本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)，具體涉及一種以胚珠為外植體的仙客來組培繁殖方法。

背景技術(shù)：

1、仙客來（cyclamen?persicum）為報(bào)春花科仙客來屬球根花卉，原產(chǎn)地在歐洲南部希臘等地中海地區(qū)。因其花形奇特、品種繁多、花期長(zhǎng)且冬季盛開等優(yōu)點(diǎn)，已發(fā)展成為國(guó)內(nèi)外商品盆花中最重要的種類之一。商品仙客來大多是雜種f1一代，用種子繼續(xù)繁殖會(huì)出現(xiàn)性狀分離，難以保存?f1代的原有性狀和雜種優(yōu)勢(shì)。目前，我國(guó)仙客來的栽培技術(shù)水平已接近國(guó)外水平，但是還沒有成熟和完善的育種技術(shù)體系，仍然需要花費(fèi)巨額資金購(gòu)買國(guó)外的f1代種子，成為我國(guó)仙客來產(chǎn)業(yè)發(fā)展的制約瓶頸。

2、隨著國(guó)內(nèi)仙客來育種研究的不斷深入，出現(xiàn)了一些非常優(yōu)良的新種質(zhì)單株，然而，新的優(yōu)良種質(zhì)經(jīng)過種子繁殖后性狀容易出現(xiàn)分離，優(yōu)良性狀無法保存下來，加之多數(shù)具有特異花形的新種質(zhì)雄蕊或雌蕊敗育，只能無性繁殖。而仙客來無法用扦插、嫁接、分根等常規(guī)方法無性繁殖，因此，組織培養(yǎng)成為仙客來無性繁殖的唯一途徑。

3、國(guó)外在仙客來組培方面最成功的是日本，日本自上世紀(jì)80年代就開始進(jìn)行仙客來組培繁殖技術(shù)研究，目前仙客來組培快繁技術(shù)已進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用，但其繁殖技術(shù)屬商業(yè)機(jī)密從未公開。德國(guó)、美國(guó)、比利時(shí)等國(guó)也先后有關(guān)于仙客來野生種與雜交種組織培養(yǎng)的研究報(bào)道，但組培技術(shù)均是作為科研手段，未進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用。

4、近年來，國(guó)內(nèi)學(xué)者在仙客來組培接種材料、培養(yǎng)基篩選、愈傷組織誘導(dǎo)、器官再生誘導(dǎo)、體胚誘導(dǎo)等方面均進(jìn)行了大量研究。然而，已有的仙客來組培技術(shù)多采用葉片、塊莖做外植體，如中國(guó)專利cn101112179a公開了一種仙客來組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其是以葉片為外植體進(jìn)行仙客來器官再生組培繁殖的途徑；中國(guó)專利cn103238526a公開了一種利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖仙客來的方法，該技術(shù)是以仙客來球莖為外植體進(jìn)行組培繁殖的整套技術(shù)；中國(guó)專利cn104982331a公開了一種仙客來組培快繁方法，該技術(shù)是以花莖為外植體進(jìn)行仙客來組培繁殖的方法。

5、對(duì)于新優(yōu)單株來說，葉片、塊莖等外植體不但取材數(shù)量有限，而且存在由于材料消毒困難，導(dǎo)致接種成活率較低，器官再生過程中存在芽分化率低、成苗率低等問題，成為制約仙客來新優(yōu)單株組培無性系成功的重要因素。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中，仙客來組培存在的接種材料少、污染率高、分化增殖困難，出苗成活率低等問題，本發(fā)明提供了一種以胚珠為外植體的仙客來組培繁殖方法。該方法以未受精的胚珠為外植體，具有對(duì)植株無傷害、易于消毒、數(shù)量多、取材方便的優(yōu)點(diǎn)，依次經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)和優(yōu)選、芽誘導(dǎo)及分化增殖、壯苗培養(yǎng)、生根誘導(dǎo)、煉苗移栽等環(huán)節(jié)，最終建立一種易于接種成功、成苗率高且株型好、葉片數(shù)較多的組培技術(shù)新體系，有利于加速仙客來無性繁殖進(jìn)程，促進(jìn)國(guó)內(nèi)仙客來育種及產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、一種以胚珠為外植體的仙客來組培繁殖方法，包括如下步驟：

