一種液態(tài)復(fù)合生物多控殺蟲劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是用于水稻、玉米、小麥及果蔬的液態(tài)復(fù)合生 物多控殺蟲劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和基因工程的發(fā)展以及它們?cè)谵r(nóng)藥中的應(yīng)用，生物農(nóng)藥的興起 已成為歷史發(fā)展的趨勢(shì)，而高效、低毒、無殘留的微生物防治和生物農(nóng)藥已成為農(nóng)業(yè)生物工 程研宄中最為活躍的領(lǐng)域之一。近十多年來，由于各國的重視，生物農(nóng)藥研宄和生產(chǎn)都有了 很大的發(fā)展，目前化學(xué)農(nóng)藥每年以2%的速度遞減，而生物農(nóng)藥卻以5%的速度遞增。隨著 人們對(duì)食品安全意識(shí)和環(huán)境保護(hù)意識(shí)的進(jìn)一步提尚，尚毒、尚殘留殺蟲劑的品種和范圍將 會(huì)進(jìn)一步受到限制，而高效、低毒、對(duì)環(huán)境友好，且不易產(chǎn)生抗性的生物殺蟲劑將會(huì)得到愈 來愈廣泛的應(yīng)用。
[0003] 在自然界，存在著許多對(duì)害蟲有致病作用的微生物，利用這種致病性來防治害蟲 是一種有效的生物防治方法。從這些病原微生物中篩選出施用方便、藥效穩(wěn)定、對(duì)人畜和環(huán) 境安全的菌種，進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)開發(fā)，從而制成微生物殺蟲劑；從植物中提取、分離新 的天然活性化合物也是開發(fā)新農(nóng)藥的重要途徑。生物殺蟲劑是生物科學(xué)與工程技術(shù)結(jié)合發(fā) 展的產(chǎn)物，隨著現(xiàn)代生物工程的迅速發(fā)展，生物殺蟲劑將有很大的開發(fā)前景。
[0004] 目前，有關(guān)生物殺蟲劑類和植物提取物農(nóng)藥的專利文獻(xiàn)有：CN200810195704. 3公 開了一種復(fù)合生物殺蟲劑，具有高效、廣譜、無公害的特點(diǎn)；
[0005] CN200610000899. 2公開了一種淀粉廢水生產(chǎn)蘇云金桿菌微生物殺蟲劑的方法，可 獲得殺蟲效果良好并且環(huán)境友好的微生物殺蟲劑，既實(shí)現(xiàn)了淀粉廢水的資源化利用，又降 低了微生物殺蟲劑的生產(chǎn)成本；
[0006] CN201110029296. 6公開了利用馬鈴薯淀粉廢水和蘑菇渣資源化生產(chǎn)木霉生防劑 的方法，該方法是以馬鈴薯淀粉生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的高濃度有機(jī)廢水和蘑菇渣為培養(yǎng)基原 料，采用液態(tài)-固態(tài)聯(lián)合發(fā)酵的方法生產(chǎn)木霉生防劑，具有產(chǎn)生成本低，環(huán)境友好的特點(diǎn)， 產(chǎn)品能防治多種植物真菌病害，可以有效處理高濃度馬鈴薯淀粉廢水和蘑菇渣有機(jī)固體廢 棄物，減少了環(huán)境污染；
[0007] CN200610011155. 0公開了一種以剩飯菜為原料制備蘇云金芽孢桿菌生物農(nóng)藥的 方法，優(yōu)點(diǎn)在于工藝簡單、原料易得、生產(chǎn)成本低、變廢為寶；
[0008] CN200510094429. 2)公開了一種利用城市生活污泥發(fā)酵生產(chǎn)生物農(nóng)藥蘇云金桿菌 的方法，用含固率為1. 5-5%的污水污泥作為發(fā)酵蘇云金桿菌（B. t)的原料；
[0009] CN201010200184. 8公開了一種煙草基質(zhì)復(fù)合生物殺蟲劑及其制造方法，該復(fù)合生 物殺蟲劑中包含至少一種煙草植物源殺蟲組分和至少一種微生物源殺蟲組分，選取煙草廢 料為原料，經(jīng)殺蟲微生物發(fā)酵而制成，它是一種植物源和微生物源復(fù)合殺蟲劑，同時(shí)，達(dá)到 提高煙草廢料資源利用率和產(chǎn)品性能的雙重目的。
