一種批量冷凍石斑魚(yú)精子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及魚(yú)類(lèi)繁殖與育種學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種批量快速保存石斑魚(yú)精子的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 魚(yú)類(lèi)精液超低溫保存在水產(chǎn)養(yǎng)殖、遺傳育種及種質(zhì)資源保存中具有很重要意義： 魚(yú)類(lèi)精液的超低溫冷凍保存，不僅可以實(shí)現(xiàn)種質(zhì)材料的長(zhǎng)距離運(yùn)輸，有利于不同區(qū)域魚(yú)類(lèi) 的雜交、選育、獲得優(yōu)良性狀及基因多樣性保護(hù)；還可以為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和實(shí)驗(yàn)生物學(xué)研宄長(zhǎng) 期穩(wěn)定地提供材料。魚(yú)類(lèi)精子低溫冷凍保存研宄開(kāi)始于20世紀(jì)50年代初期。英國(guó)學(xué)者 Blaxter使用干冰直接冷凍保存太平洋鯡魚(yú)（Clupea pallasi)精巢，獲得80%的受精率。 之后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者們對(duì)魚(yú)類(lèi)精子冷凍保存開(kāi)展了大量研宄。目前已建立200多種淡水魚(yú)類(lèi) 和40多種海水魚(yú)類(lèi)，包括花鱸、牙鲆、大菱鲆、大黃魚(yú)、真鯛、四大家魚(yú)、鯽魚(yú)、鯉魚(yú)、團(tuán)頭魴、 大口鲇、鱖、舞魚(yú)、石斑魚(yú)及虹鱒等重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)的精子超低溫保存方法。
[0003] 低溫生物學(xué)研宄表明，生物體的一切生化活動(dòng)，雖大多數(shù)由酶所催化而表現(xiàn)多種 特殊形式，但仍然服從于共同的生物學(xué)規(guī)律。其共同的規(guī)律是，酶的催化活性是受溫度影響 的，大多數(shù)酶都有其特定的最佳反應(yīng)溫度，但隨著溫度的降低，酶的活性逐漸下降，當(dāng)溫度 降到一定程度，各種酶都會(huì)失去活性，不能發(fā)揮催化作用，因此，生物體的所有生化活動(dòng)基 本停止，進(jìn)入一種低能耗、低新陳代謝的休眠狀態(tài)。
[0004] 精子低溫保存是一項(xiàng)需要控制非常精細(xì)的技術(shù)，處理?xiàng)l件應(yīng)用得當(dāng)時(shí)低溫可以長(zhǎng) 期保存精子；處理?xiàng)l件應(yīng)用不當(dāng)會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷精子，一般使用液氮低溫保存精子所產(chǎn)生的損 傷包括（1)滲透壓損傷、（2)冰晶損傷、（3)冷休克損傷、（4)抗冷凍劑毒性、（5)pH損傷、 (6)復(fù)溫過(guò)程的冷凍的逆過(guò)程。一般通過(guò)篩選合適的精子稀釋劑和抗凍劑來(lái)減少凍存對(duì)精 子的傷害，而精子的低溫冷凍步驟對(duì)于精子活性的保存也具有重要作用。采用合適的降溫 速率是減少滲透壓損傷和冰晶損傷的重要環(huán)節(jié)，是保證魚(yú)類(lèi)精子超低溫冷凍保存成功的關(guān) 鍵之一。由于在魚(yú)類(lèi)精子凍存的研宄報(bào)道中，基本上是采用實(shí)驗(yàn)室條件下的單管或少量多 管保存，少量保存實(shí)驗(yàn)可以利用精密的程序降溫設(shè)備快速摸索最佳凍存條件，然而這種少 量?jī)龃娉绦騾s較難在漁業(yè)生產(chǎn)中得到大規(guī)模的應(yīng)用。這是因?yàn)樵趩喂軛l件下，精子樣品本 身的散熱較少，可以準(zhǔn)確地遵循降溫程序達(dá)到預(yù)定的溫度條件。而在批量條件下，如果采用 單管凍存則非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力；如果采用多管同時(shí)凍存，由于樣品的散熱較大，除非采用大型的 程序降溫儀，否則通常不能達(dá)到預(yù)定的溫度條件，從而導(dǎo)致精子在降溫過(guò)程中損傷。魚(yú)類(lèi)人 工繁殖生產(chǎn)所需要的精子量較大，采用合適的包裝方式和降溫程序來(lái)批量保存精子才能滿 足產(chǎn)業(yè)規(guī)?；a(chǎn)的需要。
