一種球子蕨無(wú)菌繁殖技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說(shuō)，涉及一種球子蕨無(wú)菌繁殖技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]蕨類植物種類繁多，全世界約有70多個(gè)科超過(guò)12000種，分布廣泛，其中熱帶和亞熱帶地區(qū)的種類尤其豐富；我國(guó)蕨類植物種類繁多，是蕨類植物分布最多的區(qū)域之一，約占世界蕨類種類的1/5，被稱為蕨類王國(guó)。蕨類植物以其獨(dú)特的觀賞性狀和生理特性己逐漸博得了越來(lái)越多人的青睞，在很多發(fā)達(dá)國(guó)家，蕨類植物己經(jīng)成為花卉市場(chǎng)和園林應(yīng)用中的重要組成部分，我國(guó)豐富的蕨類植物資源還需要被更多的開(kāi)發(fā)出來(lái)以滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的需求，對(duì)觀賞蕨類的研宄、開(kāi)發(fā)和利用對(duì)豐富園林配置素材、拓展層次空間及提高生態(tài)效益等諸多方面都具有重要意義。
[0003]球子蕨sensibilis L.)為球子蕨科球子蕨屬植物，中型的陸生蕨類。球子蕨在園林中常用作假山石的配景植物，也可配置于建筑物之背陰角隅，還可盆栽用作室內(nèi)觀葉植物，觀賞價(jià)值較高。蕨類植物的繁殖主要通過(guò)孢子播種、分株、壓條等方式進(jìn)行，但繁殖系數(shù)低，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，同時(shí)易受外界環(huán)境條件等因素的影響。目前尚未見(jiàn)對(duì)于球子蕨繁殖技術(shù)方面的研究報(bào)道，本發(fā)明以球子蕨孢子為外植體，經(jīng)過(guò)孢子萌發(fā)、愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽分化及生根等過(guò)程獲得了球子蕨離體再植株，建立球子蕨的無(wú)菌繁殖技術(shù)體系，以應(yīng)用于規(guī)模化生產(chǎn)同時(shí)促進(jìn)其在園林中的廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供出一種球子蕨無(wú)菌繁殖技術(shù)，本發(fā)明以球子蕨孢子為外植體，經(jīng)過(guò)孢子萌發(fā)、愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽分化及生根等過(guò)程獲得了球子蕨離體再植株，建立球子蕨的無(wú)菌繁殖技術(shù)體系，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明的一種球子蕨無(wú)菌繁殖技術(shù)，包括以下的步驟:
(I)孢子消毒:將孢子置于1.5mL(或2mL)離心管中，蒸懼水浸泡I?3h,以4000r/min速度離心5?1min,去上清液。加入3%?5%的次氯酸鈉溶液進(jìn)行消毒5?15min,再4000r/min速度離心5?1min,去上液,用無(wú)菌水沖洗4?5次,加無(wú)菌蒸懼水配制成濃度約為6000個(gè)/mL的孢子懸浮液備用。
[0006](2)孢子萌發(fā)培養(yǎng):取經(jīng)步驟(I)處理后的孢子懸浮液0.5mL接種于萌發(fā)培養(yǎng)基中進(jìn)行孢子萌發(fā)培養(yǎng)。接種后置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?40001x，置于培養(yǎng)溫度為23?25°C，空氣相對(duì)濕度為75%?80%的條件下培養(yǎng)20天后統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。
[0007](3)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng):將步驟(2)萌發(fā)培養(yǎng)得到的單個(gè)原葉體莖接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。接種后置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?40001x，置于培養(yǎng)溫度為23?25°C，空氣相對(duì)濕度為75%?80%的條件下培養(yǎng)40天后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)情況。
[0008](4)叢生芽誘導(dǎo)及增殖:將步驟(3)誘導(dǎo)出的愈傷組織切割成大小(3mmX 3mm) —致的團(tuán)塊并接種到分化培養(yǎng)基中進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)和增殖。接種后置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?40001x，置于培養(yǎng)溫度為23?25°C，空氣相對(duì)濕度為75%?80%的條件下培養(yǎng)40天后統(tǒng)計(jì)叢生芽分化情況。
