一種浙江金線蘭種子組織培養(yǎng)與快速育苗方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種浙江金線蘭種子組織培養(yǎng)與快速育苗方法，屬于植物組織培養(yǎng)快 速繁殖技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 浙江金線蘭AnoectochiluszhejiangensisZ.Wei&Y.B.Chang又稱浙江開唇蘭， 是我國珍稀瀕危的蘭科植物之一，已列入國家二級保護(hù)植物名錄，浙江省珍稀瀕危植物名 錄。野生分布于浙江、福建、廣西等地，生于海拔700-1200米的山坡或溝谷的密林下陰濕 處。為我國傳統(tǒng)名貴草藥，民間應(yīng)用廣泛。
[0003] 由于浙江金線蘭為蘭科開唇蘭屬植物，種胚發(fā)育不完全，自然條件下種子發(fā)芽率 極低，資源再生緩慢。隨著人為肆意采挖、生態(tài)環(huán)境的破壞，野生浙江金線蘭資源已瀕臨滅 絕，此外，蘭科植物種子結(jié)構(gòu)簡單，幾乎沒有貯藏營養(yǎng)物質(zhì)，而且種子也未發(fā)現(xiàn)有貯藏營養(yǎng) 物質(zhì)的組織，在自然條件下很難萌發(fā)，并且幼苗生長緩慢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種浙江金線蘭種子組織培養(yǎng)與快速育苗方法，以解決現(xiàn) 有生產(chǎn)中存在的上述問題，本發(fā)明所提供的方法操作簡便，能獲得大量的性狀優(yōu)良的植株， 可供遺傳利用及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，其投入少，成苗速度快，種苗壯，生產(chǎn)周期短，僅6-7個(gè)月，不 僅能夠有效地保護(hù)野生浙江金線蘭資源，同時(shí)還能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)種苗需要的連續(xù)性生 產(chǎn)流程。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種浙江金線蘭種子組織培養(yǎng)與快速育苗方法，其特征在于：所述的方法包括以 下依序進(jìn)彳丁的步驟：
[0007] (1)果實(shí)的選擇：于浙江金線蘭開花期，選擇優(yōu)良的浙江金線蘭株系進(jìn)行人工同 株或異株授粉，授粉70-80天后，選擇發(fā)育基本成熟、且外表顏色接近黃色或黃褐色的果實(shí) 用于組織培養(yǎng)；或者野外采集的野生浙江金線蘭植株上的蒴果，選擇果實(shí)外表顏色近黃色 或黃褐色、且未開裂者用于組織培養(yǎng)；
[0008] (2)無菌播種與萌發(fā)培養(yǎng)：將步驟⑴中選取的果實(shí)用質(zhì)量百分比濃度為70-85% 的酒精浸泡30-45秒后，置于質(zhì)量百分比濃度為0. 08-0. 15%升汞溶液中消毒8-15分鐘， 用無菌水沖洗干凈后（一般沖洗3-5次即可），切開果實(shí)，取出白色粉狀或漿狀種胚接種到 種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，所述種子萌發(fā)培養(yǎng)基由以下組分按照以下配比組成：MS或N6基本培養(yǎng) 基+80-200g/L土豆泥+50-200ml/L椰子水+20-30g/L白糖或蔗糖+5. 0-8.Og/L瓊脂或卡 拉膠，PH值為5. 4-5. 8 ;接種后的培養(yǎng)瓶置于溫度20-28°C、無光照條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)種胚萌 發(fā)；
[0009] 種胚萌發(fā)培養(yǎng)28-32天后種胚膨大萌發(fā)形成白色、乳黃色的原球莖，50-60天后形 成具有帶葉和莖的小芽或者具有葉、莖及胚根的無菌苗；
[0010] (3)無菌實(shí)生苗的健壯培養(yǎng)：將步驟（2)獲得的帶葉和莖的小芽或者具有葉、莖及 胚根的無菌苗轉(zhuǎn)入光照條件下進(jìn)行10-20天的健壯培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照度2000-25001X， 光照8-10小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度22±2°C;
[0011] 健壯培養(yǎng)后，實(shí)生苗的莖和葉的顏色由淺綠色、黃色轉(zhuǎn)成綠色，莖節(jié)挺拔、葉片伸 展，植株健壯，大大降低了玻璃化，利于進(jìn)行叢生芽增殖。
