殺蟲蛋白的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種殺蟲蛋白的用途，特別是涉及一種Vip3A蛋白質(zhì)通過(guò)在植物中表 達(dá)來(lái)控制高粱條螟為害植物的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 高粱條螟Chilo sacchariphagus屬鱗翅目，螟蛾科。又名甘鹿條螟，俗稱高粱鉆心 蟲。主要分布在中國(guó)、印度、印度尼西亞和馬來(lái)西亞等東亞、南亞及印度洋地區(qū)。國(guó)內(nèi)分布 極廣，東北、華北、華東和華南大部份地區(qū)都有發(fā)生?？蔀楹τ衩住⒏吡?、粟、麻、甘蔗等作物。 在北方旱糧地區(qū)，主要為害玉米、高粱和粟等作物，并常和玉米螟混合發(fā)生，造成枯心苗；同 時(shí)也是南方甘蔗上的主要害蟲。
[0003] 玉米是中國(guó)重要的糧食作物，隨著全球溫室效應(yīng)的加強(qiáng)，近兩年溫度不斷上升，蟲 害發(fā)生種類及數(shù)量都有所提高。高粱條螟以幼蟲在初期為害心葉，后期則可蛀食莖桿、葉 鞘，阻礙養(yǎng)分輸送，使莖桿易受風(fēng)折斷。對(duì)產(chǎn)量有嚴(yán)重影響，通常損失可達(dá)10% -40%。為 了防治高粱條螟，人們通常采用的主要防治方法有：農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和物理防治。
[0004] 農(nóng)業(yè)防治是把整個(gè)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)多因素的綜合協(xié)調(diào)管理，調(diào)控作物、害蟲、環(huán)境因 素、創(chuàng)造一個(gè)有利于作物生長(zhǎng)而不利于高粱條螟發(fā)生的農(nóng)田生態(tài)環(huán)境。在越冬幼蟲化蛹與 羽化之前，將高粱或玉米秸桿處理完畢，以減少越冬蟲源。秸桿處理可采用粉碎、燒毀、慪 肥、鍘碎、泥封等不同方法。因農(nóng)業(yè)防治必須服從作物布局和增產(chǎn)的要求，應(yīng)用有一定的局 限性，不能作為應(yīng)急措施，在高粱條螟爆發(fā)時(shí)就顯得無(wú)能為力。
[0005] 化學(xué)防治即農(nóng)藥防治，是利用化學(xué)殺蟲劑來(lái)殺滅害蟲，是高粱條螟綜合治理的重 要組成部分，它具有快速、方便、簡(jiǎn)便和高經(jīng)濟(jì)效益的特點(diǎn)，特別是高粱條螟大發(fā)生的情況 下，是必不可少的應(yīng)急措施。高粱條螟作為蛀莖害蟲，對(duì)其的防治時(shí)期把握非常重要，用藥 最佳時(shí)期是卵孵盛期至幼蟲蛀莖之前，否則高齡幼蟲蛀入莖桿之后，將很難達(dá)到防治的目 的。目前化學(xué)防治方法主要是藥液噴霧和施撒毒土。但化學(xué)防治也有其局限性，如使用不 當(dāng)往往會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物發(fā)生藥害、害蟲產(chǎn)生抗藥性，以及殺傷天敵、污染環(huán)境，使農(nóng)田生態(tài)系 統(tǒng)遭到破壞和農(nóng)藥殘留對(duì)人、畜的安全構(gòu)成威脅等不良后果。
[0006] 物理防治主要根據(jù)害蟲對(duì)環(huán)境條件中各種物理因素的反應(yīng)，利用各種物理因素如 光、電、色、溫濕度等以及機(jī)械設(shè)備進(jìn)行誘殺、輻射不育等方法來(lái)防治害蟲。目前應(yīng)用最廣 泛的是頻振式殺蟲燈誘殺，它利用害蟲成蟲的趨光性，近距離用光，遠(yuǎn)距離用波，引誘害蟲 靠近，對(duì)高粱條螟成蟲的防治具有一定的效果；但是頻振式殺蟲燈需要每天及時(shí)清理高壓 電網(wǎng)上的污垢，否則會(huì)影響殺蟲效果；并且在雷雨天不能開燈，在操作上還有電擊傷人的危 險(xiǎn)；此外安裝燈的一次性投入較大。
[0007] 為了解決農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和物理防治在實(shí)際應(yīng)用中的局限性，科學(xué)家們經(jīng)過(guò) 研宄發(fā)現(xiàn)將來(lái)自于蘇云金芽孢桿菌的編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉(zhuǎn)入植物中，可獲得一些抗 蟲轉(zhuǎn)基因植物以防治植物蟲害。Vip3A殺蟲蛋白是眾多殺蟲蛋白中的一種，是由蠟狀芽孢桿 菌產(chǎn)生的特異性蛋白質(zhì)。
