化方法參考河北農(nóng)業(yè)大學(xué)2012級碩±王寒玉學(xué)位論文第9頁至第10頁。將成 熟種子在0.1% (v/v)Tween-20溶液中浸泡后，用70% (v/v)己醇清洗，然后轉(zhuǎn)移到0.1% (w/v) HgC12溶液中，最后用滅菌水清洗2-3次。將經(jīng)過滅菌處理的種子轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基 上，溫度25°C暗培養(yǎng)2-3天。待種子莖尖長到4-6mm時(shí)，在無菌條件下將莖尖轉(zhuǎn)移到愈傷誘 導(dǎo)培養(yǎng)基上。
[0131] 莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)：將誘導(dǎo)后的莖尖愈傷組織浸取農(nóng)桿菌菌懸液30分鐘，取 出莖尖愈傷組織放于已滅菌濾紙上，吸出多余菌液，轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上（MS+lOOmol/ L AS+2, 4-D)，溫度28°C黑暗中共培養(yǎng)2-4天。之后將共培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)到MS愈傷 誘導(dǎo)培養(yǎng)基（2,4-D 4.5ymol/L、2.25ymol/L拉1、頭抱霉素500mg/L)上，溫度25°C暗培 養(yǎng)，每兩周對愈傷進(jìn)行一次繼代。幼穗在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5周后，選取結(jié)構(gòu)致密的 黃白色愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化，分化培養(yǎng)基中加入篩選劑潮霉素。約五 周后，愈傷形成節(jié)狀結(jié)構(gòu)，將有節(jié)狀結(jié)構(gòu)的愈傷轉(zhuǎn)移到MS分化生根培養(yǎng)基（唾二挫苯基 脈（TD幻4. 5 ymol/L、庶糖120 ymol/L)上。獲得了轉(zhuǎn)入CrylAb-01核巧酸序列的谷子植 株、轉(zhuǎn)入化ylAb-02核巧酸序列的谷子植株、轉(zhuǎn)入化ylAc-01核巧酸序列的谷子植株、轉(zhuǎn)入 化ylAc-02-化ylle核巧酸序列的谷子植株、轉(zhuǎn)入化ylAb/Ac核巧酸序列的谷子植株、轉(zhuǎn)入 化ylAb+Vip3A核巧酸序列的谷子植株；同時(shí)W野生型谷子植株作為對照。
[0132] 第四實(shí)施例、用化qMan驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植株
[0133] 分獲得了轉(zhuǎn)入化ylAb-01核巧酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入化ylAb-02核巧酸序列的 玉米植株、轉(zhuǎn)入化ylAc-01核巧酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入化ylAc-02-化ylle核巧酸序列的 玉米植株、轉(zhuǎn)入&ylAb/Ac核巧酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入&ylAb+Vip3A核巧酸序列的玉米 植株的葉片約lOOmg作為樣品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組DNA，通 過化qman探針巧光定量PCR方法檢測&ylA基因和Vip3A基因的拷貝數(shù)。同時(shí)W野生型 玉米植株作為對照，按照上述方法進(jìn)行檢測分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值。
[0134] 檢測&ylA基因和Vip3A基因拷貝數(shù)的具體方法如下；
[0135] 步驟11、分別取轉(zhuǎn)入化ylAb-01核巧酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入化ylAb-02核巧酸序 列的玉米植株、轉(zhuǎn)入化ylAc-01核巧酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入化ylAc-02-化ylle核巧酸序 列的玉米植株、轉(zhuǎn)入化ylAb/Ac核巧酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入化ylAb+Vip3A核巧酸序列的 玉米植株和野生型玉米植株的葉片各lOOmg，分別在研鉢中用液氮研成勻漿，每個(gè)樣品取3 個(gè)重復(fù)；
[0136] 步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA，具 體方法參考其產(chǎn)品說明書；
[0137] 步驟13、用^noDrop 2000 (Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃 度；
[0138] 步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為 80-100ng/y L;
