詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0035]實(shí)施例1
[0036]一種提高蘆葦粘性愈傷組織誘導(dǎo)率的植物離體培養(yǎng)方法，步驟如下:
[0037]步驟一、MS儲(chǔ)備液配制，
[0038]稱取47.5gKN03^P 41.25gNH 4勵(lì)3溶于去離子水，定容至500ml，獲得MS-A儲(chǔ)備液，4°C保存；
[0039]稱取18.5gMgS04.7H20、1.115gMnS04.4H20 和 0.43gZnS04.7Η20 溶于去離子水，再加入Imgmr1的CuSO4.5H20溶液1.25ml，定容至500ml，獲得MS-B儲(chǔ)備液，4°C保存；
[0040]稱取22gCaCl2.2Η20溶于去離子水，分別加入Imgml ―1的CoCl 2.6Η20溶液1.25ml和1mgmr1的KI溶液4.15ml，定容至500ml，獲得MS-C儲(chǔ)備液，4°C保存；
[0041]稱取8.5gKH2P0#0.31gH 3B03溶于去離子水，再加入 1mgml I^Na2MoO4.2Η20 溶液1.25ml，定容至500ml，獲得MS-D儲(chǔ)備液，4°C保存；
[0042]稱取1.39gFeS04.7H20和1.865gNa2EDTA，分別溶于去離子水，混合后定容至500ml，獲得MS-E儲(chǔ)備液，4°C避光保存；
[0043]稱取1mg維生素B3、1mg維生素B6、40mg甘氨酸和2g肌醇，溶于去離子水，再加入Img ?ml 1維生素BI溶液2ml，定容至100ml，0.22 μ m濾膜過(guò)濾滅菌，分裝于2ml微量離心管，獲得MS-F儲(chǔ)備液，_20°C保存；
[0044]步驟二、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑儲(chǔ)備液的配制，
[0045]將10mg 二氯苯氧乙酸加入lmolL_1的氫氧化鈉溶液中振蕩溶解后，蒸餾水定容至100ml，0.22 μ m濾膜過(guò)濾滅菌，獲得濃度為Imgml 1的二氯苯氧乙酸儲(chǔ)備液，分裝于2ml的微量離心管，_20°C保存；
[0046]將10mg萘乙酸加入lmolL_1的氫氧化鈉溶液中振蕩溶解后，蒸餾水定容至100ml，0.22 μ m濾膜過(guò)濾滅菌，獲得萘乙酸儲(chǔ)備液，分裝于2ml的微量離心管，_20°C保存；
[0047]將50mg芐基腺嘌呤加入lmoll/1的鹽酸溶液中振蕩溶解，蒸餾水定容至50ml，0.22 μ m濾膜過(guò)濾滅菌，獲得芐基腺嘌呤儲(chǔ)備液，分裝于2ml的微量離心管，_20°C保存；
[0048]步驟三、L-谷氨酰胺儲(chǔ)備液配制，
[0049]稱取0.1gL-谷氨酰胺溶于去離子水，定容至100ml，0.22 μ m濾膜過(guò)濾滅菌，分裝于2ml的微量離心管，-20°C保存。
[0050]在植物體內(nèi)，氨基酸不僅在蛋白質(zhì)合成中起著關(guān)鍵作用，同時(shí)也在初級(jí)和次級(jí)代謝中發(fā)揮著重要作用，因而氨基酸的合成直接或間接地影響著植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)方面。植物體內(nèi)有機(jī)化合物通過(guò)多個(gè)代謝途徑把銨釋放出來(lái)，但與動(dòng)物不同，植物并不分泌含氮廢物，而是將釋放出的錢再次同化為一類N-轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸(N-transportaminoacid)，即谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸等4種氨基酸。