[0010] 市售商品有，杭州果攸生態(tài)環(huán)境科技有限公司生產(chǎn)的"水谷欣"生物殺蟲劑球孢白 僵菌，防治地下害蟲：如蠐螬、金針蟲、地老虎、螻蛄；揚(yáng)州綠源生物化工有限公司的"綠源" 微生物菌劑，防治蚊蠅；湖北農(nóng)科谷光科技有限公司生產(chǎn)的生物殺蟲劑"生綠"蘇云金桿菌， 防治韭蛆、根結(jié)線蟲。
[0011] 盡管如此，仍需要研制更高效、低毒、對(duì)環(huán)境友好，不易產(chǎn)生抗性的生物殺蟲劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的是提供一種液態(tài)復(fù)合生物多控殺蟲劑。
[0013] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供液態(tài)復(fù)合生物多控殺蟲劑的制備方法。
[0014] 本發(fā)明使用的復(fù)合微生物菌劑是中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC 1997 年版的菌種目錄中公開的菌種，編號(hào)和菌株名是：
[0015] 菌種編號(hào)為 CGMCCL 932 的賭狀芽抱桿菌（Bacillus cereus Frankland et Frankland)，菌種編號(hào)為CGMCC1.931 的短芽抱桿菌（Bacillus brevis Migula)，菌種 編號(hào)為 CGMCCL 1673 的球形芽抱桿菌（Bacillus sphaericus Meyer et Neide)，菌種 編號(hào)為CGMCCL 785的蘇云金芽抱桿菌（Bacillus thuringiensis Berliner)，菌種編 號(hào)為CGMCC3. 4035的淡紫擬青霉菌（Paecilomyces lilacinus Samson)，菌種編號(hào)為 CGMCC3. 4273 的球孢白僵菌（Beauveria bassiana Vuillemin)，菌種編號(hào)為 CGMCC3. 3675 的金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae) 〇
[0016] 按照本發(fā)明所述的液態(tài)復(fù)合生物多控殺蟲劑，其特征在于，由如下重量份配比的 原料組分制成：
[0017] 藥用植物：菊苣4?7份、甜葉菊4?7份、苦參15?25份，
[0018] 復(fù)合菌劑：蠟狀芽孢桿菌的菌液1?3份、短芽孢桿菌的菌液1?3份、球形芽孢 桿菌的菌液2?4份、蘇云金芽孢桿菌的菌液7?13份、淡紫擬青霉菌的菌液1?3份、球 孢白僵菌的菌液1?3份及金龜子綠僵菌的菌液1?3份，
[0019] 水 45 ?60 份。
[0020] 按照本發(fā)明所述的液態(tài)復(fù)合生物多控殺蟲劑，其特征在于，由如下重量份配比的 原料組分制成：
[0021] 藥用植物：菊苣4?6份、甜葉菊4?6份、苦參18?22份，
[0022] 復(fù)合菌劑：蠟狀芽孢桿菌的菌液2?3份、短芽孢桿菌的菌液2?3份、球形芽孢 桿菌的菌液2?4份、蘇云金芽孢桿菌的菌液9?11份、淡紫擬青霉菌的菌液2?3份、球 孢白僵菌的菌液2?3份及金龜子綠僵菌的菌液2?3份，
[0023] 水 50 ?60 份。
[0024] 按照本發(fā)明所述的液態(tài)復(fù)合生物多控殺蟲劑，其特征在于，藥用植物原料組分按 重量份配比為：菊苣5?6份、甜葉菊5?6份、苦參18?20份。
[0025] 按照本發(fā)明所述的液態(tài)復(fù)合生物多控殺蟲劑，其特征在于，其中所述藥用植物原 料組分苦參用同重量份配比的艾蒿或藜蘆代替。
[0026] 按照本發(fā)明所述的液態(tài)復(fù)合生物多控殺蟲劑，其特征在于，由如下重量份配比的 原料組分制成：
[0027] 菊苣5份、甜葉菊5份、苦參20份、蠟狀芽孢桿菌液2. 5份、球形芽孢桿菌液2. 5 份、短芽孢桿菌液3份、蘇云金芽孢桿菌液11份、淡紫擬青霉菌液2. 5份、金龜子綠僵菌液 2. 5份、球孢白僵菌液2. 5份及水53份。
[0028] 按照本發(fā)明所述的液態(tài)復(fù)合生物多控殺蟲劑的制備方法，其特征在于，如下步 驟：
[0029] A、藥用植物提取物的制備：
