石榴同源四倍體的誘導(dǎo)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物種質(zhì)資源創(chuàng)新技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種石榴同源四倍體的誘導(dǎo)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 石榴是世界上栽培較早的果樹，有1000余個(gè)品種，在全球熱帶、亞熱帶區(qū)域種植 分布廣，具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值、藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值。近年來，國內(nèi)通過雜交育種、芽變選育、 實(shí)生選育、國外品種引種馴化選育出了不少優(yōu)良石榴品種，實(shí)現(xiàn)保存石榴品種類型達(dá)到280 余個(gè)。據(jù)研宄現(xiàn)有栽培石植為二倍體，體細(xì)胞染色體數(shù)目有2n= 2x= 18和2n= 2x= 16兩種類型，而植物多倍化后，易出現(xiàn)營養(yǎng)和生殖器官的變大，次生代謝物含量的提高，抗 逆性、抗病性的增強(qiáng)。因此，誘導(dǎo)培育出同源四倍體石榴，可以較大幅度提高石榴品質(zhì)、抗逆 性、抗病性及藥用價(jià)值等。而目前的誘導(dǎo)操作方法繁瑣，且誘導(dǎo)成功率不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種操作簡單，誘導(dǎo)成功 率高的石榴同源四倍體的誘導(dǎo)方法。
[0004] 一種石榴同源四倍體的誘導(dǎo)方法，包括以下步驟：
[0005] (1)采收自交成熟的石榴果實(shí)，取其種子并用清水洗凈晾干，將晾干種子置于4°C 條件下處理4d，再放入27°C恒溫箱催芽至萌動(dòng)狀態(tài)；
[0006] (2)將步驟1中萌動(dòng)的石榴種子浸泡在質(zhì)量百分比濃度為0. 3%的秋水仙堿溶液 里，然后將其置于25°C遮光恒溫?fù)u床上，以lOOr/min的速度振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，處理完后用 自來水浸泡清洗3-5次，每次浸泡時(shí)間5min。
[0007] 進(jìn)一步地，如上所述的石榴同源四倍體的誘導(dǎo)方法，所述質(zhì)量百分比濃度為0. 3% 的秋水仙堿溶液中添加有二甲基亞砜，二甲基亞砜在秋水仙堿溶液中的質(zhì)量百分比濃度為
[0008] 進(jìn)一步地，如上所述的石榴同源四倍體的誘導(dǎo)方法，在步驟1中進(jìn)行催芽過程中， 每天用清水清洗一次催芽種子以及催芽過程中用到的紗布。
[0009] 進(jìn)一步地，如上所述的石榴同源四倍體的誘導(dǎo)方法，在步驟1之前，還包括：按照 石榴生長特性進(jìn)行常規(guī)栽培管理，在石榴盛花期進(jìn)行自花或同株異花人工授粉，授粉前后 套透氣紙袋隔離；精心管理授粉石榴樹，防止落花落果；其中，石榴授粉時(shí)間選上午9:00- 10:00。
[0010] 進(jìn)一步地，如上所述的石榴同源四倍體的誘導(dǎo)方法，在步驟2之后，還包括以下步 驟：
[0011] (3)將誘變處理后的萌動(dòng)石榴種子播種于消毒處理過的苗床或育苗盤，適時(shí)澆水 和病蟲害防治，待苗長出真葉后，每周噴灑1次1/2MS營養(yǎng)液葉面肥；
[0012] (4)多倍體流式細(xì)胞儀檢測(cè)，取正常二倍體植株的嫩葉0.IOg作為對(duì)照組，另分 別取所有誘變處理植株的嫩葉各0.l〇g，然后將正常二倍體和所有誘變處理植株的嫩葉分 別置于含ImlWPB緩沖液的培養(yǎng)皿中用刀片剁碎，2min后用300目尼龍網(wǎng)過濾，濾液加入 50yIlOmg/mlDAPI，5min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，利用正常二倍體植株的嫩葉的濾液作為 對(duì)照，篩選出葉片單細(xì)胞DNA含量為兩倍于二倍體植株的變異株，將該變異株擬定為四倍 體，并將其編號(hào)作為下一步植株染色數(shù)目檢測(cè)材料；
[0013] (5)多倍體染色體數(shù)目觀察：從擬定為四倍體的植株上剪取5-7cm長嫩枝，生根 處理后扦插于沙床，扦插苗培育生根2周后，取其幼嫩根尖長2-3_，用質(zhì)量百分比濃度為 0. 1 %的秋水仙堿溶液預(yù)處理4h，蒸餾水洗2-3次后，在4°C冰箱用卡諾氏固定液固定24h， 4°C冰箱中保存?zhèn)溆?，將根尖蒸餾水清洗，置于lmol/LHCl于60°C水浴中酸解8min，然后用 改良苯酚品紅染色壓片法制備染色體標(biāo)本，用顯微鏡觀察染色體數(shù)目，選染色體數(shù)目為兩 倍于二倍體染色體數(shù)目的植株，確定為加倍成功的同源四倍體石榴。