它們主要用于將氮從源器官向庫(kù)組織轉(zhuǎn)移，且在氮源充足條件下存氮，以備植物體生長(zhǎng)、防御和繁殖所需。其中，谷氨酰胺不但為核酸、氨基酸和其他的含氮化合物的合成提供氮源，且其所同化的氮也能整合到天冬氨酸與天冬酰胺中，同時(shí)谷氨酰胺與谷氨酸可進(jìn)入植物體內(nèi)銨主要的同化途徑GS/G0GAT循環(huán)，因而谷氨酰胺形式的氮可立即進(jìn)入植物代謝。在以種子為外植體的蘆葦離體培養(yǎng)中，加入谷氨酰胺這種有機(jī)形式的還原氮時(shí)，可起到明顯的促進(jìn)細(xì)胞分裂作用，增強(qiáng)了愈傷組織質(zhì)量，提高了愈傷組織誘導(dǎo)率。
[0051]步驟四、培養(yǎng)基配制，取800ml去離子水，依次加入20mlMS_A儲(chǔ)備液、1mlMS-B儲(chǔ)備液、1mlMS-C儲(chǔ)備液、1mlMS-D儲(chǔ)備液、1mlMS-E儲(chǔ)備液、蔗糖30g，攪拌溶解，定容至1L，調(diào)節(jié)PH值至5.8，轉(zhuǎn)至IL錐形瓶，再加入16g瓊脂粉，封口后于121°C高溫高壓滅菌20分鐘，冷卻至60°C，加入5mlMS-F儲(chǔ)備液，獲得初培養(yǎng)基，
[0052]在初培養(yǎng)基中加入二氯苯氧乙酸儲(chǔ)備液、萘乙酸儲(chǔ)備液、芐基腺嘌呤儲(chǔ)備液與L-谷氨酰胺儲(chǔ)備液，搖勻分裝至平皿或錐形瓶，封口膜密封保存，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中二氯苯氧乙酸的濃度為Img L—1，萘乙酸的濃度為Img L—1，芐基腺嘌呤的濃度為0.5mgL_\ L-谷氨酰胺的濃度為0.25mg Γ1;
[0053]在初培養(yǎng)基中加入二氯苯氧乙酸儲(chǔ)備液，搖勻分裝至平皿或錐形瓶，封口膜密封保存，獲得增殖培養(yǎng)基，增殖培養(yǎng)基中二氯苯氧乙酸的濃度為2.5mg I71;
[0054]在初培養(yǎng)基中不加入任何物質(zhì)，分裝至平皿或錐形瓶，封口膜密封保存，獲得再生培養(yǎng)基；
[0055]步驟五、獲取外植體，采集成熟的蘆葦小穗，置種子袋中，于陽(yáng)光下曬7日后，儲(chǔ)存在種子柜中備用，挑選飽滿穎果，用接種針緩慢剝?nèi)?nèi)外稃，體式顯微鏡下觀察獲取的蘆葦種子表面有無(wú)損傷，取無(wú)損的種子作為外植體，每50粒種子置于2ml無(wú)菌微量離心管中，Parafilm膜封口保存，2日內(nèi)種子未使用，則棄用；
[0056]步驟六、種子消毒，將蘆葦種子移至25ml無(wú)菌錐形瓶，加入1ml無(wú)菌水，隔夜浸泡18小時(shí)，去無(wú)菌水后，加體積濃度為70%的乙醇進(jìn)行表面消毒30秒；再加入質(zhì)量濃度5%的次氯酸鈉表面消毒20分鐘，次氯酸鈉中還含有質(zhì)量濃度為0.02%的吐溫20，每5分鐘搖晃一次錐形瓶。無(wú)菌水清洗五次后，將種子轉(zhuǎn)至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基。同時(shí)，取最后一次清洗的無(wú)菌水100 μ L涂布于LB培養(yǎng)基、869培養(yǎng)基平皿上，置于培養(yǎng)箱孵育3天，檢測(cè)種子消毒是否徹底，污染則棄用；
[0057]步驟七、誘導(dǎo)粘性愈傷組織，將消毒過(guò)的種子接種置誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在人工氣候箱里24°C暗培養(yǎng)2周，至在胚芽鞘末端形成粘性愈傷組織；
