”則嵌入到磷脂雙分子層中。這導(dǎo)致細(xì)胞膜失去了流動(dòng)性，進(jìn)而造成膜的分裂。因此季銨鹽的抗菌作用可以從兩方面得以體現(xiàn)：一是通過靜電作用與帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，造成細(xì)胞膜的破壞，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)；另一方面，它還能防止表面生物膜的形成，而細(xì)菌也難以對(duì)季銨鹽產(chǎn)生耐藥性。

3、在應(yīng)用中，通過對(duì)蛋白質(zhì)織物進(jìn)行處理引入季銨基團(tuán)可以提高織物的抗菌性能。例如公開號(hào)為cn104831533a的中國(guó)發(fā)明專利提供了一種使蛋白質(zhì)織物表面具有抗菌及抗靜電性能的處理方法，使用三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，tcep)在室溫下處理蛋白質(zhì)織物，使蛋白質(zhì)纖維所含的角蛋白中的二硫鍵斷裂形成巰基；然后通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，使2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(glycidyl?trimethyl?ammonium?chloride，gtac)中的環(huán)氧結(jié)構(gòu)與經(jīng)過tcep處理的蛋白質(zhì)織物表面上的巰基共價(jià)結(jié)合；經(jīng)過處理的蛋白質(zhì)織物具有良好的抗菌及抗靜電性能。該發(fā)明的主要應(yīng)用場(chǎng)景為織物的處理，而在生物醫(yī)用領(lǐng)域中，抗菌材料通常需要具備良好的水溶性及較小的尺寸，以在生物細(xì)胞層面發(fā)揮殺菌功能，這是上述方案難以實(shí)現(xiàn)的；同時(shí)，抗菌材料還需要滿足較低的生物毒性，減少正常細(xì)胞的凋亡，而季銨鹽的生物毒性較高，一定程度上也阻礙了它的應(yīng)用。

4、除季銨鹽外，銀納米簇也是一種具有良好抗菌性能的材料，其抗菌機(jī)制包括對(duì)細(xì)菌膜的損傷、金屬離子釋放、活性氧(reactive?oxygen?species，ros)的產(chǎn)生、胞內(nèi)成分破壞等。將二者有效結(jié)合在一起有望獲得更加優(yōu)良的抗菌效果。然而，將兩種或多種具有不同抗菌機(jī)制的抗菌組份結(jié)合在一起，往往需要一個(gè)載體。該載體可以不具有抗菌功效，但也應(yīng)具備高效負(fù)載能力和持久的穩(wěn)定負(fù)載時(shí)間。因此，一種合格的載體材料應(yīng)具備以下性質(zhì)：官能團(tuán)豐富、良好的生物相容性、生物降解性和生物安全性。

5、例如公開號(hào)為cn109202098a的中國(guó)發(fā)明專利則提供了一種角蛋白復(fù)合銀納米簇的制備方法，采用以下步驟：(1)將角蛋白溶液與硝酸銀溶液混合并調(diào)節(jié)ph值；(2)加入硼氫化鈉溶液并靜置反應(yīng)30min；(3)通過純化方法終止反應(yīng)，制備得到熒光銀納米簇。該方案提供了于角蛋白表面引入銀納米簇的技術(shù)方案。因此，以角蛋白為載體，使用tcep處理角蛋白引入季銨基團(tuán)，隨后利用上述方案制備銀納米簇得到雙抗菌組分的材料，可能是得到滿足生物醫(yī)用需求的抗菌材料的可行方向。

6、人體毛發(fā)角蛋白是一種從頭發(fā)中提取的蛋白質(zhì)，而在日常生活中，頭發(fā)往往因缺乏有效利用途徑而作為理發(fā)行業(yè)等的垃圾浪費(fèi)，與上述發(fā)明采用如羊毛等動(dòng)物來(lái)源的纖維相比更加經(jīng)濟(jì)低廉。因此發(fā)明人嘗試以頭發(fā)作為角蛋白載體來(lái)源，引入季銨基團(tuán)及銀簇制備目標(biāo)抗菌材料。然而在人發(fā)提取角蛋白載體以負(fù)載季銨基團(tuán)及銀簇的過程中，同樣存在亟需解決的新技術(shù)難點(diǎn)?，F(xiàn)有技術(shù)采用tcep對(duì)羊毛織物角蛋白進(jìn)行處理，使二硫鍵還原為巰基即可達(dá)到處理目的，由于作為織物的使用性質(zhì)，其無(wú)需考慮角蛋白提取及溶解性的問題。而基于本發(fā)明的實(shí)際用途，需將角蛋白從相比羊毛纖維更緊密的人發(fā)中提取出來(lái)，并滿足可溶性要求，使其在溶液環(huán)境下進(jìn)行處理。在此過程中，角蛋白的溶解和穩(wěn)定是關(guān)鍵。