[0009](5)生根培養(yǎng):將步驟(4)誘導(dǎo)出的叢生芽切割成單芽后接種至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)生根。接種后置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?40001χ，置于培養(yǎng)溫度為23?25°C，空氣相對(duì)濕度為75%?80%的條件下培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)生根情況。
[0010](6)煉苗移栽:當(dāng)孢子體苗根長(zhǎng)到約2cm、莖高約3cm時(shí)，將培養(yǎng)瓶瓶蓋打開(kāi)，在通風(fēng)處煉苗3?5天。取出生根苗，洗去根部培養(yǎng)基，移栽到經(jīng)過(guò)高溫滅菌的由草炭:蛭石=1:1的混合成的基質(zhì)中，覆蓋保鮮膜保持一定濕度，I周后揭膜，移栽20天后統(tǒng)計(jì)成活率。
[0011]上述步驟(2)所述的萌發(fā)培養(yǎng)基為:1/21^+20?3(^/1蔗糖+3.5?6.(^/1瓊脂+50 ?100mL/L 椰子汁，pH 為 5.4 ?5.8。
[0012]上述步驟(3)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+0.5?2.0mg/L 2，4-D+1.0?3.0mg/LKT+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0013]上述步驟(4)所述的分化培養(yǎng)基為:MS+15?30g/L蔗糖+3.5?6.0g/L瓊脂，pH為 5.4 ?5.8。
[0014]上述步驟(4)所述的生根培養(yǎng)基為:l/2MS+0.1?1.0mg/L ΝΑΑ+0.1?1.0mg/LIBA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:球子蕨(sensibilis L )為球子蕨科球子蕨屬植物，中型的陸生蕨類。隨著蕨類植物逐漸受到人們的關(guān)注，市場(chǎng)需求量日益增加，在自然條件下蕨類植物主要通過(guò)孢子和根蓮進(jìn)行繁殖，存在繁殖系數(shù)低、周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，不利于球子蕨的市場(chǎng)化生產(chǎn)。目前，關(guān)于球子蕨的無(wú)菌繁殖技術(shù)尚未有相關(guān)報(bào)道，本發(fā)明以球子蕨孢子為外植體，經(jīng)過(guò)孢子萌發(fā)、愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽分化及生根等過(guò)程獲得了球子蕨離體再植株，建立球子蕨的無(wú)菌繁殖技術(shù)體系，以促進(jìn)球子蕨的規(guī)?；a(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0017]實(shí)施例1
(I)孢子消毒:將孢子置于1.5mL(或2mL)離心管中，蒸懼水浸泡2h,以4000r/min速度離心5min,去上清液。加入3%的次氯酸鈉溶液進(jìn)行消毒5min,再4000r/min速度離心6min,去上液,用無(wú)菌水沖洗4次,加無(wú)菌蒸懼水配制成濃度約為6000個(gè)/mL的孢子懸浮液備用。
[0018](2)孢子萌發(fā)培養(yǎng):取經(jīng)步驟(I)處理后的孢子懸浮液0.5mL接種于萌發(fā)培養(yǎng)基中進(jìn)行孢子萌發(fā)培養(yǎng)。接種后置于每天光照13小時(shí)，光照強(qiáng)度為25001x，置于培養(yǎng)溫度為23°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)20天后孢子萌發(fā)率為75.7%。所述的萌發(fā)培養(yǎng)基為:l/2MS+25g/L 蔗糖 +3.5g/L 瓊脂 +100mL/L 椰子汁，pH 為 5.5。
[0019](3)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng):將步驟(2)萌發(fā)培養(yǎng)得到的單個(gè)原葉體莖接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。接種后置于每天光照13小時(shí)，光照強(qiáng)度為20001χ，置于培養(yǎng)溫度為23°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)40天后愈傷組織誘導(dǎo)率為73.6%。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+0.8mg/L 2，4-D+l.5mg/L KT+25g/L 蔗糖 +3.8g/L 瓊脂，pH 為 5.4。
[0020](4)叢生芽誘導(dǎo)及增殖:將步驟(3)誘導(dǎo)出的愈傷組織切割成大小(3mmX 3mm) —致的團(tuán)塊并接種到分化培養(yǎng)基中進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)和增殖。接種后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為25001x，置于培養(yǎng)溫度為23°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)40天后叢生芽分化率為89.3%。所述的分化培養(yǎng)基為:MS+20g/L蔗糖+3.8g/L瓊脂，pH為5.4。
[0021](5)生根培養(yǎng):將步驟(