本發(fā)明屬于紅細胞保存，尤其涉及一種用于試劑紅細胞長期保存的冰凍和解凍方法。

背景技術：

1、abo血型在輸血醫(yī)學中至關重要，abo不相容輸血可能導致嚴重后果，因此臨床輸血前的abo血型檢測是關鍵環(huán)節(jié)。然而，隨著輸血學的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了許多abo亞型，這些亞型由于基因突變導致的糖基轉移酶功能異常，使得抗原表達弱或出現(xiàn)正反定型不符等現(xiàn)象。市場上現(xiàn)有的抗體檢測試劑對常規(guī)abo血型檢測效果良好，但對abo亞型的檢出能力差異較大，主要由于不同廠家的抗體克隆株對抗原表位的識別不同。為了提高對abo亞型和稀有血型的檢出能力，建立試劑紅細胞庫以質控血型檢測試劑顯得尤為重要。

2、目前，紅細胞的保存方法主要有兩種：液態(tài)冷藏和冰凍保存。液態(tài)冷藏通常在2～8℃條件下保存，但保存期短(2～3個月)，后期溶血嚴重，易出現(xiàn)假陽性結果。冰凍保存通過高滲透壓凍存保護液(如甘油)減少冰晶形成，將紅細胞保存于-80℃或液氮中，可保存十年或更長，但解凍過程繁瑣，細胞得率低。

3、現(xiàn)有冰凍保存技術存在諸多問題，如高濃度甘油降低冰點，導致細胞在-20℃無法完全冰凍，縮短保存期限；解凍過程中，去除大分子物質時使用大量生理鹽水，容易造成紅細胞膜破裂，影響細胞得率。此外，液氮超低溫保存盡管效果好，但存在危險性且運行成本高，不適合廣泛應用。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明提供了一種用于試劑紅細胞長期保存的冰凍和解凍方法。

2、本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種冰凍紅細胞保存液，由等滲的磷酸鹽緩沖液，包括以下組分：0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液，枸櫞酸鈉1.6％，氯化鉀0.03％和30～35％含量的甘油。

3、本發(fā)明還提供了一種梯度降溫凍存紅細胞的方法，該方法是：將新鮮紅細胞壓積用市場在售的紅細胞保存液洗滌1-2次，用上述冰凍紅細胞保存液與壓積紅細胞體積比1:1加入，顛倒混勻，室溫放置約10min平衡后置4℃放置約1h，再置于-20℃過夜，后置于-60℃以下冰箱長期儲存。所述商品化紅細胞保存液，其特征在于：等滲的溶液，含糖類成分，能為細胞提供能量；含抑菌成分，能抑制微生物生長。

4、本發(fā)明還提供了一種簡便的解凍紅細胞的方法，該方法原理是：用一種專用的半透明膜，將冰凍紅細胞置于袋內(nèi)，浸入緩沖液中，紅細胞被截留在袋內(nèi)，而甘油、小分子物質不斷擴散透析到袋外。

5、進一步，所述紅細胞解凍方法：

6、1)路徑1：

7、準備材料：9％氯化鈉溶液、2.5％氯化鈉溶液、0.9％氯化鈉溶液、紅細胞保存液；

8、室溫解凍，采用梯度洗脫法，待冰凍紅細胞在室溫環(huán)境下完全解凍，量取溶解后的總體積，以1:1的比例緩慢加入9％氯化鈉溶液，混勻、離心棄上清；

9、用2.5％氯化鈉溶液和壓積紅細胞按6:1體積比洗滌2～3次至上清澄清；

10、用0.9％氯化鈉溶液和壓積紅細胞按6:1體積比洗滌2～3次至上清澄清；

11、用紅細胞保存液和壓積紅細胞按6:1體積比洗滌1次，離心結束后棄去上清；

12、用紅細胞保存液配成3％和1％濃度的試劑紅細胞；

13、2)路徑2：

14、準備材料：md34透析袋mw:8000-14000、塑料夾子、塑料盒、2.5％氯化鈉溶液、1.6％氯化鈉溶液、0.9％氯化鈉溶液、紅細胞保存液；

15、室溫解凍，采用透析法，待冰凍紅細胞在室溫環(huán)境下完全解凍，移入透析袋內(nèi)，浸入2.5％氯化鈉溶液，室溫放置1小時，期間每15分鐘晃動一次或2～8℃環(huán)境下放置2小時；