[0005] 石斑魚(yú)在我國(guó)海水增養(yǎng)殖業(yè)中的重要經(jīng)濟(jì)地位，目前雜交石斑魚(yú)是南方海水養(yǎng)殖 的重要發(fā)展方向，雜交石斑魚(yú)技術(shù)需要用到較大量的異源精子，采用批量精子保存技術(shù)才 能夠滿足石斑魚(yú)雜交生產(chǎn)的迫切需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供了一種快速批量保存石斑魚(yú)精子的方法，解決了現(xiàn)有石斑魚(yú) 精子超低溫保存方法效率較低、量小、操作復(fù)雜等問(wèn)題。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：提供一種批量冷凍石斑魚(yú)精子的方法， 包括以下步驟：
[0008] 1)精子取材
[0009] 在石斑魚(yú)進(jìn)入繁殖盛期的第1、2周內(nèi)選擇健康成熟石斑魚(yú)雄魚(yú)進(jìn)行采精，采精前 擦干魚(yú)體并排除尿液和糞便，將乳白色濃度適中且精子活力旺盛的精樣置于50ml EP管中 密封、閉光、冰浴保存；顯微鏡鏡檢激活觀察，室溫下80%精子在5min內(nèi)保持運(yùn)動(dòng)狀態(tài)為合 格樣品；
[0010] 2)精子的稀釋
[0011] 選取步驟1)的合格精子，采用常規(guī)Ts-2為精子稀釋液，DMSO為抗凍劑，按照精子： 稀釋液：DMSO = 4. 5:4. 5:1的體積比例均勻混合精子和試劑；
[0012] 3)樣品的分裝
[0013] 將混合好的精子樣品分裝到2. 5ml體積的凍存管中，每管Iml精子樣品；將已分裝 的凍存管裝入樣品保存盒中，凍存管放置的位置為單數(shù)標(biāo)號(hào)位置，一個(gè)樣品盒放置13管精 子樣品；
[0014] 4)樣品盒的安放
[0015] 將裝盒的精子樣品置于冰浴平衡30min ;將樣品盒放入樣品架從下往上的第1層、 3層、5層，樣品相鄰層之間的垂直間距為6cm ;
[0016] 5)降溫操作
[0017] 將樣品架第1層置于液氮面上方6cm處lOmin，然后將第1層降到液氮面放置 5min，然后將第1層浸入液氮中；此時(shí)正好保持第3層距離液氮面6cm放置5min，然后將第 3層降到液氮面放置5min，再將第3層完全浸入液氮中；此時(shí)第5層剛好距離液氮面6cm放 置5min，然后將第5層降到液氮面放置5min，最后將第5層完全浸入液氮中；
[0018] 6)復(fù)溫操作
[0019] 將樣品架整個(gè)取出，迅速將樣品盒置于42°C水浴中，并充分在水浴中搖晃解凍，鏡 檢活力后使用。
[0020] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0021] 1)本發(fā)明保存石斑魚(yú)精子的效率較高，采用分隔放置凍存管的方法有效避免相鄰 樣品管降溫過(guò)程中散熱對(duì)精子的損傷，大大提高多管凍存精子復(fù)溫后的活力。
[0022] 2)本發(fā)明采用液氮樣品架保存精子，相鄰層樣品垂直間距6cm，此設(shè)計(jì)一方面保 證每層精子樣品都能按照三步法程序降溫，一方面相鄰層的樣品受前一層樣品液氮沸騰的 影響大大降低。
[0023] 3)本發(fā)明可以節(jié)約冷凍操作的時(shí)間，使用本發(fā)明方法35min即可完成39ml精子的 超低溫冷凍操作，減少了人工操作的工作量。本方法單個(gè)液氮罐可凍存234ml的精子，可滿 足20kg受精卵生產(chǎn)的需要，大大減少了精子凍存操作時(shí)間、儲(chǔ)存和運(yùn)輸成本。
[0024] 4)本發(fā)明方法在于保證受精率的同時(shí)提供了保存工作的效率、提高單液氮罐保存 量。一次繁殖通常要生產(chǎn)幾十公斤的受精卵，用常規(guī)方法的話起碼要攜帶5-6個(gè)大液氮罐， 而且受精率低，用本發(fā)明方法1個(gè)液氮罐就可以滿足一個(gè)繁殖周期的量。