](3)篩選前光照培養(yǎng):結(jié)束低溫處理后，于正常光照培養(yǎng)條件下(25°C ;光/暗:16h/8 h)培養(yǎng)3 d至種子萌發(fā)。
[0018](3)低溫篩選:選取萌發(fā)一致的幼苗轉(zhuǎn)移到1/2 MS的培養(yǎng)基平板上，然后用錫箔紙包起來在4°C低溫下暗培養(yǎng)60 do
[0019](4) “乙烯不敏感-耐寒”種質(zhì)的鑒別:煙草野生型在低溫條件下根長及下胚軸生長受抑制變短，而“乙烯不敏感-耐寒”種質(zhì)的根長及下胚軸生長不受抑制或抑制較輕，如圖2所示(野生型WT，待篩選株系#1304，1244，1594，1392)。
[0020]實(shí)施例2
1、煙草乙烯不敏感種質(zhì)的高通量初步篩選，步驟如實(shí)施例1。
[0021]2、“乙烯不敏感-耐寒-耐旱”復(fù)合種質(zhì)的篩選
以篩選出的乙烯不敏感-耐寒種質(zhì)的煙草種子為測試材料，以煙草野生型種子為對照，按以下步驟進(jìn)行篩選:
(I)表面消毒:分別取大約50粒乙烯不敏感-耐寒煙草種質(zhì)與野生型材料的種子于1.5ml離心管中，加900 μ I的無菌水、100 μ I 10%的次氯酸鈉，37°C 200 rpm震蕩I h后用無菌水沖洗6次。
[0022](2)低溫處理:將已消毒的煙草種子點(diǎn)播在1/2 MS的培養(yǎng)基平板上，并將其置于4°C，黑暗培養(yǎng)3 do
[0023](3)篩選前光照培養(yǎng):結(jié)束低溫處理后，于正常光照培養(yǎng)條件下(25°C ;光/暗:16h/8 h)生長7-10 d至真葉剛剛出現(xiàn)。
[0024](3)模擬干旱篩選:選取出芽一致的幼苗轉(zhuǎn)移到1/2 MS+200 mM甘露醇的培養(yǎng)基平板上，于25°C光照培養(yǎng)30 do
[0025]甘露醇培養(yǎng)基的配置:1/2 MS培養(yǎng)基加入甘露醇終濃度達(dá)到200 μ M使其(PH為5.8)，經(jīng)高壓滅菌(121°C，15-20 min)后冷卻。
[0026](4) “乙烯不敏感-耐寒-耐旱”復(fù)合抗性種質(zhì)的鑒別:煙草野生型在模擬干旱的條件下出現(xiàn)植株變黃、矮小等生長受抑制等形態(tài)特征，而“乙烯不敏感-耐寒-耐旱”復(fù)合抗性植株生長不受抑制或抑制較輕(如圖3所示，野生型WT，待篩選株系#1304，1244，1594，1392)。
[0027]以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進(jìn)行限制；盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種煙草復(fù)合抗性種質(zhì)的高通量篩選方法，其特征在于它包括以下步驟: (1)煙草乙烯不敏感種質(zhì)的篩選 a、表面消毒:取待篩選的煙草種子與煙草野生型種子用次氯酸鈉消毒后用無菌水沖洗； b、低溫處理:將已消毒的所述煙草種子點(diǎn)播在1/2MS+100 μΜ ACC的培養(yǎng)基上，并將其置于4°C，黑暗培養(yǎng)3 d; C、光照催芽與暗培養(yǎng):于25°C光照培養(yǎng)10 h ;之后將其于25°C下避光暗培養(yǎng)5_6 d ；d、乙烯不敏感種質(zhì)的鑒別:煙草野生型種子出現(xiàn)“三重反應(yīng)”的表型:幼苗的主根變短、下胚軸縮短變粗、子葉形成頂鉤三重反應(yīng)”呈現(xiàn)不明顯表型的為乙烯不敏感種質(zhì)； (2)乙烯不敏感-耐寒復(fù)合種質(zhì)的篩選 以所述篩選出的乙烯不敏感種質(zhì)的煙草種子為測試材料，以煙草野生型種子為對照，按以下步驟進(jìn)行篩選: a、表面消毒:取所述煙草乙烯不敏感種質(zhì)與野生型種子用次氯酸鈉消毒后用無菌水沖洗； b、低溫處理:將已消毒的煙草種子點(diǎn)播在1/2MS的培養(yǎng)基平板上，并將其置于4°C，黑暗培養(yǎng)3 