:5' -GGATGCAACACACACACAC-3'(SEQIDNo. 1)
[0043]P24 :5' -CACGAGAGAGAGAGAGA-3' (SEQIDNo. 2)
[0044]ISSR擴(kuò)增體系為：dNTP(2. 5mM)I. 5yL，引物（10ymol)IyL，ExTaq?DNA聚合 酶 0? 5U，10XExTaqPCR緩沖液 2yL，DNA模板 4yL，用CldH2O補(bǔ)齊至 20yL;ISSR反應(yīng)條 件：94°C4min;94°C50s，55°C50s，72°C2min，共 35 個(gè)循環(huán)；72°C補(bǔ)齊 7min。將擴(kuò)增產(chǎn)物在 I. 0 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，檢測(cè)ISSR擴(kuò)增結(jié)果。
[0045] 結(jié)果以P4為引物擴(kuò)增的ISSR圖譜（見圖2)和以P24為引物擴(kuò)增的ISSR圖譜 (見圖3)中均可以看出中農(nóng)白靈8號(hào)與華雜13、中農(nóng)翅鮑、KH2、中農(nóng)1號(hào)均存在明顯差異性 條帶，說明中農(nóng)白靈8號(hào)為一種新的白靈葫（Pleurotuseryngiivar.tuoliensis)菌株。
[0046](三）利用IGS2-RFLP圖譜對(duì)中農(nóng)白靈8號(hào)進(jìn)行分類鑒定
[0047] 試驗(yàn)菌株：中農(nóng)白靈8號(hào)和中農(nóng)1號(hào)
[0048] 試驗(yàn)方法：（I)、DNA提?。喊闯Ｒ?guī)方法提取中農(nóng)白靈8號(hào)DNA。
[0049] (2)、引物！InvSRlR和 5SRNAR。
[0050]InvSRlR:5, -ACTGGCAGAATCAACCAGGTA-3'(SEQIDNo. 3)
[0051] 5SRNAR:5, -ACCGCATCCCGTCTGAT-3，(SEQIDNo. 4)
[0052] (3)、限制性內(nèi)切酶：HapII、RsaI。
[0053]IGS2-PCR擴(kuò)增體系：dNTP(2. 5mMeach)4yL，InvSRlR、5SRNAR各 2. 5yL，ExTaq ?DNA聚合酶I. 25U，IXPCR緩沖液，模板25ng，用CldH2O補(bǔ)齊至50yL。IGS2-RFLP反應(yīng)條 件：94°Clmin，60°Clmin，72°C3min，共35個(gè)循環(huán)；72°C，7min。酶切體系：限制性內(nèi)切酶 (IOU/yL)lyL，PCR產(chǎn)物 6yL，IOXbufTerIyL，用水補(bǔ)齊至IOyL。置于 37°C下酶切 4 小時(shí)。1.2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下檢測(cè)酶切反應(yīng)結(jié)果。數(shù)據(jù)處理采用 QuantityOne分析軟件。
[0054] 結(jié)果中農(nóng)白靈8號(hào)（CAAS-2)的IGS2經(jīng)HapII酶切（見圖4)生成大小為609bp、 661bp、870bp、1675bp、2165bp的5個(gè)片段；經(jīng)RsaI酶切（見圖5)生成大小為454bp、 724bp、1838bp、2262bp的4個(gè)片段。對(duì)比發(fā)現(xiàn)中農(nóng)白靈8號(hào)的帶型與其他白靈菇菌株均明 顯不同，說明中農(nóng)白靈8號(hào)是一種新的白靈菇菌株。
[0055] 實(shí)施例2本發(fā)明白靈菇中農(nóng)白靈8號(hào)的栽培試驗(yàn)
[0056] (1)母種的繁殖按1:80的重量比比例將0.3?0.5cm大小的中農(nóng)白靈8號(hào)菌種 (已于2014年12月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏（保藏地 址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研宄所，郵編100101)，其保藏 編號(hào)為CGMCCN〇10198。）接種于母種培養(yǎng)基上，在25°C、空氣相對(duì)濕度60%、避光條件下 培養(yǎng)12天，長滿試管斜面，得到中農(nóng)白靈8號(hào)母種；其中母種培養(yǎng)基的制備方法為：將去皮 馬鈴薯切塊（直徑約lcm) 200g，置于約600ml水中，沸水煮30min，4層紗布過濾，取汁液； 向所得汁液中加入少于400ml冷水，再加葡萄糖20g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂0. 5g、瓊脂粉 15g，定容至1000ml，攪拌至瓊脂粉無結(jié)團(tuán)，小火加熱并同時(shí)攪拌，至以上成分完全溶解，分 裝試管，121°C滅菌30min;擺斜面，得到母種培養(yǎng)基。