7、綜上所述，提供一種切實(shí)可行的方案，以人發(fā)提取的可溶性人發(fā)角蛋白為載體，實(shí)現(xiàn)季銨基團(tuán)和銀簇的復(fù)合并得到抗菌材料，并同時(shí)滿足殺菌性、生物相容性的需求，具有重要的應(yīng)用價(jià)值和意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性佳的人發(fā)角蛋白抗菌材料的制備方法，包括如下步驟：

2、(1)角蛋白的提取：

3、對(duì)頭發(fā)進(jìn)行預(yù)處理，將預(yù)處理所得頭發(fā)與三(羥甲基)氨基甲烷(tris堿)、硫脲、表面活性劑、三(2-羧乙基)膦、乙醇、水混合，調(diào)節(jié)體系的ph為9-10，配置形成提取液；惰性氣氛下，提取液于一定溫度進(jìn)行反應(yīng)；反應(yīng)完成后離心收集上清液，上清液經(jīng)透析、冷凍干燥，得到絮狀的角蛋白；

4、(2)季銨化角蛋白的制備：

5、將所得角蛋白與2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨溶于水，調(diào)節(jié)體系的ph為8.5-9.5，隨后于一定溫度下進(jìn)行反應(yīng)；反應(yīng)完成后產(chǎn)物經(jīng)透析、冷凍干燥，得到季銨化角蛋白；

6、(3)人發(fā)角蛋白抗菌材料的制備：

7、將所得季銨化角蛋白溶于水形成溶液，向該溶液中加入硝酸銀的水溶液，并調(diào)節(jié)體系的ph為9-10，得到混合溶液；向混合溶液中加入硼氫化鈉的水溶液，在避光環(huán)境下于一定溫度進(jìn)行反應(yīng)；反應(yīng)完成后產(chǎn)物經(jīng)透析、冷凍干燥，得到銀簇@季銨化角蛋白，即人發(fā)角蛋白抗菌材料。

8、在實(shí)際操作中，回收的頭發(fā)一般表面殘留各類污漬，因此在制備前可通過預(yù)處理的方式對(duì)其凈化，以去除其表面殘留的油脂、無(wú)機(jī)鹽等污物，便于后續(xù)處理。

9、優(yōu)選的，所述步驟(1)中，預(yù)處理的步驟如下：將頭發(fā)剪至2-3mm，依次以水、乙醇進(jìn)行洗滌，隨后將初次洗滌后的頭發(fā)與正己烷混合并處理，隨后將頭發(fā)再次用乙醇、水進(jìn)行洗滌并干燥。

10、基于頭發(fā)的實(shí)際用量，三(羥甲基)氨基甲烷、硫脲、表面活性劑、三(2-羧乙基)膦的用量適宜控制在合適的范圍內(nèi)，以提高頭發(fā)中角蛋白的提取量，并降低原料的浪費(fèi)。

11、優(yōu)選的，所述步驟(1)中，預(yù)處理所得頭發(fā)的用量為3g；三(羥甲基)氨基甲烷的用量為0.00075-0.003mol；硫脲的用量為0.19-0.76mol；表面活性劑為十二烷基磺酸鈉(dodecyl?sodium?sulfonate，sds)，其用量為0.00875-0.035mol；三(2-羧乙基)膦的用量為0.028-0.083mol；乙醇的用量為10-30ml；水的用量為25-80ml。

12、優(yōu)選的，所述步驟(1)中，反應(yīng)的溫度為50-70℃，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為24-72h。

13、季銨化角蛋白的季銨化率與2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨的用量相關(guān)。當(dāng)其添加量在適宜的范圍內(nèi)，可使季銨化率基本達(dá)到飽和，提高原料的利用率。

14、優(yōu)選的，所述步驟(2)中，角蛋白的用量為0.1g；2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨的用量為0.05-0.2g；水的用量為10-20ml。

15、優(yōu)選的，所述步驟(2)中，反應(yīng)的溫度為40-60℃，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為12-48h。

