本發(fā)明涉及細(xì)胞與組織工程，具體涉及一種用于腎臟類器官的凍存液、制備方法及使用方法。

背景技術(shù)：

1、腎臟類器官是一種體外培育而成的具備三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞復(fù)合體，能夠模擬腎臟的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和功能，已成為疾病模型構(gòu)建、藥物篩選和再生醫(yī)學(xué)研究的重要工具。腎臟類器官的凍存和復(fù)蘇作為整個(gè)技術(shù)應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)，目前凍存多采用慢速冷凍法和玻璃化法，其中，慢速冷凍法采用低濃度的冷凍保護(hù)劑（cryoprotective?agents,?cpas），玻璃化法采用高濃度的冷凍保護(hù)劑，在冷凍和復(fù)蘇過(guò)程中若有冰晶形成和溶解將會(huì)破壞細(xì)胞間的連接，導(dǎo)致腎臟類器官的三維結(jié)構(gòu)崩解或功能喪失；冷凍保護(hù)劑包括二甲基亞砜和血清，二甲基亞砜雖然可以防止細(xì)胞凍傷，但對(duì)細(xì)胞和組織具有潛在毒性，可能導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷、蛋白質(zhì)變性和代謝紊亂，從而影響腎臟類器官的存活率和功能；血清雖然可以為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，但對(duì)來(lái)源于干細(xì)胞的腎臟類器官具有不可控的潛在分化影響，影響凍存后的復(fù)蘇成功率。故而，有必要開發(fā)適用于腎臟類器官的凍存液及凍存方法，以提高腎臟類器官凍存的保存效果和凍存復(fù)蘇的成功率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種用于腎臟類器官的凍存液、制備方法及使用方法，所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何減少凍存后腎臟類器官的損傷。

2、本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、第一方面提供一種用于腎臟類器官的凍存液，按重量份計(jì)包括以下成分：

4、4.7～5.3份cs10細(xì)胞凍存液；

5、3.5～4.5份kosr血清替代物；

6、0.8～1.2份改良培養(yǎng)基；

7、其中，上述改良培養(yǎng)基包括rpmi?1640培養(yǎng)基和l-丙氨酰-l-谷氨酰胺，上述rpmi1640培養(yǎng)基的重量是l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的3.5～4.5倍。

8、由于腎臟類器官凍存相較于普通細(xì)胞或干細(xì)胞凍存存在區(qū)別，具體區(qū)別如下：

9、(1)腎臟類器官的組織復(fù)雜性:?腎臟類器官具有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)和多種細(xì)胞類型（如足細(xì)胞、不同區(qū)域的腎小管上皮細(xì)胞等）；而普通細(xì)胞或干細(xì)胞凍存通常針對(duì)單一細(xì)胞類型；

10、(2)凍存介質(zhì)：腎臟類器官的凍存需要優(yōu)化的凍存介質(zhì)，以保護(hù)多種細(xì)胞類型和組織結(jié)構(gòu)，需要加入特定的保護(hù)劑以防止類器官結(jié)構(gòu)的損傷；而普通細(xì)胞或干細(xì)胞凍存通常使用標(biāo)準(zhǔn)的凍存介質(zhì)（如含有二甲基亞砜和血清的溶液）；

11、(3)保存時(shí)間:腎臟類器官的預(yù)期凍存時(shí)間可以達(dá)到數(shù)小時(shí)至數(shù)天，但目前技術(shù)仍有限制；而普通細(xì)胞或干細(xì)胞的凍存時(shí)間可以達(dá)到數(shù)年甚至更長(zhǎng)。

12、基于以上凍存區(qū)別，向上述cs10細(xì)胞凍存液加入kosr血清替代物和改良培養(yǎng)基以稀釋二甲基亞砜的濃度，使凍存液中的二甲基亞砜達(dá)到所需的最低濃度，既降低了冰晶的形成，又避免了二甲基亞砜濃度過(guò)高帶來(lái)的細(xì)胞毒性；通過(guò)kosr血清替代物解決了血清對(duì)腎臟類器官不可控的分化影響。