[0014] 進(jìn)一步地，如上所述的石榴同源四倍體的誘導(dǎo)方法，步驟4之前，包括：提前鏡檢 誘變材料氣孔大小，篩選氣孔大于二倍體的變異植株用于多倍體流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
[0015] 進(jìn)一步地，如上所述的石榴同源四倍體的誘導(dǎo)方法，步驟5中，根尖鹽酸裂解后， 放入蒸餾水中低壓滲透20分鐘，促使細(xì)胞染色體分散。
[0016] 本發(fā)明克服一般倍性誘導(dǎo)方法操作繁瑣的缺陷。誘導(dǎo)方法操作簡易，誘導(dǎo)成功率 高，滿足多倍體選種之用，使多倍體育種成為石榴遺傳改良、新品種培育的重要方法。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例石榴二倍體染色體圖；
[0018] 圖2為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例石榴四倍體染色體圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清 楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；?本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他 實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0020] 本發(fā)明提供的一種石榴同源四倍體的誘導(dǎo)方法包括以下步驟：
[0021] (1)人工授粉及管理：按照石榴生長特性進(jìn)行常規(guī)栽培管理，在石榴盛花期進(jìn)行 自花或同株異花人工授粉，授粉前后套透氣紙袋隔離；精心管理授粉石榴樹，防止落花落 果；其中，石榴授粉時(shí)間選上午9:00-10:00,坐果后及時(shí)給樹體補(bǔ)充養(yǎng)分、水分，減少生理 落果，促進(jìn)果實(shí)正常發(fā)育。
[0022] (2)種子預(yù)處理：采收自交成熟的石榴果實(shí)，取其種子并用清水洗凈晾干。將晾干 種子置于4°C低溫處理4d，再放入27°C恒溫箱催芽至萌動(dòng)狀態(tài)。由于石榴果肉難清洗干凈， 易少量殘留在外種皮上，在恒溫催芽過程中容易發(fā)霉，應(yīng)注意每天用清水清洗一次紗布和 催芽種子。
[0023] 具體地，將石榴種子低溫處理一段時(shí)間（置于4°C低溫處理4d)是為了打破種子休 目民，有利于種子催芽，減少種子催芽萌發(fā)時(shí)間，提高種子催芽萌發(fā)整齊度。
[0024] (3)同源四倍體誘導(dǎo)：將處理剛萌動(dòng)的石榴種子浸泡在質(zhì)量百分比濃度為0. 3% 的秋水仙堿溶液（添加1%的二甲基亞砜DMSO)里，然后將其置于25°C遮光恒溫?fù)u床上， 以lOOr/min的速度振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，處理完后用自來水浸泡清洗3-5次，每次浸泡時(shí)間 5min〇
[0025] 具體地，在相同處理時(shí)間長度下，高濃度比低濃度秋水仙堿溶液誘導(dǎo)多倍體效果 好些，但高濃度比低濃度秋水仙堿溶液毒害損傷誘導(dǎo)材料要大些，因此，本發(fā)明用秋水仙堿 溶液誘導(dǎo)多倍體時(shí)，選用0.3%的秋水仙堿溶液誘導(dǎo)石榴同源四倍體。二甲基亞砜作為滲透 劑，能夠促進(jìn)秋水仙堿快速滲透到植物組織細(xì)胞中去，并提高秋水仙素的加倍效果。同時(shí)二 甲基亞砜能減輕秋水仙堿的毒害作用，并降低嵌合體的發(fā)生率。添加質(zhì)量百分比濃度為1 % 的DMSO能提高多倍體誘導(dǎo)效果。lOOr/min的速度振蕩讓秋水仙堿溶液充分與誘變種子材 料接觸，同時(shí)也可以增加處理溶液中的氧量含，利于種子萌發(fā)正常生理代謝進(jìn)行。
[0026] (4)誘變苗培育：將誘變處理后的石榴種子播種于消毒處理過的苗床或育苗盤， 適時(shí)澆水和病蟲害防治，待苗期一周后給葉面噴灑1次1/2MS營養(yǎng)液。其中，土壤、基質(zhì)、 育苗盤等消毒可選用多菌靈、高錳酸鉀等藥劑，誘變石榴苗期噴施1/2MS營養(yǎng)液濃度范圍 700-1000 倍液。
[0027] (5)多倍體流式細(xì)胞儀檢測(cè)：取正常二倍體植株的嫩葉0.IOg作為對(duì)照組，另分別 取所有誘變處理植株的嫩葉各〇.l〇g，然后將正常二倍體植株的嫩葉和所有誘變處理植株 的嫩葉分別置于含Iml木本植物緩沖液（woodyplantbuffer，簡稱：WPB)緩沖液的培養(yǎng)皿 中用刀片剁碎，21^11后用300目尼龍網(wǎng)過濾，濾液加入5(^11〇1^/11114'，6-二脒基-2-苯 基口引噪，（4'，6-diamidino_2-phenylindole，簡稱：DAPI)，5min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，利用 正常二倍體植株的嫩葉的濾液作為對(duì)照，篩選出葉片單細(xì)胞DNA含量為兩倍于二倍體植株