一種大花萱草葉片組織培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及露地生長(zhǎng)的大花萱草幼嫩葉片組織培養(yǎng) 擴(kuò)繁的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大花萱草為萱草科萱草屬多年生草本，是重要的宿根花丼，中國(guó)的萱草種質(zhì)資源 十分豐富，世界上發(fā)現(xiàn)該屬共有14個(gè)種，中國(guó)就有11個(gè)種大花萱草。在野生萱草種質(zhì)的基 礎(chǔ)上，經(jīng)過人工雜交選育的大花萱草園藝栽培品種群，目前已經(jīng)登陸的品種有8萬多種。大 花萱草葉翠綠狹長(zhǎng)基生，呈帶狀排成兩列，具紡錘狀肉質(zhì)根及須根。莖短根狀，花苔從中部 抽出，螺旋狀聚傘花序，每個(gè)花絮可著花數(shù)十朵?；ɡ偎启ⅲ_如漏斗，裂片翻卷，為百合形 花冠，花瓣先端裂開。花被基部合生，呈筒狀，雄蕊6枚，3長(zhǎng)3短，花藥呈丁字形背著在花絲 頂端，花徑變化大，花形各異，花期主要在夏季。
[0003] 大花萱草是一種優(yōu)良的園林作物。但是目前在園林應(yīng)用中大花萱草的品種較少， 主要原因是受繁殖的影響。園林應(yīng)用中的大花萱草主要是通過組織培養(yǎng)方式來實(shí)現(xiàn)繁殖， 組織培養(yǎng)常用的外植體有花葶、花瓣，子房、莖尖等，因此繁殖只能在花期，限制了新品種和 優(yōu)良品種的培育。而葉片取材不受花期影響，可以實(shí)現(xiàn)組織培養(yǎng)外植體取材時(shí)間的周年性， 達(dá)到組培快繁的目的。因此如果可以用露地栽培的葉片作為外植體進(jìn)行大花萱草的組織培 養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)萱草組織培養(yǎng)外植體取材時(shí)間的周年性，則有利于實(shí)現(xiàn)良種快繁，大大豐富園林中 大花萱草的種類。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用大花萱草葉片進(jìn)行組織 培養(yǎng)快速繁苗的方法，實(shí)現(xiàn)萱草組織培養(yǎng)外植體取材時(shí)間的周年性。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 1)外植體的選擇和消毒處理；
[0007] 2)愈傷組織的誘導(dǎo)：將消毒后的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，至形成愈傷組織， 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：MS培養(yǎng)基中添加0. 1-0. 2mg/LNAA、1.Omg/L6-芐氨基嘌呤；
[0008] 3)芽誘導(dǎo)：將所述愈傷組織接種到幼芽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至獲得大花萱草的再生 苗，所述幼芽培養(yǎng)基的配方為：MS培養(yǎng)基中添加0. 1-0. 2mg/LNAA、1.Omg/L6-芐氨基嘌 呤；
[0009] 4)生根培養(yǎng)：將所述再生苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，至再生苗基部出現(xiàn)白色短根并長(zhǎng) 出完整根系，得到大花萱草小苗，所述生根培養(yǎng)基的配方為：1/2MS培養(yǎng)基中添加0.lmg/L 萘乙酸、3%蔗糖、0.6%瓊脂，所述1/2MS培養(yǎng)基為將MS培養(yǎng)基中的大量元素濃度減半；
[0010] 5)植株移栽：將所述大花萱草小苗栽到栽培基質(zhì)中，溫室煉苗，獲得大花萱草幼 苗。
[0011] 本發(fā)明中，所述外植體的選擇具體為，選，擇抽出新葉數(shù)量較多的大花萱草單株， 截取莖尖以上葉齡較一致的幼嫩葉片即為所需的外植體，所述新葉為葉齡小于12天的葉 子。
[0012] 本發(fā)明中，所述消毒處理具體為，將外植體用流水沖洗3-5分鐘，再用70%酒精表 面滅菌20-30s，無菌水沖洗3-4次，然后用2 %的NaClO浸泡l〇-15min，再用無菌水沖洗5-6 次。
[0013] 本發(fā)明中，所述愈傷組織的誘導(dǎo)的的步驟為：在超凈工作臺(tái)中將處理后的外植體 用鑷子撕成小方塊，近軸面朝上接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)；接種后在溫度23-27°C，黑暗條件下 培養(yǎng)。
[0014] 本發(fā)明中，所述芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件為：溫度25°C，光照強(qiáng)度2000-30001X，光照時(shí) 間 12h/d〇
[0015] 本發(fā)明中，所述生根培養(yǎng)的條件為：溫度25°C，光照強(qiáng)度2000-30001x，光照時(shí)間 12h/d下培養(yǎng)。