[0008] Vip3A蛋白通過(guò)激發(fā)凋亡類型的細(xì)胞程序性死亡對(duì)敏感性昆蟲具有毒殺效應(yīng)。 Vip3A蛋白在昆蟲腸道內(nèi)被水解為4種主要蛋白產(chǎn)物，其中只有一種蛋白水解產(chǎn)物（33KD) 為Vip3A蛋白的毒性核心結(jié)構(gòu)。Vip3A蛋白結(jié)合敏感昆蟲的中腸上皮細(xì)胞，啟動(dòng)細(xì)胞程序性 死亡，造成中腸上皮細(xì)胞的溶解導(dǎo)致昆蟲死亡。對(duì)非敏感昆蟲不產(chǎn)生任何病癥，不會(huì)導(dǎo)致中 腸上皮細(xì)胞的凋亡和溶解。
[0009] 已證明轉(zhuǎn)Vip3A基因的植株可以抵抗小地老虎、草地貪夜蛾、大螟、玉米夜蛾等鱗 翅目Lepidoptera害蟲的侵害，然而，至今尚無(wú)關(guān)于通過(guò)產(chǎn)生表達(dá)Vip3A蛋白的轉(zhuǎn)基因植株 來(lái)控制高粱條螟對(duì)植物危害的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供一種殺蟲蛋白的用途，首次提供了通過(guò)產(chǎn)生表達(dá)Vip3A蛋白 的轉(zhuǎn)基因植株來(lái)控制高粱條螟對(duì)植物危害的方法，且有效克服現(xiàn)有技術(shù)農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防 治和物理防治等技術(shù)缺陷。
[0011] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種控制高粱條螟害蟲的方法，包括將高粱條螟 害蟲至少與Vip3A蛋白接觸。
[0012] 進(jìn)一步地，所述Vip3A蛋白存在于至少產(chǎn)生所述Vip3A蛋白的宿主細(xì)胞中，所述高 粱條螟害蟲通過(guò)攝食所述宿主細(xì)胞至少與所述Vip3A蛋白接觸。
[0013] 更進(jìn)一步地，所述Vip3A蛋白存在于至少產(chǎn)生所述Vip3A蛋白的細(xì)菌或轉(zhuǎn)基因植 物中，所述高粱條螟害蟲通過(guò)攝食所述細(xì)菌或所述轉(zhuǎn)基因植物的組織至少與所述Vip3A蛋 白接觸，接觸后所述高粱條螟害蟲生長(zhǎng)受到抑制和/或?qū)е滤劳?，以?shí)現(xiàn)對(duì)高粱條螟危害 植物的控制。
[0014] 在上述技術(shù)方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物可以處于任意生育期；所述轉(zhuǎn)基因植物的組 織為根、葉片、莖桿、果實(shí)、雄穗、雌穗、花蕾、花藥或花絲；所述對(duì)高粱條螟危害植物的控制 不因種植地點(diǎn)和/或種植時(shí)間的改變而改變。
[0015] 所述植物來(lái)自玉米、甘蔗、高粱、粟、麻或薏米。
[0016] 所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述Vip3A蛋白的多核苷酸的植物。
[0017] 優(yōu)選地，所述Vip3A蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3或SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列。所述Vip3A蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4或 SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。
[0018] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述植物還可以包括至少一種不同于編碼所述Vip3A 蛋白的核苷酸的第二種核苷酸。
[0019] 進(jìn)一步地，所述第二種核苷酸編碼Cry類殺蟲蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶 抑制劑、凝集素、a-淀粉酶或過(guò)氧化物酶。
[0020] 優(yōu)選地，所述第二種核苷酸編碼CrylAb蛋白。
[0021] 進(jìn)一步地，所述CrylAb蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 11所 示的氨基酸序列。