[0057] (2)原種培養(yǎng)：按照重量百分比5%的比例將步驟⑴所得中農(nóng)白靈8號(hào)母種接 種于栽培培養(yǎng)料上，在25°C、空氣相對(duì)濕度60 %、避光條件下培養(yǎng)30天，得中農(nóng)白靈8號(hào) 原種；所述的栽培培養(yǎng)料按照如下方法制備：按照重量百分比比例將棉籽殼81%，麥麩 12. 5%，玉米粉3. 5%，石灰3%混合，攪拌均勻；再按照料水比I:1. 86的重量比例加入水， 攪拌均勻，裝菌袋，菌袋規(guī)格為17cmX33cm、厚4絲的聚丙烯袋，裝袋高度10cm，皮筋扎口， 采用高壓滅菌，在125°C保持150min。菌袋滅菌完畢后，取出攤涼。
[0058] (3)栽培種培養(yǎng)：按照重量百分比為5%的比例將步驟⑵所得中農(nóng)白靈8號(hào)原種 接種于栽培培養(yǎng)料（其組成成分及其比例同步驟（2))上，在25°C、空氣相對(duì)濕度60%、避 光條件下培養(yǎng)28天，得中農(nóng)白靈8號(hào)栽培種。
[0059] (4)、栽培培養(yǎng)料的制備：參照步驟（2)準(zhǔn)備栽培培養(yǎng)料，裝袋，菌袋規(guī)格為 17cmX35cm、厚4絲的聚丙稀袋，料高16cm左右，中間插入長13cm的食用菌塑料空心棒，用 直徑3. 5cm套環(huán)和配套棉塞蓋封口；采用常壓菌滅菌，在KKTC保持14小時(shí)。
[0060] (5)、冷卻接種：將冷卻室打掃干凈后消毒，將步驟（4)所得菌袋放入冷卻室至溫 度降低至常溫。在無菌條件下，取出菌袋中的食用菌空心塑料棒，按照重量百分比5%的比 例，將中農(nóng)白靈8號(hào)栽培種接種到菌袋中央的孔洞中，用套環(huán)和配套棉塞蓋封口；在25°C， 空氣相對(duì)濕度60%，暗光，通風(fēng)良好，培養(yǎng)30天長滿菌袋。
[0061] (6)、搔菌：將袋口打開，用消毒刮鏟除去料面3平方厘米大小的菌皮，松扎上口， 然后將菌袋松扎上，繼續(xù)培養(yǎng)5天，直至菌絲恢復(fù)。
[0062](7)、低溫刺激：將菌袋放入冷庫1°C條件下低溫刺激7天。
[0063] (8)、出菇管理和采收：將經(jīng)過步驟（7)處理的菌袋，轉(zhuǎn)入出菇房，控制溫度在 12°C，空氣相對(duì)濕度85%，光照500?800勒克斯，通風(fēng)良好，環(huán)境CO2S1000X10 _6條件下 培養(yǎng)28天；當(dāng)子實(shí)體菌蓋充分展開，但仍有微微卷邊，孢子未釋放時(shí)采收子實(shí)體；采收時(shí) 從子實(shí)體根部割下，用保鮮紙包裹后裝箱。
[0064] 綜上，中農(nóng)白靈8號(hào)農(nóng)業(yè)式栽培單菇重326. 1±50.lg，每袋能出2個(gè)菇，生物學(xué)效 率非常高；其栽培周期為100-110天。本發(fā)明中農(nóng)白靈8號(hào)的子實(shí)體（見圖1)商品價(jià)值較 高，它的菌蓋為貽貝狀，顏色雪白，質(zhì)地硬。菌蓋長徑平均12. 0厘米，短徑平均11. 1厘米， 厚度平均4. 5厘米；菌柄中生，平均長5. 0cm，平均粗5. 0cm。適合農(nóng)業(yè)式和工廠化栽培。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種白靈葫（Pleurotuseryngiivar.tuoliensis)菌株中農(nóng)白靈 8 號(hào)，已于 2014 年12月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏編號(hào)為CGMCC No.10198。