16、取出，量取解凍后收集的總體積，以1:1的體積比加入1.6％氯化鈉溶液，混勻、離心棄上清；

17、用0.9％氯化鈉溶液和壓積紅細胞按6:1體積比洗滌1～2次至上清澄清；

18、用紅細胞保存液和壓積紅細胞按6:1體積比洗滌1次，離心結束后棄去上清；

19、用紅細胞保存液配成3％和1％濃度的試劑紅細胞。

20、本發(fā)明還提供了一種用于試劑紅細胞長期保存的冰凍和解凍系統(tǒng)，包括：

21、紅細胞凍存系統(tǒng)，用于將紅細胞進行凍存處理；

22、紅細胞解凍系統(tǒng)，用于將凍存的紅細胞進行解凍處理。

23、進一步，所述紅細胞凍存系統(tǒng)包括：

24、紅細胞處理設備，用于將新鮮紅細胞樣本置于血清學離心機中以1000g離心5分鐘，分離上層血漿和白膜層，并與0.9％氯化鈉溶液按體積比1:6混勻，洗滌紅細胞和再次離心；

25、制備紅細胞凍存液，精密稱取300～350g丙三醇，0.3g氯化鉀，16g枸櫞酸鈉，1.242g磷酸氫二鈉，0.571g磷酸二氫鈉，用純化水溶解并定容至1l，儲存于2～8℃；

26、紅細胞凍存液添加設備，用于將紅細胞與紅細胞保存液按體積比1:6混勻，離心后再與凍存液按1:1比例混合，并進行一系列溫度處理以最終保存于-60℃以下低溫中。

27、進一步，所述紅細胞解凍系統(tǒng)包括：

28、路徑1解凍設備，包括室溫解凍裝置、9％氯化鈉溶液、2.5％氯化鈉溶液、0.9％氯化鈉溶液、紅細胞保存液的存儲和處理設備；能夠在室溫環(huán)境下解凍紅細胞，并通過梯度洗脫法逐步加入不同濃度的氯化鈉溶液進行洗滌和離心，最終配成3％和1％濃度的試劑紅細胞。

29、進一步，所述紅細胞解凍系統(tǒng)包括：

30、路徑2解凍設備，包括md34透析袋、塑料夾子、塑料盒、2.5％氯化鈉溶液、1.6％氯化鈉溶液、0.9％氯化鈉溶液、紅細胞保存液的存儲和處理設備；能夠在室溫環(huán)境下解凍紅細胞，并將紅細胞置于透析袋內(nèi)，甘油不斷擴散到透析袋外、洗滌和離心，最終配成3％和1％濃度的試劑紅細胞。

31、結合上述的技術方案和解決的技術問題，本發(fā)明所要保護的技術方案所具備的優(yōu)點及積極效果為：

32、第一、本發(fā)明獲得一條簡單、便捷性凍存紅細胞、解凍紅細胞途徑，使紅細胞能長期有效凍存，且復溶后得率達80％以上，并保存紅細胞表面抗原的穩(wěn)定性。對于紅細胞表面抗原的研究、復雜抗體的研究、建立特殊血型試劑紅細胞庫、各廠家血型定型試劑質量控制至關重要，也為紅細胞血型血清學和基因型一致性評價奠定技術儲備和重要資源。

33、第二，本發(fā)明的技術方案轉化后的預期收益和商業(yè)價值為：此發(fā)明技術轉化后，不僅僅能將實驗室小規(guī)模的亞型紅細胞、稀有血型紅細胞制備轉化成為商品化、市場化的試劑紅細胞，更能變成其他紅細胞試劑的常規(guī)生產(chǎn)方式。還可將此技術運用于不規(guī)則抗體篩選紅細胞、譜細胞、質控品的試劑紅細胞制備。能將紅細胞長期儲存，使得臨床上發(fā)現(xiàn)的許多珍稀紅細胞資源有效保存、充分利用。為建立abo亞型試劑庫、稀有血型試劑庫奠定技術基礎。還可通過市場需求，有計劃性制備試劑紅細胞，也大大挺高了血液的利用率，減少了浪費。

34、紅細胞凍存操作簡單、方便，不需要其他特殊的儀器設備，可操作性強，可處理量大。冰凍紅細胞保存液配制簡單，無特殊化學成分，成本低廉。紅細胞在-60℃環(huán)境下可保存長達10年或更長，保存期間僅僅需要低溫冰箱運行成本。

35、獨創(chuàng)透析法解凍紅細胞，通過材料學原理最大程度去甘油，材料簡單、操作方便，代替目前常規(guī)用的逐步降低紅細胞洗滌液滲透壓的方式，能最大程度上保持紅細胞膜的完整性，提供高品質的試劑紅細胞，減少試驗時間，進而間接提高免疫血液學試驗水平，對輸血的有效性的以及血液學研究提供有利的支持。

