、構(gòu)建含有&ylA. 105基因的重組克隆載體
[0094] 將合成的Cry 1A. 105核巧酸序列連入克隆載體pGEM-T(Promega，Madison, USA， CAT ;A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM-T載體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，得到重組克隆載體 DBN01-T，其構(gòu)建流程如圖1所示（其中，Amp表示氨節(jié)青霉素抗性基因；n表示瞻菌體n 的復(fù)制起點(diǎn)；LacZ為L(zhǎng)acZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動(dòng)子；T7為T(mén)7RNA聚合酶啟 動(dòng)子；CrylA. 105為CrylA. 105核巧酸序列（SEQ ID N0:2) ;MCS為多克隆位點(diǎn)）。
[0095] 然后將重組克隆載體DBN01-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞 (Transgen，Beijing, China, CAT ;CD501)，其熱激條件為；50 y 1 大腸桿菌 T1 感受態(tài) 細(xì)胞、lOyl質(zhì)粒DNA(重組克隆載體DBN01-T)，42°C水浴30秒；37°C振蕩培養(yǎng)1小 時(shí)（10化pm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動(dòng)），在表面涂有IPTG(異丙基硫代-0-D-半乳糖巧）和 X-gal (5-漠-4-氯-3-嘲噪-0 -D-半乳糖巧）的氨節(jié)青霉素（100毫克/升）的LB平板 (膜蛋白腺lOg/L，酵母提取物5g/l，化C1 lOg/L，瓊脂15g/L，用化0H調(diào)抑至7. 5)上生長(zhǎng) 過(guò)夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基（膜蛋白腺lOg/l，酵母提取物5g/l，化C1 lOg/l，氨 節(jié)青霉素lOOmg/L，用化0H調(diào)抑至7. 5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過(guò)夜。堿法提取其質(zhì)粒： 將菌液在1200化pm轉(zhuǎn)速下離屯、Imin，去上清液，沉淀菌體用100 y 1冰預(yù)冷的溶液I (25mM Tris-肥l，10mM邸TA(己二胺四己酸），50mM葡萄糖，P服.0)懸浮；加入200 y 1新配制的溶 液II (0. 2M化0H，1 % SDS (十二燒基硫酸鋼）），將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min ;力口 入150 y 1冰冷的溶液III (3M醋酸鐘，5M醋酸），立即充分混勻，冰上放置5-lOmin ;于溫度 4°C、轉(zhuǎn)速1200化pm條件下離屯、5min，在上清液中加入2倍體積無(wú)水己醇，混勻后室溫放置 5min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速1200化pm條件下離屯、5min，棄上清液，沉淀用濃度（V/V)為70%的 己醇洗漆后驚干；加入 30 y 1 含 RNase(20 y g/ml)的 TE(10mM Tris-肥 1，ImM 邸TA，P服.0) 溶解沉淀；于溫度37°C下水浴30min，消化RNA ;于溫度-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0096] 提取的質(zhì)粒經(jīng)Ahdl和化〇1酶切鑒定后，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組 克隆載體08^1-1'中插入的所述化714.105核巧酸序列為序列表中569 10^:2所示的核 巧酸序列，即化ylA. 105核巧酸序列正確插入。
[0097] 按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述化y2Ab核巧酸序列 連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN02-T，其中，化y2Ab為化y2Ab核巧酸序列 (SEQ ID N0:4)。酶切和測(cè)序驗(yàn)證重組克隆載體DBN02-T中所述&y2Ab核巧酸序列正確插 入。
[009引 2、構(gòu)建含有&ylA. 105基因的重組表達(dá)載體
[0099] 用限制性內(nèi)切酶化〇1和Hindlll分別酶切重組克隆載體DBN01-T和表達(dá)載體 DBNBC-01 (載體骨架；pCAMBIA2301 (CAMBIA機(jī)構(gòu)可W提供）），將切下的CrylA. 105核巧酸 序列片段插到表達(dá)載體DBNBC-01的化〇1和Hindlll位點(diǎn)之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建 載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達(dá)載體DBN100745,其構(gòu)建流程如圖2所示 化an ;卡那霉素基因；RB ;右邊界；化i ;玉米化iquitin(泛素）基因啟動(dòng)子（SEQ ID N0:5); &ylA. 105 ;&ylA. 105核巧酸序列（SEQ ID N0:2) ;Nos ;姻脂堿合成酶基因的終止子（SEQ ID N0:6)出pt ;潮霉素磯酸轉(zhuǎn)移酶基因（SEQ ID N0:7) ;LB ;左邊界）。