16、本工藝具有良好的靈活性，可以通過改變添加硝酸銀和硼氫化鈉的量，得到含有不同銀含量的銀簇@季銨化角蛋白，以滿足不同的使用需求。但硝酸銀的用量過高時(shí)，則會(huì)造成所得銀簇的粒徑較大，進(jìn)而導(dǎo)致銀簇@季銨化角蛋白分散性變差，因此硝酸銀的用量宜控制在合適范圍內(nèi)。

17、優(yōu)選的，所述步驟(3)中，季銨化角蛋白的用量為0.05g；水的用量為10-20ml；硝酸銀的水溶液的用量為1-3ml，其中硝酸銀的質(zhì)量為0.003-0.024g；硼氫化鈉的水溶液的用量為1-3ml，其中硼氫化鈉與硝酸銀的水溶液中的硝酸銀的質(zhì)量比為5:6。

18、優(yōu)選的，所述步驟(3)中，反應(yīng)的溫度為30-50℃，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為12-24h。

19、工藝涉及的ph適宜控制在上述合適的范圍內(nèi)。例如在季銨化制備中，如上偏堿性的環(huán)境可以讓氨基去質(zhì)子化，利于氨基與環(huán)氧基團(tuán)的開環(huán)加成；而在堿性過強(qiáng)的條件下，會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)角蛋白變性，不利于人發(fā)角蛋白抗菌材料的制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按需采用一元強(qiáng)堿，如氫氧化鈉或氫氧化鉀形成的水溶液來(lái)調(diào)節(jié)各步驟的體系ph至目標(biāo)范圍。

20、優(yōu)選的，采用一元堿性水溶液調(diào)節(jié)體系的ph；一元堿性水溶液選自氫氧化鈉水溶液或氫氧化鉀水溶液。

21、優(yōu)選的，透析的截留分子量(molecular?weight?cutoff，mwco)為3.5kda。

22、在本發(fā)明的第二方面，提供了一種殺菌性能佳、生物相容性好的人發(fā)角蛋白抗菌材料，采用本發(fā)明第一方面的方法制備而成。

23、在本發(fā)明的第三方面，提供了一種本發(fā)明第二方面的人發(fā)角蛋白抗菌材料的應(yīng)用，具體是作為抗菌材料在抑制細(xì)菌繁殖或殺菌中的應(yīng)用。

24、基于以上技術(shù)方案，本發(fā)明成功實(shí)現(xiàn)了由頭發(fā)中提取目標(biāo)角蛋白的工藝，并以其為載體負(fù)載季銨基團(tuán)及納米銀簇，為季銨基團(tuán)與納米銀簇的復(fù)合提供了切實(shí)可行的技術(shù)方案，完成了人發(fā)角蛋白抗菌材料的制備。本發(fā)明的設(shè)計(jì)構(gòu)思及原理在于，在以tcep處理角蛋白的過程中加入硫脲、tris堿及表面活性劑。利用硫脲削弱多肽鏈內(nèi)的疏水區(qū)域的接觸，破壞蛋白分子間的氫鍵，防止由氫鍵引起的蛋白質(zhì)聚集，促進(jìn)角蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)的膨脹，使還原劑更容易接近角蛋白的二硫鍵并將其轉(zhuǎn)化為巰基，提供更多的修飾位點(diǎn)；由于角蛋白在酸性中性環(huán)境中溶解性差，容易發(fā)生團(tuán)聚沉淀，在堿性環(huán)境下，通過tris堿穩(wěn)定溶液的堿性ph值，既在加快頭發(fā)的溶解同時(shí)保證角蛋白中的羧基不被酸化，也避免過高的ph環(huán)境造成角蛋白的變性，此外，tris堿還具有抗氧化的功能；并結(jié)合表面活性劑，提高水溶液中角蛋白的溶解度和穩(wěn)定性。采用本方法制備的人發(fā)角蛋白抗菌材料白兼具良好的抗菌效果及低生物毒性。

25、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

26、本發(fā)明提供了一種人發(fā)角蛋白抗菌材料的制備方法，具有操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性佳的優(yōu)勢(shì)，適用于量產(chǎn)。

27、本發(fā)明提供了一種人發(fā)角蛋白抗菌材料，其水溶性好，銀簇分散度集中，抗菌效果優(yōu)異，生物毒性低。

28、本發(fā)明提供了一種人發(fā)角蛋白抗菌材料的應(yīng)用，作為抗菌材料可以降低使用抗生素帶來(lái)細(xì)菌抗藥性上升的不良影響，可作為安全性好的抗菌劑替代品，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。