[0022] 更進(jìn)一步地，所述第二種核苷酸具有SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 12所示的核苷酸 序列。
[0023] 可選擇地，所述第二種核苷酸為抑制目標(biāo)昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
[0024] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種Vip3A蛋白質(zhì)控制高粱條螟害蟲的用途。
[0025] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生控制高粱條螟害蟲的植物的方法，包 括向所述植物的基因組中引入編碼Vip3A蛋白的多核苷酸序列。
[0026] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生控制高粱條螟害蟲的植物繁殖體的方 法，包括將由所述方法獲得的第一植株與第二植株雜交，和/或取下由所述方法獲得的植 株上具有繁殖能力的組織進(jìn)行培養(yǎng)，從而產(chǎn)生含有編碼Vip3A蛋白的多核苷酸序列的植物 繁殖體。
[0027] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)控制高粱條螟害蟲的植物的方法，包 括：
[0028] 種植至少一個(gè)植物繁殖體，所述植物繁殖體的基因組中包括編碼Vip3A蛋白的多 核苷酸序列；
[0029] 使所述植物繁殖體長(zhǎng)成植株；
[0030] 使所述植株在人工接種高粱條螟害蟲和/或高粱條螟害蟲自然發(fā)生危害的條件 下生長(zhǎng)，收獲與其他不具有編碼Vip3A蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有減弱的植物損 傷和/或具有增加的植物產(chǎn)量的植株。
[0031] 本發(fā)明中所述的"植物繁殖體"包括但不限于植物有性繁殖體和植物無(wú)性繁殖體。 所述植物有性繁殖體包括但不限于植物種子；所述植物無(wú)性繁殖體是指植物體的營(yíng)養(yǎng)器官 或某種特殊組織，其可以在離體條件下產(chǎn)生新植株；所述營(yíng)養(yǎng)器官或某種特殊組織包括但 不限于根、莖和葉，例如：以根為無(wú)性繁殖體的植物包括草莓和甘薯等；以莖為無(wú)性繁殖體 的植物包括甘蔗和馬鈴薯（塊莖）等；以葉為無(wú)性繁殖體的植物包括蘆薈和秋海棠等。
[0032] 本發(fā)明中所述的"接觸"，是指昆蟲和/或害蟲觸碰、停留和/或攝食植物、植物器 官、植物組織或植物細(xì)胞，所述植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞既可以是其體內(nèi)表達(dá) 殺蟲蛋白，還可以是所述植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的表面具有殺蟲蛋白和/或 具有產(chǎn)生殺蟲蛋白的微生物。
[0033] 本發(fā)明術(shù)語(yǔ)"控制"和/或"防治"是指高粱條螟害蟲至少與Vip3A蛋白接觸，接 觸后高粱條螟害蟲生長(zhǎng)受到抑制和/或?qū)е滤劳?。進(jìn)一步地，高粱條螟害蟲通過(guò)攝食植物 組織至少與Vip3A蛋白接觸，接觸后全部或部分高粱條螟害蟲生長(zhǎng)受到抑制和/或?qū)е滤?亡。抑制是指亞致死，即尚未致死但能引起生長(zhǎng)發(fā)育、行為、生理、生化和組織等方面的某種 效應(yīng)，如生長(zhǎng)發(fā)育緩慢和/或停止。同時(shí)，植物在形態(tài)上應(yīng)是正常的，且可在常規(guī)方法下培 養(yǎng)以用于產(chǎn)物的消耗和/或生成。此外，含有編碼Vip3A蛋白的多核苷酸序列的控制高粱 條螟害蟲的植物和/或植物繁殖體，在人工接種高粱條螟害蟲和/或高粱條螟害蟲自然發(fā) 生危害的條件下，與非轉(zhuǎn)基因的野生型植株相比具有減弱的植物損傷，具體表現(xiàn)包括但不 限于改善的莖桿抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增產(chǎn)等。Vip3A蛋白對(duì)高粱條螟的"控 制"和/或"防治"作用是可以獨(dú)立存在的，不因其它可"控制"和/或"防治"高粱條螟害蟲 的物質(zhì)的存在而減弱和/或消失。