d ; c、處理前光照培養(yǎng):于25°C光照條件下培養(yǎng)3d至種子萌發(fā)； d、低溫篩選:選取萌發(fā)一致的幼苗轉(zhuǎn)移到1/2MS的培養(yǎng)基平板上，然后用錫箔紙包起來在4 °C低溫下暗培養(yǎng)60 d； e、乙烯不敏感-耐寒種質(zhì)的鑒別:煙草野生型在低溫條件下根長及下胚軸生長受抑制變短，而“乙烯不敏感-耐寒”抗性種質(zhì)的根長及下胚軸生長不受抑制或抑制較輕，篩選出乙烯不敏感-耐寒抗性種質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草復(fù)合抗性種質(zhì)的高通量篩選方法，其特征在于:在篩選出的乙烯不敏感-耐寒種質(zhì)的基礎(chǔ)上再進(jìn)行耐旱抗性種質(zhì)的篩選，步驟如下: a、表面消毒:取上述篩選出的乙烯不敏感-耐寒抗性種質(zhì)與野生型種子用次氯酸鈉消毒后用無菌水沖洗； b、低溫處理:將已消毒的煙草種子點(diǎn)播在1/2MS的培養(yǎng)基平板上，并將其置于4°C，黑暗培養(yǎng)3 d ; c、處理前光照培養(yǎng):于25°C光照條件下培養(yǎng)7-10d至真葉剛剛出現(xiàn)； d、模擬干旱處理:選取出芽一致的幼苗轉(zhuǎn)移到1/2MS+200 mM甘露醇培養(yǎng)基平板上，于25°C光照培養(yǎng)30 d ； e、乙烯不敏感-耐寒-耐旱復(fù)合抗性種質(zhì)的鑒別:煙草野生型在模擬干旱的條件下出現(xiàn)植株變黃、矮小癥狀，生長不受抑制或抑制較輕的為“乙烯不敏感-耐寒-耐旱”復(fù)合抗性種質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草復(fù)合抗性種質(zhì)的高通量篩選方法，其特征在于:所述1/2MS+100 μ M ACC的培養(yǎng)基的配制方法為:不加蔗糖的PH為5.8的1/2 MS培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后冷卻至50-60°C，加入過濾除菌的ACC使其終濃度達(dá)到100 μ Μ。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的煙草復(fù)合抗性種質(zhì)的高通量篩選方法，其特征在于:所述1/2MS+200 mM甘露醇培養(yǎng)基的配制方法為:向1/2 MS培養(yǎng)基加入甘露醇終濃度達(dá)到200 μΜ, 使其PH為5.8，經(jīng)高壓滅菌后冷卻。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種煙草復(fù)合抗性種質(zhì)的高通量篩選方法，遵循高通量、快速、簡易的篩選原則，本發(fā)明從篩選乙烯不敏感突變體著手，通過僅需要一周時(shí)間就可完成的乙烯“三重反應(yīng)”，對大量材料進(jìn)行快速、高通量的初步篩選；在此基礎(chǔ)上進(jìn)行耐寒與耐旱的復(fù)合種質(zhì)的篩選。特別是在耐寒性的篩選上，本發(fā)明采用普通家用冰箱就可以滿足的4℃條件，無需光照培養(yǎng)，經(jīng)過暗處理培養(yǎng)后，通過觀測分析幼苗的下胚軸和根的長度來判斷其的耐寒性，區(qū)別于一般對實(shí)驗(yàn)儀器要求較高的零下低溫篩選的方法，開創(chuàng)了新的簡易的耐寒種質(zhì)的篩選方法。煙草復(fù)合種質(zhì)的篩選方法對抗逆育種以及研究乙烯對抗逆的影響提供了簡易的基礎(chǔ)材料篩選方法。
【IPC分類】A01H1-04, A01H3-00, A01H3-04
【公開號】CN104542268
【申請?zhí)枴緾N201510018006
【發(fā)明人】董春海, 王紅林, 李鳳明, 王菲菲, 鄭芳芳, 趙宇航, 裴海霞
【申請人】青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月14日