一種荷花再生體系的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種荷花再生體系的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 荷花（Nelumbo nucifera Gaertn.)為蓮科蓮屬多年生水生花丼，是中國十大傳 統(tǒng)名花之一，具有很高的觀賞價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和獨(dú)特的文化內(nèi)涵，深受人們喜愛。
[0003] 2013年5月，荷花的全基因組序列公布，將荷花的轉(zhuǎn)基因研宄提上了工作日程。而 作為轉(zhuǎn)基因重要技術(shù)基礎(chǔ)的荷花的遺傳轉(zhuǎn)化再生體系尚不成熟，嚴(yán)重制約了荷花轉(zhuǎn)基因工 作的開展。目前報(bào)道的荷花再生的途徑有兩種，一種途徑是由莖尖直接分化形成叢生苗，然 后進(jìn)行增殖，最后誘導(dǎo)生根獲得完整植株（于文進(jìn)，1997 ;彭靜，2001 ;湯泳萍，2001 ;劉玫， 2002)，但尚未見該再生途徑轉(zhuǎn)基因方面的報(bào)道。另一種途徑是用荷花成熟胚培養(yǎng)出無菌 苗，再用無菌苗的莖尖作為外植體誘導(dǎo)出愈傷，然后對愈傷組織誘導(dǎo)不定芽分化，最后生根 成苗。
[0004] 關(guān)于用荷花成熟胚進(jìn)行無菌苗培養(yǎng)時(shí)取蓮胚的方法以及消毒的方法，郭娜娜等人 (2013)使用濃硫酸腐蝕蓮子種皮，用小刀破殼后直接用酒精和氯化汞消毒，由于硫酸滲透 對外植體造成傷害，成活率最高僅86. 63%?？椎抡热耍?007)研宄發(fā)現(xiàn)，對用濃硫酸腐 蝕蓮子殼獲得的種胚進(jìn)行直接滅菌時(shí)間太短則污染率高，時(shí)間延長則致死率高。本發(fā)明通 過實(shí)驗(yàn)總結(jié)出了用帶殼蓮子消毒，再破殼取成熟蓮胚進(jìn)行培養(yǎng)的方法，操作簡單，死亡率極 低，大大降低了污染率（除內(nèi)生菌外鮮有污染），褐化率極低，成活率高達(dá)98%以上。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種荷花再生體系的高效構(gòu)建方法，為中國荷花的轉(zhuǎn)基因技 術(shù)提供重要的技術(shù)基礎(chǔ)。
[0006] 本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 一種荷花再生體系的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0008] (1)滅菌：選取'廣昌白蓮'的圓形飽滿的帶殼蓮子用75%的酒精和3%次氯酸鈉 消毒滅菌備用；
[0009] (2)無菌苗的培養(yǎng)：將蓮子較圓的一端用無菌修枝剪橫剪一下使蓮心（胚）露出， 然后用鑷子取出蓮心作為外植體接種于無菌苗培養(yǎng)基中，每天光照時(shí)間為14-16小時(shí)，光 照強(qiáng)度控制在1500-2500LX，溫度控制在25-28°C ;
[0010] (3)愈傷組織誘導(dǎo)：從無菌苗上切取2-3mm的莖尖或帶有Imm的葉柄未展開的整 片幼嫩葉片作為外植體，接種到愈傷培養(yǎng)基上培養(yǎng)，接種時(shí)使切口處完全與培養(yǎng)基相接，每 個(gè)培養(yǎng)基接種5-6個(gè)，在黑暗條件下培養(yǎng)，每30天更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)2個(gè)月后獲得愈傷 組織；
[0011] (4)不定芽分化誘導(dǎo)與增殖：將葉片和莖尖的愈傷組織接到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基 上，每天光照時(shí)間為14小時(shí)，光照強(qiáng)度1500_2500Lx，一個(gè)月后分化苗長至Icm時(shí)切去下面 死去的黑色愈傷，并將分化苗轉(zhuǎn)移至增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)三個(gè)月，每30天更換新鮮培養(yǎng)基；
[0012] (5)分化苗的生根：將分化苗從增殖培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基內(nèi)，每天光照時(shí)間 為14小時(shí)，光照強(qiáng)度1500-2500LX，一個(gè)月后待小苗長出根后取出小苗進(jìn)行組培苗的煉苗 馴化；
