一種誘導(dǎo)金鐵鎖愈傷組織產(chǎn)生花青素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及金鐵鎖愈傷組織誘導(dǎo)和金鐵鎖愈傷 組織花青素形成的調(diào)控方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 金鐵鎖（/??蕭(asi/efle W. C. Wu et C. Y. Wu)又名獨(dú)定子、娛蟻七等， 屬于石竹科金鐵鎖屬多年生草本，主要分布于我國貴州、云南、四川、西藏等地，生長在海拔 2000~3800 m的礫石山坡或石灰質(zhì)巖石縫中。金鐵鎖是一種瀕危藥用植物，其根入藥，具 有散淤止痛、排毒止血等功能，1991年作為稀有瀕危物種被列入《中國植物紅皮書》第一冊(cè)， 1999年作為國家二級(jí)保護(hù)植物被列入《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄(第一批)》中。金鐵鎖 在云南民間藥用歷史較長，利用現(xiàn)代科技手段研制的中成藥制劑有百靈草散、跌打止痛膏、 金骨蓮膠囊等。金鐵鎖植株莖多呈紫綠色，開花期間花瓣為紫紅色，即金鐵鎖植株的細(xì)胞有 合成天然色素的能力，因此，在利用其根的同時(shí)，綜合開發(fā)該物種的天然色素亦前景廣闊。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)金鐵鎖愈傷組織產(chǎn)生花青素的方法，豐富了人們所需的天 然植物色素的種類，也為金鐵鎖這一珍稀資源的綜合開發(fā)利用開辟了新途徑。
[0004]本發(fā)明采用的技術(shù)方案：先以金鐵鎖無菌苗為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，再通過 對(duì)植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度和光照強(qiáng)度的調(diào)節(jié)以優(yōu)化愈傷組織花青素形成的條件。
[0005] 具體步驟如下： 步驟1 :采用金鐵鎖無菌苗作為外植體，置于MS培養(yǎng)基、加6-BA 0~3. 0 mg/L和IAA 0~2. 0 mg/L進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)獲得愈傷組織； 步驟2 :選擇疏松或致密的愈傷組織，以MS為基本培養(yǎng)基，加6-BA 0~2. 5 mg/L和NAA 0~2. 5 mg/L在光照0~2500 Ix條件下進(jìn)行培養(yǎng)，7 d后白色愈傷組織上誘導(dǎo)紅色花青 素生成； 步驟3 :挑選步驟2得到的含有花青素的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以MS為基本培養(yǎng)基， 外加 6-BA I. 0 mg/L+NAA 0? 5 mg/L+KT 0? 3 mg/L+2, 4-D 0 ~2. 0 mg/L 培養(yǎng)，30 d 后花青 素明顯積累； 步驟4 :選擇相同培養(yǎng)條件下色素積累的愈傷組織，以鹽酸-甲醇為提取劑，在不同 的料液比、不同提取時(shí)間及不同提取溫度下優(yōu)化色素提取條件，并以紫外分光光度計(jì)在 200~650 nm下掃描。
[0006] 其中，步驟1中的培養(yǎng)條件為：溫度24~26°C、光照強(qiáng)度1000 lx、光照時(shí)間12 h/ d〇
[0007] 步驟3的培養(yǎng)條件是：溫度24~26 °C，光照強(qiáng)度2000 lx、光照時(shí)間12 h/d。
[0008] 步驟4中鹽酸-甲醇提取劑的濃度為1%~3%。
[0009] 步驟4中不同的料液比、不同提取時(shí)間及不同提取溫度是指料液比在1:10~1:50 之間、提取時(shí)間在5~20 h之間、提取溫度在4~50 °C之間。
[0010] 作為優(yōu)選方案，步驟1中誘導(dǎo)愈傷組織的外植體為金鐵鎖無菌苗的芽，誘導(dǎo)愈傷 組織的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)為6-BA 2. 5 mg/L+IAA 0. 5 mg/L，培養(yǎng)溫度為25 °C，光照強(qiáng)度為 2000 lx，光照時(shí)間為12 h/d。
[0011] 作為優(yōu)選方案，步驟2中選取質(zhì)地疏松的愈傷組織，誘導(dǎo)花青素的植物生長調(diào)節(jié) 物質(zhì)為 6-BA 0? 5 mg/L+NAA I. 5 mg/L。
[0012] 作為優(yōu)選方案，步驟2中誘導(dǎo)花青素產(chǎn)生的光照強(qiáng)度為2000 lx，光照時(shí)間為12 h/d〇
[0013] 作為優(yōu)選方案，步驟3中愈傷組織積累花青素的條件為MS基本培養(yǎng)基外加6-BA I. 0 mg/L、NAA 0? 5 mg/L 和 KT 0? 3 mg/L。
[0014] 作為優(yōu)選方案，步驟4中金鐵鎖愈傷組織花青素最大吸收峰在n=530nm，色素含 量表示為A530=Abs ;以3%的鹽酸-甲醇為提取劑、料液比為1:10、提取時(shí)間20 h、提取溫 度30°C時(shí)提取。