具體地，轉(zhuǎn)基因植物（含有編碼Vip3A蛋白的多核苷酸 序列）的任何組織同時(shí)和/或不同步地，存在和/或產(chǎn)生，Vip3A蛋白和/或可控制高粱條 螟害蟲的另一種物質(zhì)，則所述另一種物質(zhì)的存在既不影響Vip3A蛋白對(duì)高粱條螟的"控制" 和/或"防治"作用，也不能導(dǎo)致所述"控制"和/或"防治"作用完全和/或部分由所述另 一種物質(zhì)實(shí)現(xiàn)，而與Vip3A蛋白無(wú)關(guān)。通常情況下，在大田，高粱條螟害蟲攝食植物組織的 過(guò)程短暫且很難用肉眼觀察到，因此，在人工接種高粱條螟害蟲和/或高粱條螟害蟲自然 發(fā)生危害的條件下，如轉(zhuǎn)基因植物（含有編碼Vip3A蛋白的多核苷酸序列）的任何組織存 在死亡的高粱條螟害蟲、和/或在其上停留生長(zhǎng)受到抑制的高粱條螟害蟲、和/或與非轉(zhuǎn)基 因的野生型植株相比具有減弱的植物損傷，即為實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的方法和/或用途，即通過(guò) 高粱條螟害蟲至少與Vip3A蛋白接觸以實(shí)現(xiàn)控制高粱條螟害蟲的方法和/或用途。
[0034] 在本發(fā)明中，Vip3A蛋白在一種轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)可以伴隨著一個(gè)或多個(gè)Cry 類殺蟲蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲蛋白質(zhì)的表達(dá)。這種超過(guò)一種的殺蟲毒素在同一株轉(zhuǎn)基因 植物中共同表達(dá)可以通過(guò)遺傳工程使植物包含并表達(dá)所需的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外，一種植物 (第1親本）可以通過(guò)遺傳工程操作表達(dá)Vip3A蛋白質(zhì)，第二種植物（第2親本）可以通過(guò) 遺傳工程操作表達(dá)Cry類殺蟲蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲蛋白質(zhì)。通過(guò)第1親本和第2親本 雜交獲得表達(dá)引入第1親本和第2親本的所有基因的后代植物。
[0035] RNA干擾（RNA interference，RNAi)是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈 RNA (double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。因此在本 發(fā)明中可以使用RNAi技術(shù)特異性剔除或關(guān)閉目標(biāo)昆蟲害蟲中特定基因的表達(dá)。
[0036] 在分類系統(tǒng)上，一般主要根據(jù)成蟲翅的脈序、連鎖方式和觸角的類型等形態(tài)特征， 將鱗翅目分為亞目、總科、科等，而螟蛾科是鱗翅目中種類最多的科之一，全世界已發(fā)現(xiàn)1 萬(wàn)種以上，僅中國(guó)記錄就有幾千條。大部分螟蛾科昆蟲是農(nóng)作物的害蟲，多數(shù)以蛀莖形式為 害，如玉米螟和二化螟。盡管高粱條螟與玉米螟、二化螟等同屬于鱗翅目螟蛾科，除了在分 類標(biāo)準(zhǔn)上存在相似性，在其它形態(tài)結(jié)構(gòu)上則存在極大差異；就好比植物中的草莓與蘋果一 樣（同屬于薔薇目薔薇科），它們都有花兩性，輻射對(duì)稱，花瓣5片等特征，但是其果實(shí)以及 植株形態(tài)卻是千差萬(wàn)別。高粱條螟不管是從幼蟲形態(tài)還是成蟲形態(tài)上來(lái)看，都具有其獨(dú)特 的特征。如背部縱線，在農(nóng)民中就有流傳著"高粱玉米谷，背線三四五"，表示同屬于螟蛾科 的高粱條螟、玉米螟和粟灰螟在背線數(shù)量上就存在明顯的差異。而背部縱線下就是背血管， 背血管是昆蟲循環(huán)器官的重要組成部分，內(nèi)里充滿了有昆蟲"血液"之稱的血淋巴。因此體 表形態(tài)上看似細(xì)微的背線數(shù)量的差異，體現(xiàn)的卻是背血管的差異，是昆蟲循環(huán)系統(tǒng)上的差 異。
[0037] 同屬螟蛾科的昆蟲不僅在形態(tài)特征上存在較大差異，同時(shí)在取食習(xí)性上，也存在 差異。例如同為螟蛾科的三化螟僅為害水稻，極少為害其它禾本科作物。而高粱條螟未見(jiàn) 有報(bào)道對(duì)水稻造成為害，更多的是對(duì)南方的甘蔗，北方的玉米、高粱和谷子造成為害。取食 習(xí)性的不同，也暗示著體內(nèi)消化系統(tǒng)所產(chǎn)生的酶和受體蛋白不同。而消化道中產(chǎn)生的酶 是Bt基因起作用的