36、本發(fā)明的技術方案填補了國內(nèi)外業(yè)內(nèi)技術空白：目前，血液免疫學實驗技術離不開抗原抗體反應，血清學用到抗體試劑生產(chǎn)純化方便，已大量商品化、標準化。而試劑紅細胞原料必須來源于人體，無法用其他來源的物質替代，所面臨的問題就十分復雜。主要問題是紅細胞體內(nèi)平均壽命120天左右，離體制備后效期35天。冰凍紅細胞是長期保存紅細胞的常規(guī)方式。但在后期解凍過程中，操作過程復雜且甘油殘留多，盡可能去除甘油就需要高滲鹽水和多次機械化洗滌，這就容易破壞紅細胞，導致得率低，保存后期紅細胞溶血快速，在常規(guī)血清學實驗中易造成假陽性和細胞膜棘突黏連干擾實驗結果，所以一般不采用解凍紅細胞的方式來制備試劑紅細胞。而本發(fā)明技術通過透析原理，將細胞截留在半透明膜內(nèi)，最大程度上避免了細胞損傷。

37、本發(fā)明的技術方案解決了人們一直渴望解決、但始終未能獲得成功的技術難題：解決了細胞解凍去甘油過程中對細胞的傷害。在解凍過程中，人們一直研究添加解凍保護液來保持細胞膜內(nèi)外滲透壓的平衡，解凍保護液一般采用和冰凍保存液類似的配方，降低甘油或大分子的濃度，但忽略解凍過程是去添加的過程，這就需要后期更多的洗滌，對細胞傷害更大。血液免疫學是一個多專業(yè)的交叉學科，合理利用利用材料學可以事半功倍。

38、本發(fā)明的技術方案克服了技術偏見：本發(fā)明技術通過后期一系列的實驗研究，克服了冰凍紅細胞不能作為試劑紅細胞的原料的技術偏見，通過后期研究，細胞膜完好，紅細胞血型糖類抗原和跨膜蛋白類抗原均無明顯減弱。冰凍、解凍紅細胞可作為試劑紅細胞制備的一種方式。

39、第三，本發(fā)明解決的現(xiàn)有技術的技術問題：

40、1.紅細胞長期保存穩(wěn)定性差：傳統(tǒng)的紅細胞保存方法在長時間存儲過程中容易導致紅細胞的活性和功能下降，影響其應用效果。

41、2.保存液配方不穩(wěn)定：現(xiàn)有的保存液配方可能無法提供足夠的保護，使紅細胞在凍結和解凍過程中容易受到損傷。

42、3.解凍過程復雜且效率低：許多現(xiàn)有的解凍方法操作繁瑣，步驟多，容易引入污染和誤操作，影響紅細胞的質量和安全性。

43、4.細胞損失率高：在凍結和解凍過程中，紅細胞的損失率較高，導致最終獲得的紅細胞數(shù)量不足，影響實驗或臨床應用。

44、技術方案的顯著技術進步：

45、1.提高紅細胞保存穩(wěn)定性：本發(fā)明通過優(yōu)化紅細胞凍存液配方，顯著提高了紅細胞在長期低溫保存中的穩(wěn)定性，減少了細胞的損傷和活性下降。

46、2.高效的紅細胞凍存方法：本發(fā)明提出了一種系統(tǒng)化的紅細胞凍存方法，采用多步洗滌和精確的溶液比例配置，確保紅細胞在凍結過程中得到充分保護，大幅降低了細胞的損失率。

47、3.簡化的解凍步驟：本發(fā)明提供了兩種紅細胞解凍路徑(梯度洗脫法和透析法)，大大簡化了解凍操作步驟，提高了解凍效率，同時有效減少了操作中的污染風險。

48、4.保持紅細胞活性：通過改進的保存液和科學的解凍過程，本發(fā)明能夠在解凍后保持紅細胞的高活性和功能完整性，確保其在后續(xù)應用中的效果。

49、5.可控的解凍過程：本發(fā)明的方法允許通過調(diào)整溶液的濃度和比例，靈活控制解凍過程中的紅細胞復蘇速度和效果，提高了解凍過程的可控性和重復性。

50、本發(fā)明針對紅細胞長期保存和解凍中的技術難題，提出了一系列改進措施，顯著提升了紅細胞保存和解凍的效果和效率。這些技術進步不僅提高了紅細胞的穩(wěn)定性和活性，還簡化了操作步驟，降低了細胞損失率，為紅細胞的長期保存和實際應用提供了更加可靠和高效的解決方案。