13、此外，由于cs10細(xì)胞凍存液含有平衡鹽溶液、抗氧化劑、糖類和蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑等，這些成分共同作用于腎臟類器官，提供一個(gè)優(yōu)化的冷凍環(huán)境，減少冷凍和解凍過(guò)程中細(xì)胞的損傷；平衡鹽溶液有助于維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡，防止細(xì)胞因滲透壓失衡而受損；抗氧化劑能夠清除凍存過(guò)程中產(chǎn)生的自由基，減少氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷；糖類（如葡萄糖）作為能量來(lái)源，支持細(xì)胞在凍存期間的代謝需求；蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑能夠保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，防止其因冷凍而變性或降解。改良培養(yǎng)基含有豐富的氨基酸、維生素和無(wú)機(jī)鹽，為腎臟類器官提供了必要的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境支持，幫助細(xì)胞維持代謝活動(dòng)和功能完整性，有助于其在凍存后的復(fù)蘇和存活；l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的添加有助于維持腎臟類器官在凍存期間的代謝活性，減少因代謝減緩而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。kosr血清替代物作為培養(yǎng)基補(bǔ)充劑，富含生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為腎臟類器官提供營(yíng)養(yǎng)支持，有助于維持腎臟類器官的結(jié)構(gòu)和功能完整性。

14、進(jìn)一步的，按重量份計(jì)包括以下成分：

15、5份細(xì)胞凍存液；

16、4份kosr血清替代物；

17、1份改良培養(yǎng)基；

18、其中，上述改良培養(yǎng)基中rpmi?1640培養(yǎng)基的重量是l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的4倍。

19、上述細(xì)胞凍存液中的二甲基亞砜與基質(zhì)溶液中的平衡鹽溶液協(xié)同作用，有助于維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡，防止細(xì)胞因滲透壓失衡而破裂；二甲基亞砜與kosr血清替代物中的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)共同作用于腎臟類器官，為細(xì)胞提供必要的保護(hù)和支持，促進(jìn)細(xì)胞在凍存后的復(fù)蘇和生長(zhǎng)?；|(zhì)溶液中的抗氧化劑可以輔助kosr血清替代物中的生長(zhǎng)因子，共同抵御凍存過(guò)程中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷；基質(zhì)溶液中的糖類和蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑與改良培養(yǎng)基中的氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)共同作用，為腎臟類器官提供全面的營(yíng)養(yǎng)支持，有助于維持腎臟類器官的結(jié)構(gòu)和功能完整性。kosr血清替代物與改良培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相互補(bǔ)充，為腎臟類器官提供全面的營(yíng)養(yǎng)支持，有助于腎臟類器官在凍存后的復(fù)蘇和生長(zhǎng)，維持其結(jié)構(gòu)和功能的完整性。與現(xiàn)有技術(shù)中濃度為10%的二甲基亞砜相比，本發(fā)明減小了二甲基亞砜在凍存液中的濃度，二甲基亞砜濃度僅為5%，削弱了凍存液對(duì)于腎臟類器官的潛在細(xì)胞毒性；由于凍存液中不含血清成分，解決了凍存液對(duì)腎臟類器官的分化影響，提高了腎臟類器官凍存后的復(fù)蘇成功率。

20、進(jìn)一步的，上述改良培養(yǎng)基中l(wèi)-丙氨酰-l-谷氨酰胺的濃度為2mm。

21、第二方面提供一種凍存液制備方法，該方法用于制備上述的凍存液；

22、該制備方法包括以下步驟：

23、按比例4：1，取上述rpmi?1640培養(yǎng)基和l-丙氨酰-l-谷氨酰胺，放入容器后混合均勻，得到改良培養(yǎng)基；

24、將上述改良培養(yǎng)基保存在溫度為4℃的條件下；

25、在室溫條件下，按比例5：4：1取出保存溫度為4℃的cs10細(xì)胞凍存液、kosr血清替代物?和改良培養(yǎng)基，放入容器后混合均勻，得到凍存液。

26、先混合比例4：1的rpmi?1640培養(yǎng)基和l-丙氨酰-l-谷氨酰胺制得改良培養(yǎng)基備用；由于cs10細(xì)胞凍存液中的二甲基亞砜濃度為10%；后通過(guò)添加kosr血清替代物?和改良培養(yǎng)基混合，降低二甲基亞砜的濃度，避免二甲基亞砜濃度過(guò)高帶來(lái)的細(xì)胞毒性。將cs10細(xì)胞凍存液、kosr血清替代物和改良培養(yǎng)基保存在4℃條件下，確保了其在與其他成分混合前的穩(wěn)定性；在室溫條件下混合cs10細(xì)胞凍存液、kosr血清替代物?和改良培養(yǎng)基，有助于各成分的快速均勻分散，同時(shí)避免了低溫對(duì)混合過(guò)程的影響。

27、進(jìn)一步的，在室溫條件下，混合上述cs10細(xì)胞凍存液、kosr血清替代物和改良培養(yǎng)基，得到凍存液的具體步驟包括：

28、上述cs10細(xì)胞凍存液和改良培養(yǎng)基按比例1：1，取保存溫度為4℃的cs10細(xì)胞凍存液和改良培養(yǎng)基并放入容器，在上述容器中混合cs10細(xì)胞凍存液和改良培養(yǎng)基，得到第二混合溶液；