[0139] 步驟15、采用化qman探針巧光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，W經(jīng)過鑒定已知 拷貝數(shù)的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，W野生型玉米植株的樣品作為對照，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，取其平 均值；巧光定量PCR引物和探針序列分別是：
[0140] W下引物和探針用來檢測化ylAb-01核巧酸序列：
[01川 引物 1 ;CGAACTACGACTCCCGCAC 如序列表中 SEQ ID N0:20 所示；
[0142] 引物 2 ;GTAGATTTCGCGGGTCAGTTG 如序列表中 SEQ ID N0:21 所示；
[0143] 探針 1 ;CTACCCGATCCGCACCGTGTCC 如序列表中 SEQ ID N0:22 所示；
[0144] W下引物和探針用來檢測化ylAb-02核巧酸序列和化ylAb/Ac核巧酸序列：
[0145] 引物 3 ;TGCGTATTCAATTCAACGACATG 如序列表中 SEQ ID N0:23 所示；
[0146] 引物 4 ;CTTGGTAGTTCTGGACTGCGAAC 如序列表中 SEQ ID N0:24 所示；
[0147] 探針 2 ;CAGCGCCTTGACCACAGCTATCCC 如序列表中 SEQ ID NO:25 所示；
[0148] W下引物和探針用來檢測&ylAc-01核巧酸序列：
[0149] 引物 5 ;CATTCAATTCAATGACATGAACAGC 如序列表中 SEQ ID NO:26 所示；
[0150] 引物 6 ;GACAAGTGCAGGTTGGCAGC 如序列表中 SEQ ID NO:27 所示；
[015U 探針 3 ;TCCGCTCTTCGCCGTTCAGAATTACC 如序列表中 SEQ ID NO:28 所示；
[0152] W下引物和探針用來檢測&ylAc-02核巧酸序列：
[0153] 引物 7 ;GGTTACACTCCCATCGACATCTC 如序列表中 SEQ ID NO:29 所示；
[0154] 引物 8 ;CACAAGACCAAGCACGAAACC 如序列表中 SEQ ID N0:30 所示；
[0巧5]探針 4 ;CCTTACCCAGTTCCTTCTTTCCGAGTTCG 如序列表中 SEQ ID NO:31 所示；
[0156] W下引物和探針用來檢測&ylAb+Vip3A核巧酸序列；
[0157] 引物 9 ;CCGAGCTTCATCGACTACTTCAAC 如序列表中 SEQ ID NO:32 所示；
[0158] 引物 10 ;CTCGTCCAGGGTCAGGTCG 如序列表中 SEQ ID NO:33 所示；
[0159] 探針 5 ;CCACCGGCATCAAGGACATCATGAAC 如序列表中 SEQ ID NO:34 所示；
[0160] PCR反應(yīng)體系為；
[0161]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種控制粟灰螟害蟲的方法，其特征在于，包括將粟灰螟害蟲至少與Cry 1A蛋白接 觸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制粟灰螟害蟲的方法，其特征在于，所述CrylA蛋白存在于 至少產(chǎn)生所述Cry 1A蛋白的宿主細(xì)胞中，所述粟灰螟害蟲通過攝食所述宿主細(xì)胞至少與所 述Cry 1A蛋白接觸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的控制粟灰螟害蟲的方法，其特征在于，所述CrylA蛋白存在于 至少產(chǎn)生所述Cry 1A蛋白的細(xì)菌或轉(zhuǎn)基因植物中，所述粟灰螟害蟲通過攝食所述細(xì)菌或轉(zhuǎn) 基因植物的組織至少與所述Cry 1A蛋白接觸，接觸后所述粟灰螟害蟲生長受到抑制和/或 導(dǎo)致死亡，以實(shí)現(xiàn)對粟灰螟危害植物的控制。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的控制粟灰螟害蟲的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物可以 處于任意生育期。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的控制粟灰螟害蟲的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物的組 織為葉片、莖桿、果實(shí)、雄穗、雌穗、花藥或花絲。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的控制粟灰螟害蟲的方法，其特征在于，所述對粟灰螟危害植 物的控制不因種植地點(diǎn)和/或種植時(shí)間的改變而改變。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3至6任一項(xiàng)所述的控制粟灰螟害蟲的方法，其特征在于，所述植物為 玉米、高粱、谷子、甘蔗、水稻、小麥、大麥或燕麥。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2至7任一項(xiàng)所述的控制粟灰螟害蟲的方法，其特征在于，所述接觸步 驟之前的步驟為種植含有編碼所述Cry 1A蛋白的多核苷酸的植物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的控制粟灰螟害蟲的方法，其特征在于，所述Cry 1A 蛋白為CrylAb蛋白、CrylAc蛋白或CrylAb/Ac蛋白。