[0030] a、稱取藥用植物苦參20公斤，加入60%乙醇80?90升，回流提取2小時(shí)，濾過， 將殘?jiān)貜?fù)提取2次，第1次加入60%乙醇40?45升，第2次加入60%乙醇30?35升， 合并濾液，減壓回收乙醇，濾液濃縮至10升，加1 %鹽酸，調(diào)PH3?4,濾過，濾液中加10%氫 氧化鈉，調(diào)PHlO?11，用氯仿萃取4次，每次15升，合并氯仿層，用水10升洗滌，分出氯仿 層，水浴蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇溶解，至10公斤，搖勻，121°C滅菌20分鐘，制得；
[0031] b、稱取菊苣和甜葉菊各5公斤，加入80?100升無水乙醇，浸泡24小時(shí)，超聲波 提取20分鐘，將浸提液濾出，將殘?jiān)尤?0?50升無水乙醇，再提取1次，合并濾液，濃縮 至10公斤，經(jīng)121°C滅菌20分鐘，制得；
[0032] B、復(fù)合菌劑的制備：
[0033] 制備所述蠟狀芽孢桿菌液、球形芽孢桿菌液、短芽孢桿菌液或蘇云金芽孢桿菌液 的發(fā)酵方法：
[0034] a、斜面菌種活化培養(yǎng)：取牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，接入一種上述微生物的斜面 培養(yǎng)物，30?40°C條件下在搖床上振蕩培養(yǎng)20?48小時(shí)，轉(zhuǎn)速為60?120轉(zhuǎn)/分，然后 轉(zhuǎn)接到相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，照此方法連續(xù)轉(zhuǎn)接3?5次，將獲得的培養(yǎng)液稀釋后涂布到平 板固體培養(yǎng)基上，30?40°C條件下培養(yǎng)1?2天，轉(zhuǎn)速為60?120轉(zhuǎn)/分，待長出菌落后， 挑取大菌落在同樣的固體平板培養(yǎng)基上劃線，挑選單菌落轉(zhuǎn)接到固體斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)得 到馴化菌株，保存?zhèn)溆茫?br>[0035] b、二級(jí)搖瓶菌種培養(yǎng)：取牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，接入一級(jí)斜面菌種，于30? 40°C下培養(yǎng)20?48小時(shí)，轉(zhuǎn)速為60?120轉(zhuǎn)/分，得二級(jí)搖瓶種子液；根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模，進(jìn) 一步采用種子罐進(jìn)行種子的放大培養(yǎng)；
[0036] c、微生物菌液的發(fā)酵生產(chǎn)：取牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，接入上述制備的發(fā)酵種 子液，于PH7. 2?8. 5、溫度30?40°C，發(fā)酵1?2天，即得，經(jīng)檢驗(yàn)，每一種有效菌的數(shù)量 不得少于2億/毫升后，符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB-20287-2006,可作為生產(chǎn)菌液備用；
[0037] 制備所述淡紫擬青霉菌液、金龜子綠僵菌液或球孢白僵菌液的發(fā)酵方法：
[0038] a、斜面菌種活化培養(yǎng)：取PDA液體培養(yǎng)基，接入一種上述微生物的斜面培養(yǎng)物， 25?30°C條件下在搖床上振蕩培養(yǎng)48?72小時(shí)，轉(zhuǎn)速為60?120轉(zhuǎn)/分，然后轉(zhuǎn)接到相 同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，照此方法連續(xù)轉(zhuǎn)接3?5次，將獲得的培養(yǎng)液稀釋后涂布到平板固體培 養(yǎng)基上，25?30°C條件下培養(yǎng)3?5天，轉(zhuǎn)速為60?120轉(zhuǎn)/分，待長出粗壯菌絲后，挑取 粗壯菌絲在同樣的固體平板培養(yǎng)基上劃線，挑選粗壯菌絲轉(zhuǎn)接到固體斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)得 到馴化菌株，保存?zhèn)溆茫?br>[0039] b、二級(jí)搖瓶菌