2. 權(quán)利要求1所述的白靈菇菌株中農(nóng)白靈8號(hào)的栽培方法，其特征在于包括如下步 驟： (1) 、按1:80?100的重量比比例將直徑大小0. 3?0. 5cm的中農(nóng)白靈8號(hào)菌種接種 于母種培養(yǎng)基上，在22?28°C、空氣相對(duì)濕度為40?60%、避光條件下培養(yǎng)10?12天， 得中農(nóng)白靈8號(hào)母種； (2) 、按照重量百分比為3?5%的比例將步驟⑴中所得的中農(nóng)白靈8號(hào)母種接種于 栽培培養(yǎng)料上，在22?28°C、空氣相對(duì)濕度為40?60%、避光條件下培養(yǎng)28?35天，得 中農(nóng)白靈8號(hào)原種； (3) 、按照重量百分比為3?5%的比例將步驟⑵中所得的中農(nóng)白靈8號(hào)原種接種于 栽培培養(yǎng)料上，在22?28°C、空氣相對(duì)濕度為40?60%、避光條件下培養(yǎng)28?35天，得 中農(nóng)白靈8號(hào)栽培種； (4) 、按照重量百分比為5?8%的比例將步驟（3)中所得的中農(nóng)白靈8號(hào)栽培種接種 于栽培培養(yǎng)料上，在22?28°C、空氣相對(duì)濕度為40?60%、避光條件下培養(yǎng)30?40天， 菌絲長滿培養(yǎng)料； (5) 、將袋口打開，用消毒刮鏟除去料面上的菌皮，松扎上口，然后將菌袋松扎上，繼續(xù) 培養(yǎng)3?5天，直至菌絲恢復(fù)； (6) 、將菌袋置于1?3°C低溫下刺激7?14天；或大棚溫度在0?15°C時(shí)，保持晝夜 溫差10?15°C，刺激10?15天； (7) 、出現(xiàn)原基后，在溫度為5?18°C(農(nóng)業(yè)式栽培）或12?14°C(工業(yè)式栽培），空 氣相對(duì)濕度為75?85 %，光照500?800勒克斯，通風(fēng)良好，環(huán)境CO2S1000X10 _6條件下 培養(yǎng)20?30天；當(dāng)子實(shí)體菌蓋充分展開，但仍有微微卷邊，孢子未釋放時(shí)采收子實(shí)體。
3. 按照權(quán)利要求2所述的栽培方法，其特征在于其步驟（1)中所述的菌種指菌絲。
4. 按照權(quán)利要求2所述的栽培方法，其特征在于其步驟（1)中所述的母種培養(yǎng)基的 原料組成成分及其重量比例為：去皮馬鈴薯塊180?300g，葡萄糖15?20g，磷酸二氫鉀 0.5?38，硫酸鎂0.5?38，瓊脂15?258，水10001111，？11值自然。
5. 按照權(quán)利要求2所述的栽培方法，其特征在于其步驟（2)、（3)或（4)中所述的栽培 培養(yǎng)料的原料組成成分及其重量百分比為：棉籽殼75?81%，麥麩8?15%，玉米粉2? 8%，石灰1?3% ;再以料水比為I:1. 8?2. 3的比例加入水。
6. 按照權(quán)利要求5所述的栽培方法，其特征在于所述的栽培培養(yǎng)料的組成成分及其重 量百分比為：棉籽殼81%，麥麩12. 5%，玉米粉3. 5%，石灰3%，料水比I:1. 86,即含水量 為 65%。
7. 按照權(quán)利要求2所述的栽培方法，其特征在于其步驟（1)、（2)、（3)或（4)中所述的 溫度為24?26 °C。
8. 按照權(quán)利要求7所述的栽培方法，其特征在于所述的溫度為25°C。
9. 按照權(quán)利要求2所述的栽培方法，其特征在于其步驟（1)、（2)、（3)或（4)中所述的 空氣相對(duì)濕度為60%。
10.按照權(quán)利要求2所述的栽培方法，其特征在于其步驟（4)中所述的接種方法為先拔 出菌袋中央事先插入的空心塑料棒，將栽培種接入拔出空心塑料棒后留下的孔洞中。
【專利摘要】本發(fā)明公開了屬于食用菌領(lǐng)域的一種白靈菇。本發(fā)明白靈菇(Pleurotus？eryngii？var.tuoliensis)菌株中農(nóng)白靈8號(hào)，已于2014年12月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏編號(hào)為CGMCC？No.10198。本發(fā)明還公開了中農(nóng)白靈8號(hào)的栽培方法，包括母種繁殖、原種培養(yǎng)、栽培種培養(yǎng)、低溫刺激和出菇管理和采收等步驟。本發(fā)明提供了一種新的白靈菇菌株，豐富了白靈菇的種類；其次，本發(fā)明中農(nóng)白靈8號(hào)的子實(shí)體商品價(jià)值較高，菌蓋呈貽貝狀，質(zhì)地硬，外觀漂亮，出菇整齊。此外，中農(nóng)白靈8號(hào)農(nóng)業(yè)式栽培平均單菇重326.1g，每袋能出2個(gè)菇，其生物學(xué)效率非常高。CGMCC No.1019820141212
【IPC分類】A01G1-04, C05G3-00
【公開號(hào)】CN104541976
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510006865
【發(fā)明人】陳強(qiáng), 黃晨陽, 趙夢(mèng)然, 張金霞, 曲積彬, 鄔向麗, 鄒亞杰, 高巍
【申請(qǐng)人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年1月7日