[0100] 將重組表達(dá)載體DBN100745用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞，其熱激條 件為；50y 1大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞、lOy 1質(zhì)粒DNA(重組表達(dá)載體DBN100745)，42°C 水浴30秒；37°C振蕩培養(yǎng)1小時(shí)（10化pm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動(dòng)）；然后在含50mg/L卡那霉素 化anamycin)的LB固體平板（膜蛋白腺lOg/L，酵母提取物Sg/U^Cl lOg/L，瓊脂15g/L， 用化OH調(diào)抑至7. W上于溫度37°C條件下培養(yǎng)12小時(shí)，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基 (膜蛋白腺lOg/L，酵母提取物5g/L，化C1 lOg/L，卡那霉素50mg/l，用化0H調(diào)抑至7. 5) 中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過(guò)夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶化〇1 和Hindlll酶切后鑒定，并將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100745 在化〇1和Hindlll位點(diǎn)間的核巧酸序列為序列表中SEQ ID N0:2所示核巧酸序列，即 化ylA. 105核巧酸序列。
[0101] 按照上述構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100745的方法，將化〇1和Spel酶切重組克隆 載體DBN02-T切下的所述&y2Ab核巧酸序列插入表達(dá)載體DBNBC-01，得到重組表達(dá)載體 DBN100744。酶切和測(cè)序驗(yàn)證重組表達(dá)載體DBN100744中的核巧酸序列含有為序列表中SEQ ID NO: 4所示核巧酸序列，即化y2Ab核巧酸序列，所述化y2Ab核巧酸序列可W連接所述化i 啟動(dòng)子和Nos終止子。
[0102] 按照上述構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100745的方法，將化〇1和化ndlll、化〇1和Spel 分別酶切重組克隆載體DBN01-T和DBN02-T切下的所述化ylA. 105核巧酸序列和化y2Ab 核巧酸序列插入表達(dá)載體DBNBC-01，得到重組表達(dá)載體DBN100029。酶切和測(cè)序驗(yàn)證重組 表達(dá)載體08化00029中的核巧酸序列含有為序列表中569 10^:2和569 10^:4所示核 巧酸序列，即化ylA. 105核巧酸序列和化y2Ab核巧酸序列，所述化ylA. 105核巧酸序列和 所述化y2Ab核巧酸序列可W連接所述化i啟動(dòng)子和Nos終止子。
[0103] 3、重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0104] 對(duì)己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體DBN100745、DBN100744和DBN100029用液氮法轉(zhuǎn) 化到農(nóng)桿菌 LBA4404(Invitrgen，Chicago,USA，CAT ; 18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為；100 uL 農(nóng)桿菌LBA4404、3uL質(zhì)粒DNA(重組表達(dá)載體）；置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘； 將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28°C、轉(zhuǎn)速為20化pm條件下培養(yǎng)2小 時(shí)，涂于含50mg/L的利福平化ifampicin)和lOOmg/L的卡那霉素化anamycin)的LB平板 上直至長(zhǎng)出陽(yáng)性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Ahdl和化〇1對(duì)重 組表達(dá)載體DBN100745、DBN100744和DBN100029酶切后進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá) 載體 DBN100745、DBN100744 和 DBN100029 結(jié)構(gòu)完全正確。
[01化]第S實(shí)施例、轉(zhuǎn)基因植株的獲得
[0106] 1、獲得轉(zhuǎn)基因玉米植株
[0107] 按照常規(guī)采用的農(nóng)桿菌侵染法，將無(wú)菌培養(yǎng)的玉米品種綜31狂31)的幼胚與第二 實(shí)施例中3所述的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，W將第二實(shí)施例中2構(gòu)建的重組表達(dá)載體DBN100745、 DBN100744和DBN100029中的T-DNA(包括玉米化iquitin基因的啟動(dòng)子序列、CrylA. 105 核巧酸序列、化y2Ab核巧酸序列、化t基因和Nos終止子序列）轉(zhuǎn)入到玉米染色體組中，獲 得了轉(zhuǎn)入化ylA. 105核巧酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入化y2Ab核巧酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入 &ylA. 105-&y2Ab核巧酸序列的玉米植株；同時(shí)W野生型玉米植株作為對(duì)照。