[0012] (4)叢生芽增殖培養(yǎng)：在無菌條件下，先將步驟（3)中獲得的健壯的實(shí)生苗切割 成帶至少一個(gè)莖節(jié)的莖段或頂芽（所述莖段長度優(yōu)選為0. 5-1. 6cm)，插入增殖培養(yǎng)基中 誘導(dǎo)培養(yǎng)生成叢生芽；再將誘導(dǎo)培養(yǎng)生成的叢生芽分切成帶至少一個(gè)莖節(jié)的頂芽或莖段， 插入新的增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行至少一次繼代增殖培養(yǎng)，每次繼代增殖的培養(yǎng)周期為70-90 天，每次繼代增殖獲得的叢生芽用于下一步驟的壯苗生根培養(yǎng)或者用于下一周期的繼代 增殖培養(yǎng)；整個(gè)培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)溫度為22±2°C，光照度為1300-25001x，光照8-10小時(shí) /天；所述增殖培養(yǎng)基由以下組分按照以下配比組成：MS或N6基本培養(yǎng)基+1. 0-2. 5mg/L 6-BA+0.2-0.5mg/LNAA+l-2g/LLH+20-30g/L白糖或蔗糖+6-7g/L瓊脂或卡拉膠，pH值為 5. 2-5. 6 ；
[0013] 誘導(dǎo)培養(yǎng)后，莖段或頂芽在所述增殖培養(yǎng)基上能形成叢生芽，叢生芽在新的增殖 培養(yǎng)基上能進(jìn)行繼代增殖，增殖系數(shù)可達(dá)3. 5-5. 4倍，70-90天即可進(jìn)行再次繼代，周期短， 繁殖速度快；
[0014] (5)壯苗生根培養(yǎng)：將步驟（4)中獲得的叢生芽切割成單株，接種到壯苗生根 培養(yǎng)基上進(jìn)行80-100天的壯苗生根培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22±2°C，光照度2000-25001x，光 照8-10小時(shí)/天；所述壯苗生根培養(yǎng)基由以下組分按照以下配比組成：MS+1. 0-2.Omg/L NAA+100-280g/L香蕉 +0-80g/L馬鈴薯 +1. 0-3.Og/L活性炭 +15-20g/L白糖或蔗糖 +6-8g/ L瓊脂或卡拉膠，pH值為5. 2-5. 6 ;
[0015] 壯苗生根培養(yǎng)80-100天后形成株高3cm以上的完整植株；
[0016] (6)煉苗移栽：將完成步驟（5)的壯苗生根培養(yǎng)獲得的高度大于3cm且具有2條 以上根的無菌大苗接著進(jìn)行煉苗移栽。
[0017] 本發(fā)明所提供的一種浙江金線蘭種子組織培養(yǎng)與快速育苗方法對比現(xiàn)有技術(shù)有 如下優(yōu)點(diǎn)：
[0018] 1)本發(fā)明利用成熟或近成熟的蒴果進(jìn)行無菌播種獲得大量無菌實(shí)生苗，再將實(shí)生 苗的頂芽或莖段增殖叢生芽并通過壯苗和生根培養(yǎng)獲得完整植株，有助于解決種苗繁育問 題，還能有效保護(hù)和搶救野生資源。
[0019] 2)本發(fā)明應(yīng)用組織培養(yǎng)方法，以浙江金線蘭種子為外植體快速繁殖種苗，具有出 苗快、種苗健壯、生長良好、沒有無效苗等優(yōu)點(diǎn)，不僅大大降低了生產(chǎn)成本，而且種苗移栽成 活率高達(dá)96%以上。
[0020] 3)本發(fā)明操作簡便，具有投入少、產(chǎn)出高的特點(diǎn)，生產(chǎn)周期短，僅6-7個(gè)月，可操作 性強(qiáng)，應(yīng)用價(jià)值高，適于工廠化生產(chǎn)。
[0021] 4)本發(fā)明利用種子進(jìn)行有性繁殖，能夠在一定時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)量巨大的可供遺傳利 用的種苗，還能經(jīng)過篩選獲得大量的性狀優(yōu)良的植株。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】和具體實(shí)施例來對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
[0023](一）【具體實(shí)施方式】如下：
[0024] -種浙江金線蘭種子組織培養(yǎng)與快速育苗方法，其特征在于：所述的方法包括以 下依序進(jìn)彳丁的步驟：
[0025] (1)果實(shí)的選擇：于浙江金線蘭開花期，選擇優(yōu)良的浙江金線蘭株系進(jìn)行人工同 株或異株授粉，授粉70-80天后，選擇發(fā)育基本成熟、且外表顏色接近黃色或黃褐色的果實(shí) 用于組織培養(yǎng)；或者野外采集的野生浙江金線蘭植株上的蒴果，選擇果實(shí)外表顏色近黃色 或黃褐色、且未開裂者用于組織培養(yǎng)；
[0026] (2)無菌播種與萌發(fā)培養(yǎng)：將步驟⑴中選取的果實(shí)用質(zhì)量百分比濃度為70-85% 的酒精浸泡30-45秒后，置于質(zhì)量百分比濃度為0. 08-0. 15%升汞溶液中消毒8-15分鐘， 用無菌水沖