精液超低溫冷凍保存液中添加0.27ml丙三醇，用漩渦混勻器充分混合，然后置于4°C環(huán)境中平衡15分鐘，再放入新鮮哲羅鮭精液進行混合，充分混勻后置于4°C環(huán)境中平衡I分鐘，之后再添加0.27ml丙三醇充分混合放于4°C環(huán)境中平衡I分鐘，而后再添加0.54ml丙三醇，充分混合，即得到精液冷凍保存混合液；
[0045]三、將精液冷凍保存混合液用微量移液器分裝于麥管中，然后放置于4°C環(huán)境中備用；
[0046]四、將液氮導入帶蓋泡沫箱中，移入麥管中的精液冷凍保存混合液在距離液氮液面上方8cm處停留5min，然后在距液氮液面上方4cm處停留3min，再將麥管直接投入液氮中長期保存；
[0047]五、將冷凍保存的麥管進行水浴解凍，水浴水溫為25 V?30°C，解凍時間為15?18s，解凍過程中搖動麥管；
[0048]其中，步驟二中新鮮哲羅鮭精液的加入量為3ml ；
[0049]哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液由8.0lg的NaCl、0.4g的KC1、0.14g的CaCl2、0.35g的NaHC03、0.06g的KH2P04、0.34g的葡萄糖和1000ml的蒸餾水組成；
[0050]步驟四中液氮液面距離箱口 13cm ;
[0051]將冷凍保存的麥管進行水浴解凍，水浴水溫為25°C?30°C，解凍時間為15?18s，解凍過程中搖動麥管。
[0052]解凍完畢后取本實施例冷凍保存的適量精液激活，然后鏡檢觀察解凍后哲羅鮭精子。經(jīng)檢測本實施例冷凍保存2個月的哲羅鮭精子解凍、激活后存活率為79.4%，運動比例達到75.8%;本實施例冷凍保存3年的哲羅鮭精子解凍、激活后存活率為79.3%，運動比例達到75.6%o
[0053]取剩余激活哲羅鮭精子(冷凍保存3年)進行人工授精實驗(每毫升精液可以給I萬粒卵子受精，I萬粒卵子約1.25升)，受精率達86.8%。說明本發(fā)明經(jīng)冷凍保存的哲羅鮭精具子有高存活率和高活動力。
[0054]實施例2
[0055]哲羅鮭精液按以下步驟進行冷凍保存:
[0056]—、采集哲羅鮭新鮮精液，經(jīng)檢測精子活動率為85.4% ;
[0057]二、向7.92ml哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液中添加0.27ml丙三醇，用漩渦混勻器充分混合，然后置于4°C環(huán)境中平衡15分鐘，再放入新鮮哲羅鮭精液進行混合，充分混勻后置于4°C環(huán)境中平衡I分鐘，之后再添加0.27ml丙三醇充分混合放于4°C環(huán)境中平衡I分鐘，而后再添加0.54ml丙三醇，充分混合，即得到精液冷凍保存混合液；
[0058]三、將精液冷凍保存混合液用微量移液器分裝于麥管中，然后放置于4°C環(huán)境中備用；
[0059]四、將液氮導入帶蓋泡沫箱中，移入麥管中的精液冷凍保存混合液在距離液氮液面上方8cm處停留lOmin，然后在距液氮液面上方4cm處停留5min，再將麥管直接投入液氮中長期保存；
[0060]五、將冷凍保存的麥管進行水浴解凍，水浴水溫為25 V?30°C，解凍時間為15?18s，解凍過程中搖動麥管；
[0061]其中，步驟二中新鮮哲羅鮭精液的加入量為3ml ；
[0062]哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液由8.0lg的NaCl、0.4g的KC1、0.14g的CaCl2、0.35g的NaHC03、0.06g的KH2P04、0.34g的葡萄糖和100ml的蒸餾水組成；
[0063]步驟四中液氮液面距離箱口 13cm ;
[0064]將冷凍保存的麥管進行水浴解凍，水浴水溫為25°C?30°C，解凍時間為15?18s，解凍過程中搖動麥管。
[0065]解凍完畢后取本實施例冷凍保存的適量精液激活，然后鏡檢觀察解凍后哲羅鮭精子。經(jīng)檢測本實施例冷凍保存2個月的哲羅鮭精子解凍、激活后存活率為80.0%，運動比例達到74.5%;本實施例冷凍保存3年的哲羅鮭精子解凍、激活后存活率為80.1%，運動比例達到74.4%。
[0066]取剩余激活哲羅鮭精子(冷凍保存3年)進行人工授精實驗(每毫升精液可以給I萬粒卵子受精)，受精率達85.6%。說明本發(fā)明經(jīng)冷凍保存的哲羅鮭精子具有高存活率和高活動力。
[0067]實施例3
[0068]哲羅鮭精液按以下步驟進行冷凍保存:
[0069]—、采集哲羅鮭新鮮精液，經(jīng)檢測精子活動率為85.4% ;
[0070]二、向7.92ml哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液中添加0.27ml丙三醇，用漩渦混勻器充分混合，然后置于4°C環(huán)境中平衡15分鐘，再放入新鮮哲羅鮭精液進行混合，充分混勻后置于4°C環(huán)境中平衡I分鐘，之后再添加0.27ml丙三醇充分混合放于4°C環(huán)境中平衡I分鐘，而后再添加0.54ml丙三醇，充分混合，即得到精液冷凍保存混合液；
[0071]三、將精液冷凍保存混合液用微量移液器分裝于麥管中，然后放置于4°C環(huán)境中備用；
[0072]四、將液氮導入帶蓋泡沫箱中，移入麥管中的精液冷凍保存混合液在距離液氮液面上方8cm處停留15min，然后在距液氮液面上方4cm處停留8min，再將麥管直接投入液氮中長期保存；
[0073]五、將冷凍保存的麥管進行水浴解凍，水浴水溫為25 V?30°C，解凍時間為15?18s，解凍過程中搖動麥管；
[0074]其中，步驟二中新鮮哲羅鮭精液的加入量為3ml ；
