一種北冬蟲夏草的規(guī)?；嘤椒?br>【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于真菌培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種北冬蟲夏草的規(guī)模化培育方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 北冬蟲夏草，也叫蛹蟲草或踴蟲草、蛹草，是一種久負(fù)盛名的食、藥用真菌，含有蟲 草酸（D~甘露醇）、蟲草素（3'~脫氧腺苷）、蟲草多糖和超氧化物歧化酶（SOD)等特殊物 質(zhì)，據(jù)《本草綱目拾遺》稱北冬蟲夏草能治百虛百損，有補(bǔ)肺益腎之功效。北冬蟲夏草除對 多種疾病具有顯著療效外，還有優(yōu)良的滋補(bǔ)作用，并有抗菌、抗病毒、抗癌、抗疲勞、抗衰老 等特殊功效，已越來越受到國內(nèi)外研宄者的重視和消費(fèi)者的青睞。在我國已有的70多個(gè)蟲 草品種中，研宄最為深入的是北冬蟲夏草。
[0003] 蛹蟲草中富含蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖和SOD酶等多種生物活性物質(zhì)。蟲草酸 (甘露醇）有軟化血管，改善微循環(huán)，具有降血脂、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘的作用。可以顯著地降 低顱壓，促進(jìn)機(jī)體新陳代謝，因而使腦溢血和腦血栓病癥得到緩解。蟲草酸是一種具有抗菌 活性的核苷類物質(zhì)：對核多聚腺苦酸聚合酶有很強(qiáng)的抑制作用。在DNA轉(zhuǎn)錄mRNA過程中使 mRNA成熟障礙，抑制癌細(xì)胞的生長。蟲草素是一種抗菌、抗癌的活性物質(zhì)，具有抗生和抑制 細(xì)胞分裂的作用。對人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用。蟲草多糖是一種高度分枝 的半乳甘露聚糖，它能促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高血清IgG的抗體含量和機(jī)體的免疫功能，增 強(qiáng)機(jī)體自身抗癌抑癌的能力，為免疫調(diào)節(jié)劑。
[0004] SOD酶（超氧化物歧化酶）可以消除機(jī)體內(nèi)超氧自由基，具有抗衰老、抗癌抑癌的 作用。
[0005] 冬蟲夏草是一種傳統(tǒng)的名貴滋補(bǔ)中藥材，有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能，和抗腫瘤、抗疲勞 等多種功能。由于野生冬蟲夏草分布地區(qū)狹窄、自然寄生率低、對生活環(huán)境條件要求苛刻， 所以本身資源比較有限。近年來又由于冬蟲夏草主產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境遭到人為嚴(yán)重破壞，大量 盲目不合理采挖致使資源日趨減少，產(chǎn)量逐年下降。冬蟲夏草可以藥食兩用，人們不斷發(fā)現(xiàn) 其新的藥理作用，所以人們對它的需要倍增，價(jià)格逐年上漲。目前市場上一等冬蟲夏草每 公斤高達(dá)30萬元左右，許多人望而卻步。北冬蟲夏草雖然藥效只有冬蟲夏草十分之一，但 每公斤價(jià)格只有冬蟲夏草百分之一是冬蟲夏草最理想的代替品。為了滿足市場的需求，目 前許多地區(qū)如吉林、遼寧、山東、江蘇、河南等省都相繼開展了對北冬蟲夏草的研宄、栽培工 作，但都達(dá)不到規(guī)?；耘嗉夹g(shù)要求。發(fā)明的目的是提供一整套規(guī)?；a(chǎn)北冬蟲夏草的 培育方法，具有成本低、僵化率高、出草齊、生產(chǎn)周期短的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對目前人工栽培北冬蟲夏草存在的生產(chǎn)技術(shù)缺陷，提供了一整套規(guī)?；?生產(chǎn)北冬蟲夏草先進(jìn)的、科學(xué)的栽培北冬蟲夏草技術(shù)和方法，通過人工采集野生北冬蟲夏 草，通過分離、提純、接種、培養(yǎng)等，培育獲得北冬蟲夏草新個(gè)體。
[0007] 本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] -種北冬蟲夏草的規(guī)模化培育方法，包括以下步驟：
[0009] 步驟1北冬蟲夏草一級、二級母種斜面培養(yǎng)