29、上述第二混合溶液和kosr血清替代物按比例1：1，取保存溫度為4℃的kosr血清替代物并放入容器，混合kosr血清替代物和第二混合溶液，得到第三混合溶液；

30、上述第三混合溶液和cs10細(xì)胞凍存液按比例4：3，取保存溫度為4℃的cs10細(xì)胞凍存液并放入容器，混合第三混合溶液和cs10細(xì)胞凍存液，得到第四混合溶液；

31、上述第四混合溶液和kosr血清替代物按比例7：2，取保存溫度為4℃的kosr血清替代物并放入容器，混合第四混合溶液和kosr血清替代物，得到第五混合溶液；

32、上述第五混合溶液和cs10細(xì)胞凍存液按比例9：1，取保存溫度為4℃的cs10細(xì)胞凍存液并放入容器，混合第五混合溶液和cs10細(xì)胞凍存液，得到凍存液。

33、基于上述cs10細(xì)胞凍存液添加改良培養(yǎng)基，不僅為凍存液增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還起到稀釋cs10細(xì)胞凍存液的作用，降低二甲基亞砜的濃度，避免二甲基亞砜濃度過(guò)高帶來(lái)的細(xì)胞毒性；向第二混合溶液添加kosr血清替代物，不僅為凍存液補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還起到稀釋二甲基亞砜濃度，降低細(xì)胞毒性的作用；分多步添加cs10細(xì)胞凍存液和kosr血清替代物，旨在進(jìn)一步均勻分散各成分，確保它們?cè)趦龃嬉褐械木夥植肌?/p>

34、第三方面提供一種凍存液使用方法，上述制備方法制得的凍存液采用該使用方法；

35、該使用方法包括以下步驟：

36、將制得的上述凍存液注入容量為2ml的凍存管，每支凍存管注入800ul凍存液，得到待使用凍存管；

37、將腎臟類器官放入上述待使用凍存管，腎臟類器官與待使用凍存管內(nèi)的凍存液接觸，得到待冷凍凍存管；

38、將上述待冷凍凍存管放入梯度凍存盒，再將該梯度凍存盒放入-80℃超低溫冰箱；上述腎臟類器官的溫度降至-80℃后，將待冷凍凍存管轉(zhuǎn)移至裝有液氮的液氮罐中。

39、對(duì)上述凍存液進(jìn)行分液處理，800ul的凍存液通常能夠提供適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，有助于提高細(xì)胞在冷凍和解凍過(guò)程中的存活率；此外，在冷凍過(guò)程中，液體會(huì)結(jié)冰并膨脹，在2ml的凍存管中只加入800ul的液體能夠預(yù)留一定的空間，防止凍存管因內(nèi)部壓力過(guò)大而破裂。將腎臟類器官放入待使用凍存管，使腎臟類器官充分浸潤(rùn)在凍存液中，確保腎臟類器官在冷凍過(guò)程中得到充分且全面的營(yíng)養(yǎng)支持和保護(hù)，減少損傷。通過(guò)梯度降溫的方式，使腎臟類器官逐漸適應(yīng)低溫環(huán)境，減少因溫度驟降導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，提高腎臟類器官在冷凍過(guò)程中的存活率，減少冰晶的形成和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞；利用液氮的超低溫環(huán)境，長(zhǎng)期保存腎臟類器官，確保腎臟類器官在超低溫下保持穩(wěn)定，延長(zhǎng)保存時(shí)間，同時(shí)減少因溫度變化導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。

40、進(jìn)一步的，將上述待冷凍凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐所用時(shí)長(zhǎng)小于2分鐘。

41、避免上述待冷凍凍存管長(zhǎng)時(shí)間暴露于室溫環(huán)境中，影響腎臟類器官的凍存效果。

42、上述腎臟類器官在-80℃超低溫冰箱中已經(jīng)達(dá)到了一個(gè)穩(wěn)定的低溫狀態(tài)，如果轉(zhuǎn)移時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致溫度波動(dòng)，從而影響腎臟類器官的冷凍保存效果；控制在2分鐘內(nèi)完成轉(zhuǎn)移，可以最大限度地減少溫度波動(dòng)，保持腎臟類器官在穩(wěn)定的低溫環(huán)境中；在-80℃下，腎臟類器官中的水分已經(jīng)形成了穩(wěn)定的冰晶結(jié)構(gòu)，如果轉(zhuǎn)移時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，冰晶可能會(huì)因?yàn)闇囟炔▌?dòng)而重新排列或形成新的冰晶，從而對(duì)腎臟類器官造成損傷；快速轉(zhuǎn)移至液氮罐可以保持冰晶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，防止冰晶重新形成導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。細(xì)胞在低溫下保持活性的能力是有限的，長(zhǎng)時(shí)間的溫度波動(dòng)或暴露于非理想環(huán)境中可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性下降，快速轉(zhuǎn)移至液氮罐可以最大限度地保持細(xì)胞的活性，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用提供更好的材料基礎(chǔ)。此外，快速轉(zhuǎn)移至液氮罐還可以減少因長(zhǎng)時(shí)間暴露于非液氮環(huán)境而導(dǎo)致的其他潛在風(fēng)險(xiǎn)，如污染、氧化等，這些因素都可能影響腎臟類器官的保存質(zhì)量，因此快速轉(zhuǎn)移有助于提高整體的保存效果。