[0013] (6)組培苗的煉苗馴化與移栽：將生了根的小苗洗凈后，用0. 8-lg/L代森錳鋅浸 泡半小時(shí)，栽至裝有滅菌淤泥的塑料盆中，遮陰并覆蓋薄膜保濕，4天后晝覆夜敞，15天后 完全除掉薄膜；其中，使用的培養(yǎng)基配方如下：
[0014] 無菌苗培養(yǎng)基：MS+6-BA lmg/L+NAA 0· 5mg/L+ 鹿糖 30g/L,瓊脂 8g/L, pH = 5. 8，
[0015] 愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+TDZ 0· 1-0. 2mg/L+NAA 0· 7-0. 8mg/L+ 蔗糖 50g/L，瓊脂 8g/ L，pH = 5· 6,不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+6-BA 50 μ M+ 蔗糖 30g/L，瓊脂 8g/L，pH = 5· 6，
[0016] 增殖培養(yǎng)基：MS+6-BA lmg/L+NAA 0· 5mg/L+ 蔗糖 30g/L，瓊脂 8g/L，pH = 5· 6，
[0017] 生根培養(yǎng)基：MS+IBA l-2mg/L+ 蔗糖 30g/L，瓊脂 8g/L，pH = 5· 6。
[0018] 步驟（I)滅菌的具體方法優(yōu)選：選取"廣昌白蓮"的圓形飽滿的種子用75%的酒精 消毒30s，用無菌水沖洗1次，3%次氯酸鈉浸泡8min，再用無菌水沖洗3次，備用。
[0019] 步驟（2)中每天光照時(shí)間優(yōu)選14h，光照強(qiáng)度1500-2500LX，控溫優(yōu)選25°C。
[0020] 步驟(6)中代森錳鋅濃度優(yōu)選lg/L。
[0021] 步驟⑷中所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選：MS+6-BA 50 μΜ+蔗糖30g/L，瓊脂8g/ L, pH = 5. 6〇
[0022] 本發(fā)明的有益效果：
[0023] 1、本發(fā)明采用先用成熟蓮胚培養(yǎng)出無菌苗，再切取無菌苗的莖尖、葉片或葉柄，成 功誘導(dǎo)出愈傷組織，并誘導(dǎo)分化成苗最后獲得生根苗的方法，成功建立了完整的荷花再生 體系，為中國荷花的轉(zhuǎn)基因研宄提供了新的途徑和重要載體。
[0024] 2、本發(fā)明采取先對帶殼蓮子消毒，然后用滅菌修枝剪對蓮子破殼，取出成熟的蓮 心（胚）作為外植體培養(yǎng)無菌苗，克服了前人報(bào)道的用硫酸腐蝕蓮子獲取蓮胚以及直接對 取出的蓮胚消毒易殺死蓮胚的缺陷，方法操作簡單，死亡率極低，污染率低（除內(nèi)生菌外鮮 有污染），褐化率極低，成活率高（98 %以上）。
[0025] 3、本發(fā)明通過對愈傷培養(yǎng)基中外植體個(gè)數(shù)的調(diào)節(jié)，大幅提高了愈傷的誘導(dǎo)率，使 愈傷率最高達(dá)60%。
[0026] 4、本發(fā)明通過對增殖培養(yǎng)基中激素含量的調(diào)節(jié)，提高了不定芽的繁殖系數(shù)，使分 化率達(dá)到65%。
[0027] 5、本發(fā)明突破性地用荷花無菌苗幼嫩的葉片、葉柄為外植體成功誘導(dǎo)出愈傷，并 將帶葉柄的葉片產(chǎn)生的愈傷組織誘導(dǎo)分化成苗，為荷花愈傷組織的誘導(dǎo)拓寬了外植體的選 擇范圍，且材料的來源更有保障。
【附圖說明】
[0028] 圖1荷花無菌苗不同外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織的褐化情況
【具體實(shí)施方式】
[0029] 通過以下實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 一種荷花再生體系的構(gòu)建方法，按以下步驟進(jìn)行：
[0032] (一）培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和各階段培養(yǎng)基的組分及其每升所含的重 量為：
[0033] 1)基本培養(yǎng)基：MS ;
[0034] 2)無菌苗培養(yǎng)基：MS+6-BA lmg/L+NAA 0· 5mg/L+鹿糖 30g/L,瓊脂 8g/L, pH = 5. 8 ；
[0035] 3)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+TDZ 0· 1-0. 2mg/L+NAA 0· 7-0. 8mg/L+ 蔗糖 50g/L,瓊脂 8g/L, pH = 5. 6,
[0036] 4)不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+6-BA 50