一種間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存液及凍存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細(xì)胞領(lǐng)域，具體涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存液及凍存方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞（stem cell)是一類(lèi)具有自我復(fù)制能力（self-renewing)的多潛能細(xì)胞。 在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells， MSC)是干細(xì)胞家族的重要成員，來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。MSC具有干細(xì)胞的共 性，即自我更新、多向分化和歸巢的能力。在特定的機(jī)體外分化環(huán)境下，能夠誘導(dǎo)分化為神 經(jīng)、心臟、骨、軟骨、脂肪、上皮等多種組織細(xì)胞，被認(rèn)為是細(xì)胞治療技術(shù)的最有希望的來(lái)源 細(xì)胞之一，是近幾年研宄的熱點(diǎn)。MSC作為重要的再生醫(yī)學(xué)資源，在臨床的疾病治療領(lǐng)域?qū)?有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 間充質(zhì)干細(xì)胞在體外經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng)和凍存復(fù)蘇后仍具有多向分化潛能，可作 為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。因此，研宄一種有效的細(xì)胞 凍存方法，使具有臨床應(yīng)用價(jià)值的MSC能在體外長(zhǎng)期保存并維持原有的多向分化能力，顯 得尤為重要。
[0004] MSC的凍存需要將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞收集起來(lái)，用含有特定成分的細(xì)胞凍存 液制成單細(xì)胞懸液，分裝于凍存管中后置于超低溫冰箱或者液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期凍存。
[0005] 目前現(xiàn)有技術(shù)中，細(xì)胞凍存液中的主要成分有10%二甲基亞砜（DMS0)、20%~ 90%胎牛血清（FBS)、剩余組分為不完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)基以及FBS可為細(xì)胞提供必要的營(yíng) 養(yǎng)物質(zhì)。DMSO是一種滲透性保護(hù)劑，能夠降低細(xì)胞冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，從而達(dá)到降低細(xì) 胞損傷的保護(hù)效果。但FBS屬于動(dòng)物源性物質(zhì)，成分比較復(fù)雜，在臨床應(yīng)用上存在潛在的風(fēng) 險(xiǎn)，也增加了污染的幾率。而高濃度DMSO在常溫狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞具有非常大的毒性作用。
[0006] 細(xì)胞凍存的方法在現(xiàn)有技術(shù)中采用最多的是利用凍存盒置于超低溫冰箱中放置 24~72h，再轉(zhuǎn)移至液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期的保存。但凍存盒在逐漸降溫的過(guò)程中無(wú)法精確控制 降溫速率，會(huì)導(dǎo)致凍存液中形成較多的冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞受到較大的損傷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞的 凍存液及凍存方法。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] -種間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存液包括無(wú)血清培養(yǎng)基、DMSO、右旋糖酐-40,其中所述 DMSO的濃度為3v/v%~7v/v%，按g/mL計(jì)右旋糖酐-40的濃度為lw/v%~3w/v%。
[0010] 本發(fā)明所述間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存液中含有非滲透性抗凍劑右旋糖酐40,降低了 DMSO的濃度。右旋糖酐40能溶于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞，使溶液呈過(guò)冷狀態(tài)，通過(guò)降低溶質(zhì)損 傷從而起到保護(hù)作用。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，所述的凍存液中所述DMSO的濃度為5v/v%，按g/mL計(jì)右旋糖 酐-40的濃度為lw/v%。
[0012] 在一些實(shí)施方案中，所述的凍存液中所述無(wú)血清培養(yǎng)基為IonzaUltra⑶LTURE MEDIUM無(wú)血清培養(yǎng)基。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存方法，取間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞懸液離心收 集細(xì)胞，用本發(fā)明所述間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存液重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度，分裝于凍存管中 凍存。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，所述的凍存方法中，所述細(xì)胞密度為IX 106/mL。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，所述的凍存方法中，所述凍存的具體方法為< -80°C凍存。
[0016] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的凍存方法中，所述< -80°C凍存為-80°C超低溫冰 箱長(zhǎng)期凍存或液氮中長(zhǎng)期凍存。
[0017] 在另一些實(shí)施方案中，所述的凍存方法中，所述凍存的具體方法為程序降溫儀逐 漸降溫至-90 °C后轉(zhuǎn)移至液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。程序降溫儀能夠更精確地控制降溫速率，避 免冰晶的產(chǎn)生，降低細(xì)胞的損傷。
[0018] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的凍存方法中，所述程序降溫儀降溫程序?yàn)椋?br>[0019] 4°〇，維持51^11;
[0020] _1°C/min直至 _4°C;
[0021] -25°C/min直至-12°C ;
[0022] -1°C/min 直至-40°C ;
[0023] -10°C/min直至-90°C;
[0024] -9(TC，維持 5min。
[0025] 本發(fā)明所述間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存方法方法，適用于所有類(lèi)型MSC的凍存方法，所 述間充質(zhì)干細(xì)胞可以為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤(pán)間 充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞或外周血間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0026] 在一些實(shí)施方案中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法具體為組織塊剪碎，加入 完全培養(yǎng)基，于37°C，5% 0)2靜止培養(yǎng)，期間補(bǔ)加完全培養(yǎng)基，待組織塊有細(xì)胞爬出后去掉 組織塊，清洗后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80 %~90 %后，去掉細(xì)胞培 養(yǎng)上清，清洗后加入含EDTA的胰蛋白酶消化液消化，完全培養(yǎng)基終止消化，細(xì)胞吹打成單 細(xì)胞懸液。
[0027] 其中，在一些實(shí)施方案中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中所述完全培養(yǎng)基 的組成成分為：Lonza通用UltraCULTURE無(wú)血清培養(yǎng)基+5v/v % PALL血清替代物+2mM/ L-谷氨酰胺 +100mg/L NEAA。
[0028] 在一些實(shí)施方案中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中所述含EDTA的胰蛋白 酶消化液中胰蛋白酶濃度為0. 25% (體積分?jǐn)?shù)），EDTA濃度為0. 04% (體積分?jǐn)?shù)）。
[0029] 在一些實(shí)施方案中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中所述原代分離培養(yǎng)方法 中消化液消化的時(shí)間為l_2min。
[0030] 在一些實(shí)施方案中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中所述間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源 與臍帶組織。所述臍帶可以取自產(chǎn)后棄置的臍帶組織，采用含有雙抗的PBS保存。所述含 有雙抗的PBS為含青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖液，其中青霉素工作濃度為100U/mL，鏈霉 素工作濃度為0. lmg/mL。
[0031] 本發(fā)明所述間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中，在組