43、進(jìn)一步的，在得到上述待使用凍存管后，根據(jù)凍存液的等待使用時(shí)間確定待使用凍存管的保存溫度，具體步驟包括：

44、預(yù)設(shè)上述凍存液配制完成時(shí)間為初始時(shí)間，將腎臟類器官放入待使用凍存管的時(shí)間為使用時(shí)間，使用時(shí)間與初始時(shí)間的差值為等待使用時(shí)間；

45、若上述等待使用時(shí)間小于30分鐘，則將待使用凍存管置于室溫；

46、若上述等待使用時(shí)間大于30分鐘且小于24小時(shí)，則將待使用凍存管置于4℃；

47、若上述等待使用時(shí)間大于24小時(shí)，則將待使用凍存管置于-20℃。

48、凍存液等待使用時(shí)間較短，凍存液中的成分和穩(wěn)定性不會(huì)受到顯著影響，因此將待使用凍存管置于室溫環(huán)境中，既可以方便后續(xù)操作，又不會(huì)對(duì)腎臟類器官的凍存造成不利影響；隨著等待時(shí)間的延長(zhǎng)，凍存液中的某些成分可能會(huì)開始發(fā)生微妙的變化，如蛋白質(zhì)的變性或某些化學(xué)物質(zhì)的降解，將待使用凍存管置于4℃環(huán)境下可以減緩這些變化的速度，從而保持凍存液的穩(wěn)定性和有效性；此外，4℃的溫度還可以防止細(xì)菌和其他微生物的生長(zhǎng)，確保凍存液在長(zhǎng)時(shí)間等待過(guò)程中的衛(wèi)生安全。當(dāng)?shù)却龝r(shí)間超過(guò)24小時(shí)后，室溫下凍存液中的成分會(huì)發(fā)生顯著變化，甚至失去對(duì)腎臟類器官的保護(hù)作用,將待使用凍存管置于-20℃可以進(jìn)一步減緩成分變化的速度，并延長(zhǎng)凍存液的保存時(shí)間。

49、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

50、基于以上凍存區(qū)別，向上述cs10細(xì)胞凍存液加入kosr血清替代物和改良培養(yǎng)基以稀釋二甲基亞砜的濃度，使凍存液中的二甲基亞砜達(dá)到所需的最低濃度（僅為5%），既降低了冰晶的形成，又避免了二甲基亞砜濃度過(guò)高帶來(lái)的細(xì)胞毒性；通過(guò)kosr血清替代物解決了血清對(duì)腎臟類器官不可控的分化影響。

51、此外，由于cs10細(xì)胞凍存液含有平衡鹽溶液、抗氧化劑、糖類和蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑等，這些成分共同作用于腎臟類器官，提供一個(gè)優(yōu)化的冷凍環(huán)境，減少冷凍和解凍過(guò)程中細(xì)胞的損傷；平衡鹽溶液有助于維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡，防止細(xì)胞因滲透壓失衡而受損；抗氧化劑能夠清除凍存過(guò)程中產(chǎn)生的自由基，減少氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷；糖類（如葡萄糖）作為能量來(lái)源，支持細(xì)胞在凍存期間的代謝需求；蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑能夠保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，防止其因冷凍而變性或降解。改良培養(yǎng)基含有豐富的氨基酸、維生素和無(wú)機(jī)鹽，為腎臟類器官提供了必要的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境支持，幫助細(xì)胞維持代謝活動(dòng)和功能完整性，有助于其在凍存后的復(fù)蘇和存活；l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的添加有助于維持腎臟類器官在凍存期間的代謝活性，減少因代謝減緩而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。kosr血清替代物作為培養(yǎng)基補(bǔ)充劑，富含生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為腎臟類器官提供營(yíng)養(yǎng)支持，有助于維持腎臟類器官的結(jié)構(gòu)和功能完整性。

52、由于凍存液中不含血清成分，解決了凍存液對(duì)腎臟類器官的分化影響，提高了腎臟類器官凍存后的復(fù)蘇成功率。