[0108] 對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化，簡(jiǎn)要地，從玉米中分離未成熟的幼胚，用農(nóng)桿 菌懸浮液接觸幼胚，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)⒒痽lA. 105核巧酸序列、化y2Ab核巧酸序列和 化ylA. 105-化y2Ab核巧酸序列傳遞至幼胚之一的至少一個(gè)細(xì)胞（步驟1 ;侵染步驟），在此 步驟中，幼胚優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液（〇Dew= 0. 4-0. 6,侵染培養(yǎng)基（MS鹽4. 3g/L、MS維 他命、干酪素300mg/L、庶糖68. 5g/L、葡萄糖36g/L、己酷了香酬（A巧40mg/L、2, 4-二氯苯 氧己酸（2,4-D)lmg/L，p冊(cè).3))中W啟動(dòng)接種。幼胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時(shí)期（3天）（步 驟2 ;共培養(yǎng)步驟）。優(yōu)選地，幼胚在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基（MS鹽4. 3g/L、MS維他命、 干酪素300mg/L、庶糖20g/L、葡萄糖lOg/L、己酷了香酬（A巧100mg/L、2, 4-二氯苯氧己酸 (2,4-D)lmg/L、瓊脂8g/L，p冊(cè).8)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，可W有一個(gè)選擇性的"恢復(fù)" 步驟。在"恢復(fù)"步驟中，恢復(fù)培養(yǎng)基（MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、庶糖30g/ L、2, 4-二氯苯氧己酸（2, 4-D) Img/L、植物凝膠3g/L，抑5. 8)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿 菌生長(zhǎng)的抗生素（頭抱霉素），不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑（步驟3 ;恢復(fù)步驟）。優(yōu)選地， 幼胚在有抗生素但沒(méi)有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，W消除農(nóng)桿菌并為侵染細(xì)胞提供恢復(fù) 期。接著，接種的幼胚在含選擇劑（潮霉素）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長(zhǎng)著的轉(zhuǎn)化愈傷組 織（步驟4 ;選擇步驟）。優(yōu)選地，幼胚在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基（MS鹽4. 3g/L、MS維 他命、干酪素300mg/L、庶糖30g/L、潮霉素50mg/L、2, 4-二氯苯氧己酸（2, 4-D) Img/L、植物 凝膠3g/L，p冊(cè).8)上培養(yǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)。然后，愈傷組織再生成植物（步驟 5 ;再生步驟），優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的愈傷組織在固體培養(yǎng)基（MS分化培養(yǎng) 基和MS生根培養(yǎng)基）上培養(yǎng)W再生植物。
[0109] 篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到所述MS分化培養(yǎng)基（MS鹽4. 3g/L、MS維他命、 干酪素300mg/L、庶糖30g/L、6-節(jié)基腺嚷嶺2mg/L、潮霉素50mg/L、植物凝膠3g/L，P冊(cè).8) 上，25°C下培養(yǎng)分化。分化出來(lái)的小苗轉(zhuǎn)移到所述MS生根培養(yǎng)基（MS鹽2. 15g/L、MS維他 命、干酪素300mg/L、庶糖30g/L、嘲噪-3-己酸Img/L、植物凝膠3g/L，抑5. 8)上，25°C下培 養(yǎng)至約10cm高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實(shí)。在溫室中，每天于28°C下培養(yǎng)16小時(shí)，再于20°C下 培養(yǎng)8小時(shí)。
[0110] 2、獲得轉(zhuǎn)基因高梁植株
[0111] 參考 Molecular Biology and Genetic 化gineering ISSN 2053-5767 的高梁轉(zhuǎn) 化方法。收集高梁品種APKI的種子，并用清水沖洗數(shù)次；浸泡于tween-20浸潤(rùn)液中5分鐘； 之后用雙蒸水懸浮清洗，并在通風(fēng)榻中干燥；種子表面用70% (v/v)己醇消毒30秒，緊接 著用0. 1% (w/v)HgCl2消毒6分鐘；再用雙蒸水清洗5-6次；將種子鋪于含有MS基礎(chǔ)固體培 養(yǎng)基（P冊(cè).8)的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿擺放于溫度為24±2°C、相對(duì)濕度為70%、光周期（光 /暗）為12:12的培養(yǎng)間中；3-5天后，種子發(fā)芽，取莖尖外植體浸泡于農(nóng)桿菌中30分鐘； 取出浸泡后的外植體擺放于已滅菌的濾紙上；黑暗條件下共培養(yǎng)72小時(shí)