[0016] 本發(fā)明中，所述大花萱草小苗是指完成了芽和根的分化，可以獨(dú)立進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng) 的幼小植株。
[0017] 進(jìn)一步的，提供本發(fā)明中萱草組織培養(yǎng)更具體的步驟如下：
[0018] 1)外植體的選擇和消毒處理：選擇抽出新葉數(shù)量較多的大花萱草單株，截取莖尖 以上葉齡較一致的幼嫩葉片，盡量保證外植體的一致性，將外植體以流水沖洗3-5分鐘，再 用70 %酒精表面滅菌20-30s，無菌水沖洗三次，然后用2 %的NaClO浸泡10-15min，再用無 菌水沖洗5-6次；
[0019] 2)愈傷組織的誘導(dǎo)：在超凈工作臺(tái)中將步驟1)中處理后的葉片用鑷子撕成 IcmXIcm大小的長(zhǎng)方塊，近軸面朝上接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為MS培養(yǎng)基 中添加MS培養(yǎng)基中添加0. 1-0. 2mg/LNAA、1.0mg/L6-芐氨基嘌呤，接種后在溫度25°C，黑 暗條件下至葉片邊緣出現(xiàn)愈傷組織；
[0020] 3)芽誘導(dǎo)：將步驟2)中得到的愈傷組織接種到幼芽培養(yǎng)基中，幼芽培養(yǎng)基的配方 為MS培養(yǎng)基中添加0. 1-0. 2mg/LNAA、1.0mg/L6-芐氨基嘌呤，接種后在溫度25°C，光照強(qiáng) 度2000-30001X，光照時(shí)間12h/d下培養(yǎng)，至愈傷組織發(fā)芽，獲得大花萱草的再生苗；
[0021] 4)生根培養(yǎng)：將步驟3)中得到的萱草小苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基的配 方為1/2MS培養(yǎng)基中添加0.lmg/L萘乙酸、3%蔗糖、0.6%瓊脂，在溫度25°C，光照強(qiáng)度 2000-30001x，光照時(shí)間12h/d下培養(yǎng)，培養(yǎng)至小苗基部出現(xiàn)白色短根并長(zhǎng)出完整根系；
[0022] 5)植株移栽：將步驟4)中得到的生根完整大花萱草小苗栽到珍珠巖與草炭1:1 的基質(zhì)中，溫室煉苗，獲得正常的大花萱草幼苗。
[0023] 本發(fā)明利用萱草葉片進(jìn)行組織培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)快速繁殖，具有以下兩個(gè)方面的意義：（1) 萱草屬植物主要以分生繁殖為主，繁殖系數(shù)低，繁殖所需時(shí)間長(zhǎng)，不利于大花萱草的繁和良 種的培養(yǎng)。組織培養(yǎng)時(shí)間短，增值頻率高，可提高大花萱草的繁殖效率。（2)以露地生長(zhǎng)的 大花萱草幼嫩葉片作為外植體取材，不受花期取材時(shí)間的限制，延長(zhǎng)了外植體取材時(shí)間，有 利于大花萱草的應(yīng)用和推廣。
【附圖說明】
[0024] 圖1 :萱草新品種"紅三角"愈傷組織培養(yǎng)圖片；
[0025] 圖2 :萱草新品種"紅三角"芽誘導(dǎo)圖片；
[0026] 圖3 :萱草新品種"紅三角"生根圖片；
[0027] 圖4:野生萱草（Hemerocallisfulva)愈傷組織培養(yǎng)圖片；
[0028] 圖5:野生萱草（Hemerocallisfulva)芽誘導(dǎo)圖片；
[0029]圖 6:野生萱草（Hemerocallisfulva)生根圖片；
【具體實(shí)施方式】
[0030] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0031] 實(shí)施例1大花萱草葉片組織培養(yǎng)
[0032] 本實(shí)施例選擇萱草新品種"紅三角"進(jìn)行葉片組織培養(yǎng)。
[0033] 1)外植體的選擇和消毒處理：選擇抽出新葉數(shù)量較多的大花萱草單株，從中選出 葉齡9-10天的新葉，截取莖尖以上部位的幼嫩葉片，盡量保證外植體的一致性。將外植體 以流水沖洗3-5分鐘，再用70 %酒精表面滅菌30s，無菌水沖洗三次，然后用2 %的NaClO浸 泡l〇-15min，再用無菌水沖洗5-6次。
[0034] 2)愈傷組織的誘導(dǎo)：在超凈工作臺(tái)中將步驟1)中處理后的葉片用鑷子撕成 IcmXIcm大小的長(zhǎng)方塊，近軸面朝上平鋪于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為MS培養(yǎng)基 中添加0.lmg/LNAA、1.0mg/L6-節(jié)氨基嗓呤。接種后在溫度25°C，黑暗條件下培養(yǎng)18天后 葉片邊緣出現(xiàn)愈傷組織（如圖1)。
[0035] 3)芽誘導(dǎo)：將步驟2)中得到的愈傷組織接種到幼芽培養(yǎng)基中，幼芽培養(yǎng)基的 配方為MS培養(yǎng)基中添加0.lmg/LNAA、1.0mg/L6-芐氨基嘌呤，在溫度25°C，光照強(qiáng)度 2000-3