[0015] 本發(fā)明達(dá)到的有益效果： (1)由于人工合成色素多對(duì)人體健康存在一定的危害性，而天然色素?zé)o毒副作用。本發(fā) 明以金鐵鎖無菌苗的芽為外植體，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織并繼代增殖，再選擇適宜的植物生長 調(diào)節(jié)物質(zhì)和光照條件，從而誘導(dǎo)其愈傷組織積累花青素。
[0016] (2)本發(fā)明獲得的花青素是金鐵鎖愈傷組織細(xì)胞生物合成的天然色素，為黃酮類 物質(zhì)，具有一定的生理活性，可用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)，以滿足人們對(duì)天然色素的需求。
【附圖說明】
[0017] 圖1為不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組合（6-BA、NAA)對(duì)金鐵鎖愈傷組織花青素誘導(dǎo)的 影響； 圖2為不同光照強(qiáng)度和2, 4-D對(duì)金鐵鎖愈傷組織花青素積累的影響； 圖3為金鐵鎖愈傷組織花青素的紫外吸收光譜。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0019] 本發(fā)明的技術(shù)方案具體步驟如下： (1) 外植體選擇與愈傷組織的誘導(dǎo)：采用金鐵鎖無菌苗(莖、葉和芽）作為外植體，置于 MS培養(yǎng)基、加6-BA 0~3. 0 mg/L和IAA 0~2. 0 mg/L在溫度（25 ± I) °C、光照強(qiáng)度 1000 Ix和光照時(shí)間12 h/d的條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)獲得愈傷組織； (2) 花青素的誘導(dǎo)與積累：選擇不同質(zhì)地(疏松或致密）的愈傷組織，以MS為基本培養(yǎng) 基，加6-BA 0~2. 5 mg/L和NAA 0~2. 5 mg/L，在光照0~2500 Ix下培養(yǎng)，7 d后白色 愈傷組織上誘導(dǎo)紅色花青素生成；挑選少量含有花青素的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以MS為 基本培養(yǎng)基，外加 6-BA LO mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.3 mg/L+2,4-D 0 ~2.0 mg/L 在溫 度（25 ± I) °C，光照強(qiáng)度2000 Ix和光照時(shí)間12 h/d的條件下培養(yǎng)，30 d后花青素明顯 積累。
[0020](3)金鐵鎖愈傷組織色素的提?。哼x擇相同培養(yǎng)條件下色素積累的愈傷組織(用濾 紙吸干愈傷表面水分)，以1%~3%鹽酸-甲醇為提取劑，在不同的料液比（1:10~1:50)、 不同提取時(shí)間（5~20 h)及不同提取溫度（4~50 °C)下優(yōu)化色素提取條件，并以紫外分 光光度計(jì)在200~650 nm下掃描。
[0021] 優(yōu)選的，誘導(dǎo)愈傷組織的外植體為芽，愈傷組織的誘導(dǎo)植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)為6-BA 2.5 mg/L+IAA 0.5 mg/L，培養(yǎng)溫度為（25 ± I) °C，光照強(qiáng)度為2000 lx，光照時(shí)間為12 h/d〇
[0022] 更優(yōu)選的，選取的愈傷組織要求質(zhì)地疏松，誘導(dǎo)花青素產(chǎn)生所用的植物生長調(diào)節(jié) 物質(zhì)為6-BA 0. 5 mg/L+NAA I. 5 mg/L。如表1及圖1所示。圖1中，A為白色愈傷（6-BA 2.0 mg/L+NAA LO mg/L);B 為紫紅色愈傷（6-BA 0.5 mg/L+NAA LO mg/L);C 為紫色愈傷 (6-BA 0.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L) 更優(yōu)選的，誘導(dǎo)花青素產(chǎn)生的光照條件為2000 lx(如表2和圖2所示)。更優(yōu)選的，愈 傷組織花青素積累的條件為在不添加2, 4-D的情況下(如表2和圖2所示)，外加6-BA I. 0 mg/L、NAA 0? 5 mg/L 和 KT 0? 3 mg/L。
[0023]圖 2 中，D、E、F、G、H、I 分別表示不同光照強(qiáng)度（500 lx、1000 lx、1500 lx、2000 lx、2500 lx)對(duì)花青素積累的影響程度，其中光照強(qiáng)度為2000 lx時(shí)（H)色素積累效果最 好；J、K表示2, 4-D添加量對(duì)色素積累的影響，其中不添加2, 4-D時(shí)（K)色素積累效果明顯 另外，從圖3可知，金鐵鎖色素最大吸收峰在n=530 nm處，色素含量可表示為A53tl=Abs (