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的控制粟灰螟害蟲的方法，其特征在于，所述Cry 1A蛋白的氨 基酸序列具有 SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7 或 SEQ ID NO:9 所 示的氨基酸序列。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的控制粟灰螟害蟲的方法，其特征在于，所述Cry 1A蛋白的核 苷酸序列具有5￡〇10勵(lì)：2、5￡〇10勵(lì):4、5￡〇10勵(lì):6、5￡〇10勵(lì):8或5￡〇10勵(lì)：10所 示的核苷酸序列。
12. 根據(jù)權(quán)利要求2至10任一項(xiàng)所述的控制粟灰螟害蟲的方法，其特征在于，編碼所述 CrylA蛋白的核苷酸序列與至少一種不同于所述CrylA蛋白編碼序列的第二種核苷酸進(jìn)行 重組。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的控制粟灰螟害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸 編碼Cry類殺蟲蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、a -淀粉酶或過氧化物 酶。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的控制粟灰螟害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸 編碼Vip3A蛋白或Crylle蛋白。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的控制粟灰螟害蟲的方法，其特征在于，所述Vip3A蛋白的 氨基酸序列具有SEQ ID NO:ll所示的氨基酸序列，所述Crylle蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的控制粟灰螟害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸 具有SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列。
17. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的控制粟灰螟害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸 為抑制目標(biāo)昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
18. -種Cry 1A蛋白質(zhì)控制粟灰螟害蟲的用途。
19. 一種產(chǎn)生控制粟灰螟害蟲的植物的方法，其特征在于，包括向所述植物的基因組中 引入編碼Cry 1A蛋白的多核苷酸序列。
20. -種產(chǎn)生控制粟灰螟害蟲的植物繁殖體的方法，其特征在于，包括將由權(quán)利要求 19所述方法獲得的第一植株與第二植株雜交，和/或取下由權(quán)利要求19所述方法獲得的植 株上具有繁殖能力的組織進(jìn)行培養(yǎng)，從而產(chǎn)生含有編碼 CrylA蛋白的多核苷酸序列的植物 繁殖體。
21. -種培養(yǎng)控制粟灰螟害蟲的植物的方法，其特征在于，包括： 種植至少一個(gè)植物繁殖體，所述植物繁殖體的基因組中包括編碼CrylA蛋白的多核苷 酸序列； 使所述植物繁殖體長成植株； 使所述植株在人工接種粟灰螟害蟲和/或粟灰螟害蟲自然發(fā)生危害的條件下生長，收 獲與其他不具有編碼Cry 1A蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有減弱的植物損傷和/或具 有增加的植物產(chǎn)量的植株。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種殺蟲蛋白的用途，所述控制粟灰螟害蟲的方法包括：將粟灰螟害蟲至少與Cry1A蛋白接觸。本發(fā)明通過植物體內(nèi)產(chǎn)生能夠殺死粟灰螟的Cry1A蛋白來控制粟灰螟害蟲；與現(xiàn)有技術(shù)使用的農(nóng)業(yè)防治方法、化學(xué)防治方法和物理防治方法相比，本發(fā)明對植物進(jìn)行全生育期、全植株的保護(hù)以防治粟灰螟害蟲的侵害，且無污染、無殘留，效果穩(wěn)定、徹底，簡單、方便、經(jīng)濟(jì)。
【IPC分類】A01N65-44, A01G1-00, A01N63-02, A01G13-00, A01H1-02, A01P7-04, A01H4-00, C12N15-84
【公開號】CN104522056
【申請?zhí)枴緾N201410806504
【發(fā)明人】楊旭, 丁德榮, 張愛紅, 陶青, 李建勇, 李梅, 張?jiān)浦?
【申請人】北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司生物技術(shù)中心
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月22日