[0010] 步驟I. 1配置培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為：土豆200g、瓊脂20g、柞蠶蛹100g、葡萄糖 20g、蛋白胨8g、磷酸二氫鉀I. 5g、硫酸鎂0. 75g，1000毫升水；
[0011] 步驟1. 2采集野生北冬蟲夏草用質(zhì)量濃度0. 1 %的汞溶液消毒，無菌水清洗，取其 內(nèi)部組織1立方毫米的小塊移接至培養(yǎng)基斜面，放入20°C的恒溫箱中培養(yǎng)15天即得北冬蟲 夏草一級母種斜面；
[0012] 步驟1. 3選擇僵化率高、出草整齊的一級母種斜面試管再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得二級 母種斜面。
[0013] 步驟2北冬蟲夏草液體菌種的制作與培養(yǎng)
[0014] 步驟2. 1配置培養(yǎng)基，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)培養(yǎng)基配方為：活柞蠶蛹10%、葡萄糖1%、蛋白 胨1%、速溶奶粉1%、磷酸二氫鉀0. 15%，硫酸鎂0. 075g，1000ml水，1只雞蛋清；
[0015] 步驟2. 2接種二級母種，在21°C恒溫箱內(nèi)靜止培養(yǎng)24h后，用150r/min往復(fù)式搖 床進(jìn)行振蕩培養(yǎng)96h后，選取合格菌種。
[0016] 步驟3注射接種
[0017]選取蠶蛹在發(fā)酵終了前Id進(jìn)行注射接種，注入菌種0. 08~0. 15ml，送發(fā)菌室內(nèi)發(fā) 菌。
[0018] 步驟4菌絲培養(yǎng)
[0019] 步驟4. 1低溫避光環(huán)境下培養(yǎng)，溫度前3d控制為16°C，3d~8d控制為18°C，濕度 60%以上；
[0020] 步驟4. 2將僵化好的蠶蛹21~22°C避光條件下培養(yǎng)，促使菌絲后熟，轉(zhuǎn)向生殖生 長階段。
[0021] 步驟5誘導(dǎo)原基形成與出草管理
[0022] 步驟5. 1將生殖生長階段的僵蛹的三分之一處劃刀口，劃口后的僵蛹不立即見 光，在溫度21~22°C，濕度80%以上的暗室培養(yǎng)中3天，待僵蛹的環(huán)節(jié)及劃口處長出白色 菌絲，再裝瓶見光出草；
[0023] 步驟5. 2將菌絲營養(yǎng)生長結(jié)束的蠶蛹，用2g/L臭氧水蛹體表面消毒lOmin，控凈表 面自由水后在無菌室上瓶，送到出草室培養(yǎng)出草；
[0024]步驟5. 3待原基形成后溫度控制在19~22°C，蛹蟲草長到Icm高時(shí)，將室內(nèi)的相 對濕度調(diào)高至75 %~80 %，經(jīng)過15~17d，蛹蟲草生長高度接近瓶口即可采收；
[0025] 本發(fā)明步驟I. 1所述的培養(yǎng)基通過以下方法制備：將土豆塊和柞蠶蛹加水煮沸至 土豆軟而不爛時(shí)，濾去土豆殘?jiān)?，在汁液中加入剩余組分并攪拌均勻，加熱至瓊脂完全溶化 后分裝試管，培養(yǎng)基的量與試管的體積比是1 : 5,高壓鍋滅菌，加熱到壓力達(dá)到0.5Kg/m2 時(shí)，排出冷空氣，然后繼續(xù)加熱至125°C時(shí)保壓35分鐘后停止加熱降溫，排氣，并趁熱把試 管擺成斜面，得固體試管斜面?zhèn)溆谩?br>[0026] 本發(fā)明所述的二級母種斜面的培養(yǎng)基與一級母種斜面的培養(yǎng)基相同。
[0027]本發(fā)明步驟2. 1所述的培養(yǎng)基通過以下方法制備：將活蠶蛹手撕開放入1000 ml 冷水中，沸煮25min，收集濾液，開水定溶1000ml，依次加入硫酸鎂、磷酸二氫鉀、蛋白 胨和奶粉，充分溶解后，冷卻至30°C，加入泡沫雞蛋清，充分?jǐn)嚢杈鶆?，高壓滅菌器，?0. 137Mpal25°C條件下滅菌20min，濾出澄清液，加入葡萄糖攪拌溶解后滅菌。
[0028] 本發(fā)明步驟2. 2所述的合格菌種標(biāo)準(zhǔn)為：菌液澄清不混濁，菌球多，形狀一致，發(fā) 育齊一，晃動后浮起的菌球5min不下沉，經(jīng)顯微鏡檢查，無和蟲草菌絲不一樣的微生物。
[0029] 步驟3所述的發(fā)菌室在使用前3d用3%甲醛進(jìn)行消毒，室外過道用1%消特靈水 洗刷封閉地面，發(fā)菌室的門窗用黑紅布窗簾遮擋。
[0030] 本發(fā)明所述的生殖生長的標(biāo)志為：菌齡達(dá)15~17d;蛹體和環(huán)節(jié)間膜處長出白色 菌絲；蛹頂由白色變成淡褐色。