[0058]步驟八、增殖胚性愈傷組織，從胚芽鞘末端剝離粘性愈傷組織，轉(zhuǎn)至新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行光培養(yǎng)，光培養(yǎng)的光周期為16/8h，光照強(qiáng)度為60 μ mo I m 2S \每3周繼代一次，至愈傷組織表面具有細(xì)小瘤狀物和綠點(diǎn)，篩選此類愈傷組織形態(tài)為胚性愈傷組織，再將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至增殖培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)；
[0059]步驟九、幼苗再生，將增殖的胚性愈傷轉(zhuǎn)至再生培養(yǎng)基，觀察根莖分化并適時(shí)繼代，直至再生完整植株。
[0060]約I周，蘆葦種子萌發(fā)，形成胚芽鞘。2周后，胚芽鞘末端形成白色、半透明、有光澤的粘性愈傷組織，而不能形成粘性愈傷組織的蘆葦種子，胚芽鞘末端開(kāi)始有胚根分化。通過(guò)F檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同濃度L-谷氨酰胺誘導(dǎo)蘆葦粘性愈傷組織出愈數(shù)差異極顯著，這表明L-谷氨酰胺促進(jìn)了蘆_粘性愈傷組織的誘導(dǎo)。通過(guò)Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)(q-test)進(jìn)行多重比較，發(fā)現(xiàn)0.25mg L1L-谷氨酰胺誘導(dǎo)的粘性愈傷組織出愈數(shù)比照空白組多出近20%。
[0061]實(shí)施例2
[0062]一種提高蘆葦粘性愈傷組織誘導(dǎo)率的植物離體培養(yǎng)方法，步驟如下:
[0063]步驟一、MS儲(chǔ)備液配制，
[0064]稱取47.5gKN03^P 41.25gNH 4勵(lì)3溶于去離子水，定容至500ml，獲得MS-A儲(chǔ)備液，4°C保存；
[0065]稱取18.5gMgS04.7H20、1.115gMnS04.4H20 和 0.43gZnS04.7Η20 溶于去離子水，再加入Imgmr1的CuSO4.5Η20溶液1.25ml，定容至500ml，獲得MS-B儲(chǔ)備液，4°C保存；
[0066]稱取22gCaCl2.2Η20溶于去離子水，分別加入Imgml ―1的CoCl 2.6Η20溶液L 25ml和1mgmr1的KI溶液4.15ml，定容至500ml，獲得MS-C儲(chǔ)備液，4°C保存；
[0067]稱取8.5gKH2P04^P 0.31gH 忑03溶于去離子水，再加入 1mgml _1的 Na 2Μο04.2Η20 溶液1.25ml，定容至500ml，獲得MS-D儲(chǔ)備液，4°C保存；
[0068]稱取1.39gFeS04.7H20和1.865gNa2EDTA，分別溶于去離子水，混合后定容至500ml，獲得MS-E儲(chǔ)備液，4°C避光保存；
[0069]稱取1mg維生素B3、1mg維生素B6、40mg甘氨酸和2g肌醇，溶于去離子水，再加入Img ?ml 1維生素BI溶液2ml，定容至100ml，0.22 μ m濾膜過(guò)濾滅菌，分裝于2ml微量離心管，獲得MS-F儲(chǔ)備液，_20°C保存；
[0070]步驟二、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑儲(chǔ)備液的配制，
[0071]將10mg 二氯苯氧乙酸加入ImolI/1的氫氧化鈉溶液中振蕩溶解后，蒸餾水定容至100ml，0.22 μ m濾膜過(guò)濾滅菌，獲得濃度為Imgml 1的二氯苯氧乙酸儲(chǔ)備液，分裝于2ml的微量離心管，_20°C保存；
[0072]將10mg萘乙酸加入lmolL_1的氫