4、步驟1：胚珠接種

5、步驟1-1：取欲繁殖的仙客來優(yōu)良單株未開放或半開放（未受精）的花蕾，摘除花瓣留下子房；用流動(dòng)的自來水將子房沖洗2小時(shí)以上，在超凈工作臺(tái)上對(duì)其進(jìn)行清洗消毒后置于解剖鏡下，用解剖刀將胚珠剝離胎座；

6、步驟1-2：用解剖刀或鑷子沾取胚珠，接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，密封；

7、所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1/2ms培養(yǎng)基+2,4d?2.0mg/l+2-異戊烯腺嘌呤（2ip）0.8mg/l+水解酪蛋白500mg/l+糖30g/l+瓊脂6g/l，ph值為5.8-6.0；

8、步驟2：愈傷組織誘導(dǎo)及篩選

9、將接有胚珠的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于22-25℃完全黑暗的環(huán)境中連續(xù)培養(yǎng)3-5個(gè)月誘導(dǎo)其產(chǎn)生愈傷組織；其中，在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，每4周篩選致密、乳黃色或乳白色愈傷組織轉(zhuǎn)接種一次；

10、步驟3：芽誘導(dǎo)及增殖

11、步驟3-1：待連續(xù)黑暗培養(yǎng)愈傷組織3-5個(gè)月后，篩選致密、乳黃色或乳白色的愈傷組織轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基上進(jìn)行芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到不定芽；

12、步驟3-2：在不定芽增殖初期，篩選致密、出不定芽球多的愈傷組織作為增殖器官轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)；

13、步驟3-3：在不定芽增殖過程中，篩選至少含有3個(gè)芽點(diǎn)的芽叢進(jìn)行繼代培養(yǎng)；所述芽叢基部根據(jù)增殖培養(yǎng)基空間留有愈傷組織；

14、步驟3-4：根據(jù)芽叢以及芽叢基部留有的愈傷組織的發(fā)育情況，不斷重復(fù)步驟3-2和3-3，獲得更多基部帶有愈傷組織的芽叢；

15、所述分化培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基的配方相同，為：1/2ms培養(yǎng)基+6-芐基嘌呤?(6-ba)0.5～2.0mg/l+萘乙酸(naa)?0.05～0.2mg/l+水解酪蛋白100mg/l+糖30g/l+瓊脂6g/l；

16、步驟4：壯苗培養(yǎng)

17、對(duì)步驟3分化增殖得到的芽叢進(jìn)行修剪，使芽叢保留6個(gè)以上均勻分布的葉柄，并且基部留有愈傷組織，之后將芽叢轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基進(jìn)行1~2代的壯苗培養(yǎng)，得到無根試管苗；

18、所述壯苗培養(yǎng)基配方：1/2ms培養(yǎng)基+6-芐基嘌呤?(6-ba)?0.05~0.2mg/l+萘乙酸(naa)?0.01mg/l+水解酪蛋白100mg/l+糖30g/l+瓊脂6g/l；

19、步驟5：生根誘導(dǎo)

20、壯苗培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)健壯的無根試管苗進(jìn)行修剪，使芽叢上的芽點(diǎn)分布均勻，芽叢基部留有愈傷組織，然后轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30-45天，得到生根瓶苗；

21、步驟6：煉苗移栽

22、步驟6-1：將已生根的瓶苗，置于強(qiáng)自然光下煉苗5-7天之后進(jìn)行移栽；同時(shí)，于移栽前2-3天，將裝有已生根瓶苗的瓶蓋旋松并露出縫隙，使瓶苗透氣進(jìn)行煉苗；

23、步驟6-2：瓶?jī)?nèi)煉苗完成后，取出已生根的瓶苗，將其基部培養(yǎng)基洗凈，并移栽至鋪有移栽基質(zhì)的穴盤或泡沫培養(yǎng)箱中；移栽初期15天內(nèi)，用塑料薄膜覆蓋保持濕度85%以上，并控制光照強(qiáng)度小于6000lux，之后逐漸撤去塑料薄膜直至置于自然條件下；

24、步驟6-3：待苗木鋪滿穴盤或長(zhǎng)滿泡沫箱后，將其移栽至營(yíng)養(yǎng)缽中，進(jìn)行常規(guī)管理。

25、進(jìn)一步的，步驟1所述優(yōu)良單株指的是符合育種目標(biāo)且生長(zhǎng)健壯、無病、無蟲害的植株。

26、進(jìn)一步的，步驟1-1所述在超凈工作臺(tái)上對(duì)子房進(jìn)行的清洗消毒是指：先將子房置于70%的酒精中浸泡消毒30秒，浸泡完成后取出子房，用無菌水沖洗一遍；再置于2%次氯酸鈉溶液中浸泡消毒15-20分鐘，浸泡完成后取出子房，用無菌水沖洗三遍，每次5分鐘；上述每次浸泡消毒時(shí)，不斷振蕩裝有酒精或氯酸鈉溶液的容器。