[0031] 本發(fā)明的有益效果為：解決了現(xiàn)有人工栽培北冬蟲夏草出現(xiàn)僵化率低、出草低、不 齊等的技術(shù)問題，本發(fā)明方法具有成本低、僵化率高、出草齊、生產(chǎn)周期短的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)，便 于大規(guī)模推廣使用，彌補(bǔ)了冬蟲夏草由于資源有限、昂貴而出現(xiàn)的市場空白，具有實(shí)際的經(jīng) 濟(jì)和社會效益。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實(shí)施 例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以下實(shí)施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 通過人工采集野生北冬蟲夏草，通過分離、提純、接種、培養(yǎng)等，培育獲得北冬蟲夏 草新個(gè)體。
[0035] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明北冬蟲夏草的培育方法，具體操作步驟如下：
[0036] -、北冬蟲夏草一級、二級母種斜面培養(yǎng)與選擇
[0037] 1?培養(yǎng)基配方：
[0038] 配制1000毫升水需要的材料；
[0039] 土豆200g、瓊脂20g、柞蠶蛹100g、葡萄糖20g、蛋白胨8g、磷酸二氫鉀I. 5g、硫酸 鎂 0. 75g。
[0040] 2?配制方法：
[0041] 將洗凈去皮的土豆切成骰子塊和洗凈的柞蠶蛹撕開加水1000 ml煮沸30分鐘，至 土豆軟而不爛時(shí)，用4層紗布濾去土豆殘?jiān)≈河阱佒屑尤氕傊?0g、蛋白胨8g、葡萄糖 20g、磷酸二氫鉀I. 5g、硫酸鎂0. 75g并攪拌均勻，繼續(xù)加熱至瓊脂完全溶化，趁熱迅速分裝 試管，每個(gè)試管裝培養(yǎng)基的量與試管的體積比是1 : 5,裝完后塞上棉塞，然后把試管每5支 或7支扎成一捆，用牛皮紙包好放入高壓鍋滅菌，加熱到壓力達(dá)到0. 5Kg/m2時(shí)，開排氣閥， 排出冷空氣，使指針回到0點(diǎn)，然后關(guān)上排氣閥繼續(xù)加熱至125°C時(shí)保壓35分鐘后停止加熱 降溫，使指針回到〇點(diǎn)時(shí)再打開排氣閥放氣，5分鐘后打開高壓鍋滅菌鍋，并趁熱把試管擺 成斜面，冷卻后得固體試管斜面?zhèn)溆茫?br>[0042] 3.菌種分離培養(yǎng)：
[0043] 將采集到野生北冬蟲夏草清洗后用0. 1 %升汞溶液對其進(jìn)行消毒3分鐘處理，再 用無菌水清除其表面的升汞。北冬蟲夏草表面消毒處理后，用無菌刀片切去其子座的外層， 用接種刀切取其內(nèi)部組織1立方毫米的小塊迅速移接到試管斜面上，并迅速塞上棉塞，然 后放入20°C的恒溫箱中培養(yǎng)15天左右即得北冬蟲夏草一級母種斜面。
[0044] 4?見光選擇能出蟲草菌種
[0045] 將做好的北冬蟲夏草一級母種斜面，在散射光下短時(shí)間感光，選留全管變黃快且 色深的試管菌株直接進(jìn)行小區(qū)僵化出草試驗(yàn)，再選留試管菌株部分變黃快、變黃深的分離 純化，再進(jìn)行見光選擇，并做小區(qū)僵化出草試驗(yàn)。
[0046] 5.北冬蟲夏草二級母種斜面的擴(kuò)大培養(yǎng)：
[0047] 將小區(qū)僵化率高、出草齊一的一級母種斜面試管再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得二級母種斜 面試管，二級母種斜面試管的培養(yǎng)基與一級母種斜面試管的培養(yǎng)基相同。
[0048] 二、北冬蟲夏草液體菌種的制作與培養(yǎng)
[0049] 1 ?培養(yǎng)基配方：
[0050] 活柞蠶蛹10%、葡萄糖1%、蛋白胨1%、速溶奶粉1%、磷酸二氫鉀0. 15%、硫酸鎂 0. 075g、每1000 ml水放1只雞蛋的清。
[0051] 2?培養(yǎng)基制作：
[0052] 取活蠶蛹100g，把每個(gè)蠶蛹用手撕開，放入1000 ml冷水中，煮沸后微沸保持 25min，用4層紗布過濾，棄去蛹澄留下濾液，用開水定溶1000ml。依次加入硫酸鎂0. 75g， 磷酸二氫鉀I. 5g，蛋白胨10g，奶粉10g，充分溶解。然后除沉：作好的液體培養(yǎng)基放在一旁 冷卻，打一個(gè)雞蛋清于燒杯中，用筷子攪成泡沫，當(dāng)培養(yǎng)基冷卻到30°C左右時(shí)，把雞蛋清倒 入培養(yǎng)液中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，裝入2000ml三角瓶中，塞棉塞，加牛皮紙?jiān)o瓶口，放入高壓 滅菌器，用0. 137Mpa125°C保持20min。打開滅菌器用雙層紗布將澄清液濾出，放入葡萄糖 IOg攪拌溶解。
[0053] 裝瓶