[0075]哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液由8.0lg的NaCl、0.4g的KC1、0.14g的CaCl2、0.35g的NaHC03、0.06g的KH2P04、0.34g的葡萄糖和1000ml的蒸餾水組成；
[0076]步驟四中液氮液面距離箱口 13cm ;
[0077]將冷凍保存的麥管進行水浴解凍，水浴水溫為25°C?30°C，解凍時間為15?18s，解凍過程中搖動麥管。
[0078]解凍完畢后取本實施例冷凍保存的適量精液激活，然后鏡檢觀察解凍后哲羅鮭精子。經(jīng)檢測本實施例冷凍保存2個月的哲羅鮭精子解凍、激活后存活率為78.5%，運動比例達到73.6%;本實施例冷凍保存3年的哲羅鮭精子解凍、激活后存活率為78.2%，運動比例達到73.5%。
[0079]取剩余激活哲羅鮭精子(冷凍保存3年)進行人工授精實驗(每毫升精液可以給I萬粒卵子受精)，受精率達84.3%。說明本發(fā)明經(jīng)冷凍保存的哲羅鮭精子具有高存活率和高活動力。
[0080]采用本發(fā)明方法冷凍保存2個月和冷凍保存3年的哲羅鮭精子質(zhì)量基本沒有變化，說明本發(fā)明冷凍保存哲羅鮭精子的方法適合長期保存哲羅鮭精子。
【主權(quán)項】
1.一種哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液，其特征在于哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液中按摩爾比K+: Na+〈I: 16，哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液中K+濃度為0.00480mol/L?0.00682mol/Lo
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液，其特征在于哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液由7.95?8.07g的NaCl、0.325?0.475g的KC1、0.12?0.15g的CaCl2、0.349 ?0.351g 的 NaHCO3>0.059 ?0.061g 的 ΚΗ2Ρ04、0.30 ?0.38g 的葡萄糖和 100ml 的蒸餾水組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液，其特征在于哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液由 8.0lg 的 NaCK0.4g 的 KC1、0.14g 的 CaCl2、0.35g 的 NaHC03、0.06g 的KH2PO4>0.34g的葡萄糖和1000ml的蒸飽水組成。
4.哲羅鮭精液的冷凍保存方法，其特征在于哲羅鮭精液按以下步驟進行冷凍保存: 一、采集哲羅鮭新鮮精液； 二、向7.92ml哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液中添加0.27ml丙三醇，用漩渦混勻器充分混合，然后置于4°C環(huán)境中平衡15分鐘，再放入新鮮哲羅鮭精液進行混合，充分混勻后置于4°C環(huán)境中平衡I分鐘，之后再添加0.27ml丙三醇充分混合放于4°C環(huán)境中平衡I分鐘，而后再添加0.54ml丙三醇，充分混合，即得到精液冷凍保存混合液； 三、將精液冷凍保存混合液用微量移液器分裝于麥管中，然后放置于4°C環(huán)境中備用； 四、將液氮導入帶蓋泡沫箱中，移入麥管中的精液冷凍保存混合液在距離液氮液面上方8cm處停留5?15min，然后在距液氮液面上方4cm處停留3?8min，再將麥管直接投入液氮中長期保存； 五、解凍采用快速水浴解凍法； 其中，步驟二中新鮮哲羅鮭精液的加入量為3ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的哲羅鮭精液的冷凍保存方法，其特征在于步驟四中液氮液面距離箱口 12cm?15cm。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的哲羅鮭精液的冷凍保存方法，其特征在于步驟五快速水浴解凍法:將冷凍保存的麥管進行水浴解凍，水浴水溫為25°C?30°C，解凍時間為15?18s，解凍過程中搖動麥管。
【專利摘要】一種哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液及哲羅鮭精液的冷凍保存方法，它涉及一種魚類精液低溫冷凍保存液及哲羅鮭精液的冷凍保存方法。它解決了現(xiàn)有哲羅鮭精子長期冷凍技術(shù)存在的活率低，存活精子的活力低、活動率大幅下降的問題。哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液中按摩爾比K+︰Na+<1︰16，哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液中K+濃度為0.00480mol/L～0.00682mol/L。冷凍保存：一、采集哲羅鮭新鮮精液；二、制備精液冷凍保存混合液；三、將精液冷凍保存混合液分裝；四、冷凍保存；五、解凍采用快速水浴解凍法。本發(fā)明方法簡單易行，具有冷凍保存時間長，解凍后精子質(zhì)量高的優(yōu)點。
【IPC分類】A01N1-02
【公開號】CN104604845
【申請?zhí)枴緾N201510063790
【發(fā)明人】徐革鋒, 尹家勝
【申請人】中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年2月6日