27、進(jìn)一步的，步驟3所述增殖培養(yǎng)基中6-ba的濃度根據(jù)芽叢增殖情況及葉柄、葉片生長(zhǎng)情況在其原有基礎(chǔ)上進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，當(dāng)芽叢幼嫩芽過多，愈傷組織出現(xiàn)透明現(xiàn)象時(shí)，降低6-ba濃度；當(dāng)芽叢基部留有的愈傷組織分化芽點(diǎn)過少、愈傷組織出現(xiàn)褐化時(shí)，升高6-ba濃度。

28、進(jìn)一步的，步驟5所述生根培養(yǎng)基配方：1/2ms培養(yǎng)基+naa?0.5～1.0mg/l+iba?0.5～1.0mg/l。

29、進(jìn)一步的，步驟6-2所述穴盤為50穴穴盤。

30、進(jìn)一步的，步驟6-2所述移栽基質(zhì)優(yōu)選椰糠和蛭石以1：1質(zhì)量比復(fù)配的混合基質(zhì)，并且移栽基質(zhì)內(nèi)加入有0.1~0.5%敵磺鈉。

31、進(jìn)一步的，上述步驟3芽誘導(dǎo)及增殖、步驟4壯苗培養(yǎng)以及步驟5生根誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件相同，為溫度18-25℃，光照周期12h/d，光強(qiáng)度1500-4000lux。

32、本發(fā)明公開了一種以未受精胚珠為外植體進(jìn)行仙客來組培繁殖的整套技術(shù)方案，提供了仙客來組培繁殖“胚珠外植體啟動(dòng)、水解酪蛋白營(yíng)養(yǎng)支撐、動(dòng)態(tài)激素調(diào)控、芽叢狀增殖、壯苗態(tài)生根及瓶?jī)?nèi)、瓶外煉苗移栽”的整體思路和具體方法，為提高仙客來組培接種成活率和出苗成活率及株型塑造提供了有效的新途徑。具體的：

33、（1）本發(fā)明以未受精的胚珠為外植體材料，具有對(duì)植株無傷害、數(shù)量多、取材方便的優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)獲得較多的外植體接種材料；因仙客來胚珠在子房?jī)?nèi)處于一種無菌狀態(tài)，故以胚珠為外植體，易于獲得無菌的外植體材料，污染率極低，克服了采用葉片、球莖等其他外植體易污染的缺陷；并且探索在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入水解酪蛋白，不僅降低了愈傷組織的褐化率，而且使得胚珠接種成功率達(dá)95%以上；

34、（2）在不定芽繼代培養(yǎng)及生根過程中，采用了根據(jù)愈傷組織生長(zhǎng)情況，進(jìn)行激素動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的方案，有效抑制了愈傷組織的玻璃化或褐變，愈傷組織誘導(dǎo)芽分化率達(dá)96%~100%；

35、（3）本發(fā)明在不定芽增殖、壯苗以及生根培養(yǎng)中，均以芽叢狀或叢生苗的形態(tài)進(jìn)行，并保證芽叢基部留有適量的愈傷組織，使仙客來出苗率和生根率最高可達(dá)到100%；同時(shí)，本發(fā)明在不定芽增殖過程中，就有選擇性的對(duì)芽點(diǎn)數(shù)較多的芽叢進(jìn)行篩選，并且在后期壯苗培養(yǎng)和煉苗培養(yǎng)時(shí)，均對(duì)芽叢的形態(tài)進(jìn)行了適當(dāng)修剪，加快了組培苗成型速度，使得組培苗株型緊湊、豐滿、勻稱，葉片數(shù)較多；

36、（4）本發(fā)明采用瓶?jī)?nèi)煉苗與瓶外煉苗相結(jié)合的方式進(jìn)行煉苗，并采用特有的移栽基質(zhì)，使得仙客來瓶苗更加健壯，更易于適應(yīng)后期的移栽環(huán)境，成活率達(dá)95%~100%。

37、本發(fā)明技術(shù)方案的應(yīng)用，將會(huì)顯著提高仙客來組培苗生產(chǎn)效益，為仙客來組培苗商業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。